Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà shan tuyết Hà Giang

Trên thế giới, đã có rất nhiều nghiên cứu về kombucha như: các nghiên cứu về thành phần các chất, vitamin có trong kombucha; tác dụng của kombucha trong việc bảo vệ cơ thể con người trán

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.Lý do chọn đề tài 10

2.Mục đích nghiên cứu 11

3.Nhiệm vụ nghiên cứu 11

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 11

5 Những đóng góp mới của của đề tài 11

6 Phương pháp nghiên cứu 12

NỘI DUNG 13

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13

1.1 Giới thiệu về kombucha 13

1.1.1 Nguồn gốc 13

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo 13

1.1.3 Hệ vi sinh vật trong kombucha 14

1.1.3.1 Acetobacter 14

1.1.3.2 Nấm men 15

1.1.3.3 Giống vi khuẩn lên men lactic 18

1.2 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha 19

1.3 Giới thiệu về trà lên men kombucha 23

1.3.1 Thành phần của trà đường lên men 23

1.3.2 Công dụng của trà đường lên men 23

1.3.3 Một số lưu ý khi sử dụng 25

1.4 Nguyên liệu 25

1.4.1 Đặc điểm của trà 25

1.4.1.1 Nguồn gốc và đặc tính thực vật 25

1.4.1.2 Phương pháp sản xuất trà xanh 26

1.4.1.3 Đặc điểm của trà xanh 26

1.4.1.4 Chỉ tiêu đánh giá chất lượng trà xanh 27

1.4.2 Đặc điểm của trà Shan truyết Hà Giang 28

1.5 Tình hình nghiên cứu kombucha ở trong và ngoài nước 30

1.5.1 Trên thế giới 30

1.5.2 Ở Việt Nam 32

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Nguyên liệu, thiết bị, hóa chất 35

2.1.1 Nguyên liệu chính 35

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 35

2.1.3 Các loại môi trường 36

2.2 Phương pháp nghiên cứu 36

2.2.1 Phương pháp vi sinh 36

2.2.1.1 Phương pháp phân lập nấm men và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram 36

2.2.1.2 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật 37

2.2.1.3 Bảo quản chủng giống 38

2.2.1.4 Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men 38

2.2.2 Phương pháp hóa sinh 38

2.2.2.1 Xác định đường khử 38

2.2.2.2 Xác định độ cồn 41

2.2.2.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến quá trình lên men kombucha 42

2.2.2.4 Phương pháp xác định khả năng lên men các loại đường 43

2.2.2.5 Phương pháp xác định khả năng hình thành hợp chất loại tinh bột 43

2.2.2.6 Phương pháp nghiên cứu sự sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường cao 44

2.2.3 Phương pháp cảm quan 44

2.2.4 Xử lí số liệu bằng thống kê toán học 46

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 48

3.1 Phân lập và sơ bộ định loại chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang 48

3.1.1 Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men kombucha 48

3.1.2 Định loại sơ bộ chủng nấm men có khả năng lên men kombucha 49

3.1.2.1 Hình thái tế bào học và hình thức sinh sản của các chủng nấm men 49

3.1.2.2 Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa và thạch nghiêng 50

3.1.2.3 Một số đặc tính sinh hóa của các chủng nấm men 51

3.2 Tuyển chọn chủng nấm men lên men kombucha 51

3.2.1 Hoạt lực lên men 52

3.2.2 Chất lượng cảm quan của kombucha được lên men từ 5 chủng 53

3.3 Động thái phát triển của hai chủng nấm men M1, M2 53

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của 2 chủng nấm men M1 và M2 trong môi trường lên men 55

3.4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose 56

3.4.2 Ảnh hưởng của (NH 4 ) 2 SO 4 59

3.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ MgSO 4 7H 2 O 60

3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên men kombucha 61

3.5.1.Ảnh hưởng của hàm lượng men giống 61

3.5.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu 63

3.5.3.Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men tới quá trình lên men 64

3.6 Xây dựng quy trình lên men kombucha 65

3.6.1 Quy trình lên men kombucha quy mô gia đình 65

3.6.2 Xây dựng quy trình lên men kombucha quy mô PTN 66

3.6.3 Kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm 70

3.6.3.1 Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha bằng phương pháp cảm quan 70

3.6.3.2 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 70

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72

1 KẾT LUẬN 72

2 KIẾN NGHỊ 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:

PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung – Người đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh, các thầy cô giáo và các anh chị, sinh viên trong phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Sinh đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất và những kiến thức cơ bản phục vụ cho mục đích nghiên cứu của tôi

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 7 năm 2013

Học viên

Lâm Thị Hồng Liên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật Đây

là kết quả nghiên cứu của riêng tôi Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã công bố

Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, ngày 12 tháng 7 năm 2013

Học viên

Lâm Thị Hồng Liên

DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

TRONG LUẬN VĂN

CLCQ: Chất lượng cảm quan MT: Môi trường

Nxb: Nhà xuất bản

TP: Thành phố

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

ĐHSP: Đại học sư phạm HG: Hà Giang

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các chỉ tiêu cảm quan của trà xanh 27

Bảng 1.2.: Các chỉ tiêu hoá lý của trà xanh 28

Bảng 2.1 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha 45

Bảng 2.2 Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu 46

Bảng 2.3 Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 46

Bảng 3.1 Đặc điểm sinh hóa của các chủng nấm men 51

Bảng 3.2 Hàm lượng khí CO2 giải phóng sau 7 ngày lên men của 5 chủng nấm men 52

Bảng 3.3 Chất lượng cảm quan của các chủng nấm men……… 44

Bảng 3.4 Động thái phát triển của 2 chủng nấm men M1, M2 54

Bảng 3.5 Hàm lượng ethanol, hàm lượng đường khử, độ pH trong dịch lên men của hai chủng M1, M2 46

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men của chủng nấm men M1 56

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men của chủng nấm men M2 57

Bảng 3.8 Khả năng lên men của chủng M1 trên môi trường có hàm lượng (NH4)2SO4 ở các mức khác nhau 59

Bảng 3.9 Khả năng lên men của chủng M2 trên môi trường có hàm lượng (NH4)2SO4 ở các mức khác nhau 60

Bảng 3.10 Khả năng lên men của chủng M1 trên môi trường có hàm lượng MgSO4.7H2O khác nhau 60

Bảng 3.11 Khả năng lên men của chủng M1 trên môi trường có hàm lượng MgSO4.7H2O khác nhau 61

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của tỷ lệ men giống M1 tới quá trình lên men

kombucha……… ……….53 Bảng 3.13 Ảnh hưởng của tỷ lệ men giống tới quá trình lên men

kombucha……… ……….53 Bảng 3.14 Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men kombucha…… 54 Bảng 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men……….55

Bảng 3.16 Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha bằngphương pháp cảm quan ……….70

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Kombucha……… 5

Hình 1.2 Lớp màng kombucha……… 5

Hình 1.3 Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men …….……….20

Hình 1.4 Cây chè cổ thụ Shan tuyết Hà Giang……….…….20

Hình 1.5 Chè cổ thụ Shan tuyết Hà Giang……….……20

Hình 3.1 Tế bào nấm men M1 và M2 trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần……… 40

Hình 3.2 Sinh sản nảy chồi và phân cắt ở nấm men……… …40

Hình 3.3 Ảnh chụp khuẩn lạc chủng nấm men M1, M2 trên môi trường thạch đĩa……….……41

Hình 3.4 Ảnh chụp chủng nấm men M1, M2 trên môi trường thạch nghiêng41 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường sót trong dịch lên men ở các hàm lượng đường khác nhau của chủng nấm men M1, M2………….………… 48

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hàm lượng ethanol sinh ra trong dung dịch lên men ở các hàm lượng đường khác nhau của chủng nấm men M1 và M2…… 49

Hình 3.7 Kết quả thử nghiệm đánh giá sản phẩm kombucha……….62

ở nước ta đang xuất hiện một loại thuốc bổ ở dạng lỏng như trà mà mọi người gọi là trà "thủy sâm" hay còn gọi là kombucha Thực ra đây chính là một loại thức uống có từ rất lâu được gọi tên là "The Remedy for Immortality" nghĩa là

"Phương thuốc Trường sinh" Thủy sâm thực sự chỉ là một loại cái giấm phát triển dưới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng Loại giấm này sinh sôi nhanh trong môi trường nước chè (trà) pha đường

Thành phần trà kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ Vì đây là sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% cồn, acid axetic, acid gluconic, acid glycuronic, acid L-lactic, acid cacbonic, acid caprilic, acid xitric, acid oxalic, acid usnic, nhiều vitamin nhóm B như B1, B2,

B3, B5, B6, B12, vitamin C, acid folic, amino acid và một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc Kombucha còn chứa một lượng nhỏ cafein vì nó được lên men từ các loại trà như trà xanh, trà đen, trà ô long

Ở Việt Nam, trên thị trường đã có bán các loại kombucha dưới dạng đóng chai, đồ hộp, nước giải khát nhập khẩu từ nước ngoài Trên thế giới, đã

có rất nhiều nghiên cứu về kombucha như: các nghiên cứu về thành phần các chất, vitamin có trong kombucha; tác dụng của kombucha trong việc bảo vệ

cơ thể con người tránh các tác hại của hóa chất, tia phóng xạ; các nghiên cứu

về sự cố định đạm của một số chủng vi khuẩn được phân lập từ kombucha

Tuy nhiên, ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về kombucha vẫn chưa đầy

đủ, hoàn chỉnh Đặc biệt là về khu hệ nấm men cũng như những nghiên cứu

về ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên men kombucha

Do đó, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang’’ Trên cơ sở nghiên cứu này có thể lựa

chọn được các chủng nấm men dùng cho lên men kombucha

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Phân lập và sơ bộ định loại một số chủng nấm men có khả năng lên

men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang

3.2 Tuyển chọn chủng nấm men lên men kombucha

3.3 Động thái phát triển của hai chủng nấm men M1, M2

3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển của 2 chủng nấm men M1 và M2 trong môi trường lên men 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên men kombucha

3.6 Xây dựng quy trình sản xuất kombucha

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Các chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Shan tuyết

Hà Giang

5 Những đóng góp mới của của đề tài

Là công trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về kombucha trên đối tượng trà Shan tuyết Hà Giang Đặc biệt, đã tiến hành phân lập, tuyển chọn được chủng nấm men có khả năng lên men kombucha Từ đó, xây dựng quy trình công nghệ lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm

6 Phương pháp nghiên cứu

6.1 Phương pháp vi sinh: gồm có phương pháp phân lập nấm men và quan

sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram; Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật; Bảo quản chủng giống; Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men

6.2 Phương pháp hóa sinh: bao gồm phương pháp Xác định hàm lượng

đường khử; Xác định độ cồn; Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến quá trình lên men kombucha

6.3 Phương pháp cảm quan

6.4 Xử lí số liệu bằng thống kê toán học

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về kombucha

lộ vẻ già nua Bà lấy làm ngạc nhiên và hỏi rõ thì được biết dân chúng ở đây

có thói quen uống kombucha hằng ngày Bà đã xin một ít nấm để làm giống

và mang về Nhật rồi sau đó chia với bạn bè cùng sử dụng Sau nhiều tuần lễ, các bạn của bà đều vô cùng khen ngợi về sự hữu hiệu của loại nấm này Có người bảo rằng họ đã hết bệnh huyết áp cao, vết nhăn trên da đã nhạt mờ, tóc bạc trở lại đen từ từ Do đó trà nấm này được truyền bá khắp cả Nhật Bản [49]

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo

Kombucha là môi trường cộng sinh của vi khuẩn và nấm men Hệ vi

sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng Acetobacter như: Acetobacter xylinum, Acetobacter ketogenum…và nấm men: Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus, Saccharomyces cerevisiae… Ngoài ra còn có thể có các chủng Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium gluconicum…Chính sự có mặt của các chủng

Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha Acetobacter xylinum có khả năng tạo màng hemicellulose khá dày

và chắc, tạo màu xanh với thuốc nhuộm Iod và H2SO4 Kombucha còn được gọi là nấm trà Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đường Bởi vậy, thường được sử dụng để lên men dung dịch trà đường, nên gọi là nấm trà Trong quá trình lên men kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên bề mặt dịch trà và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một kombucha thứ hai (thường gọi là kombucha con) tách biệt với kombucha ban đầu Hình dạng và kích thước của kombucha phụ thuộc vào hình dạng tiết diện của bình chứa [49], [53]

Hình 1.1 Kombucha Hình 1.2 Lớp màng kombucha

1.1.3 Hệ vi sinh vật trong kombucha

1.1.3.1 Acetobacter

Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae, phân bố

rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, giấm, rượu, bia, hoa quả… Có khoảng 20

loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều

loài có ý nghĩa kinh tế

* Đặc điểm chung của chủng Acetobacter

Chủng Acetobacter có dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra

các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra Kích thước thay đổi tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0μm) Có thể di động (có tiên mao đơn hoặc chu mao) hoặc không di động (không có tiên mao) Hiếu khí bắt buộc, chịu

được độ acid cao Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hoá nhiều nguồn

thức ăn cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột Tế bào đứng riêng lẽ hoặc kết thành từng chuỗi Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tùy loại:

Acetobacter xylinum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã Acetobacter có khả năng đồng hoá muối (NH4)+

và phân giải pepton Một số loài đòi hỏi một số acid amin nhất định như acid pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S …ở dạng muối vô cơ, hữu

cơ hoặc hợp chất hữu cơ Do đó bia, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây…là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn

Acetobacter Ngoài khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B1, vitamin B2, oxy hoá sorbit thành đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C) [4], [53]

1.1.3.2 Nấm men

* Hình thái và cấu tạo tế bào

Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ… kích thước rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình: Chiều dài: 9 – 10μm, chiều rộng: 2 – 7μm Hình dạng và kích thước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào nấm men cũng như

nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản như: glucan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin… Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzyme permeaza…Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit, gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó Nhân tế bào và những thành phần cơ quan con khác: không bào, ty lạp thể, riboxom,…[4], [53]

* Sự sinh sản của nấm men

Nấm men có một số hình thức sinh sản: nảy chồi; phân đôi; sinh sản bằng bào tử và hình thành bào tử (tiếp hợp đẳng giao; tiếp hợp dị giao; sinh sản đơn tính) [4]

* Phân loại nấm men

Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi

imporfecti) [4], [53]

Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công

nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; Giống Endomyces; Giống Schizosaccharomyces

Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti): Crytococus (toscula, tornlopsis); Mycoderma; Candida; Geotrichum (đã được xếp vào lớp nấm mốc); Rhodotorula

* Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men

Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon, nitơ, phospho, kali, magiê…[4], [53]

Dinh dưỡng cacbon: nguồn cacbon cung cấp là các loại đường khác nhau: saccharose, maltose, lactose, glucose…Dinh dưỡng oxy, hydro: được cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch Dinh dưỡng nitơ: nấm men không có men ngoại bào để phân giải protein, nên không thể

phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể

là đạm hữu cơ hoặc vô cơ Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, amid, urê Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat…Các vitamin và chất khoáng: Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết có năng lượng lớn Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và enzyme Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê

* Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men

Nấm men hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng mà nó sử dụng chủ yếu được vận chuyển qua thành tế bào theo hai con đường cơ bản

Thẩm thấu bị động: trên thành tế bào nấm men có những lỗ nhỏ, những

lỗ này có tác dụng làm cho chất dinh dưỡng vận chuyển vào trong tế bào từ môi trường bên ngoài nhờ áp suất thẩm thấu, ngược lại chất thải trong quá trình trao đổi cũng được thải ra theo con đường này

Hấp thu chủ động: các thành phần dinh dưỡng không có khả năng xâm

nhập vào tế bào theo con đường thứ nhất thì lập tức có hệ permeaza hoạt hóa Permeaza là một protein hoạt động, chúng liên kết với chất dinh dưỡng tạo thành hợp chất và hợp chất này chui qua thành tế bào trong, tại đây chúng lại tách ra và permeaza lại tiếp tục vận chuyển tiếp [53]

* Quá trình sinh trưởng và phát triển

Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn Trong trường hợp sinh sản theo phương pháp này thì trong dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già Vì rằng tế bào được phân chia thành hai, cứ như vậy tế bào lúc nào cũng ở trạng thái đang phát triển Tế bào chỉ già khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không có khả năng sinh sản nữa Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng phương pháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sống độc lập thì nơi tách đó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo Vết sẹo này sẽ không có khả năng tạo ra chồi mới Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển thành tế bào già theo thời gian [4], [53]

Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như: xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay trên mặt thạch Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩn của mật độ tế bào [4]

Quá trình sinh trưởng của nấm men trong nuôi cấy không liên tục sinh trưởng theo một đường cong gồm 4 pha: pha tiềm phát (pha lag): nấm men thích nghi với môi trường, số lượng tế bào chưa tăng Pha lũy thừa (pha log): nấm men sinh trưởng với tốc độ lớn nhất và không đổi, số lượng tế bào trong quần thể tăng lên rất nhanh Pha cân bằng: số lượng nấm men đạt cực đại và không đổi theo thời gian Pha suy vong: số tế bào trong quần thể giảm dần do

tế bào trong quần thể bị phân hủy ngày càng nhiều, chất dinh dưỡng cạn kiệt

1.1.3.3 Giống vi khuẩn lên men lactic

Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium Đây là những trực

khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện

Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không

có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất Nhiệt

độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 500C Tuy nhiên mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn [53]

1.2 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha

Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá trình lên men dịch trà có thể xảy ra như sau:

* Lên men ethanol (len men rượu):

Hình 1.3 Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính:

Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối

Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu: giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa theo chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic Tiếp theo acid pyruvic sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chất này có thể chuyển hoá thành glyxerol Trong môi trường pH acid, glycerol chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ Ngược lại, trong môi trường

pH kiềm lượng glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men

Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:

C6H12O6 + 2ADP +2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP

Sự chuyển hóa đường thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế bào chất của nấm men Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men trong điều kiện kỵ khí Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men thải vào môi trường lên men Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những hợp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este

Trong quá trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trình

lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic [53]

* Lên men acetic:

Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dưới tác dụng của vi khuẩn [49]

C2H5OH + O2 → CH3CHO (Acetaldehyd) + H2O

CH3CHO + H2O → CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyd)

CH3CH(OH)2 + O2 → CH3COOH + H2O

* Lên men lactic:

Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng Các phân tử ATP được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi hóa lý khác Bản chất: là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ

vi sinh vật Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men đồng hình), acid acetic, ethanol, CO2 (lên men dị hình) trong dịch lên men còn xuất hiện nhiều hợp chất hóa học mới khác, đây là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men Một số hợp chất trong nhóm trên rất dễ bay hơi, chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trường dinh dưỡng

và điều kiện ngoại cảnh, acid lactic thường chiếm 40% lượng đường đã được phân hủy, acid sucxinic 20%, rượu etylic chiếm 10%, acid acetic 10% và các loại khí gần 20% [53]

1.3 Giới thiệu về trà lên men kombucha

Đây là một loại thức uống được lên men trong dung dịch trà đường bởi kombucha Kombucha có thể sử dụng một số loại trà để lên men, nhưng không sử dụng được trà thảo mộc vì kombucha dễ bị hỏng khi lên men trà có nhiều tinh dầu Một số loại trà có chứa dầu thơm, có thể làm cho kombucha bị chết hoặc bị ảnh hưởng xấu Sử dụng các loại trà khác nhau sẽ cho ra những loại thức uống với những hương vị khác nhau [51]

1.3.1 Thành phần của trà đường lên men

Khi các vi sinh vật được nuôi trong môi trường trà dược, cung cấp đủ nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dưỡng căn bản khác như đường Chúng phát triển và biến đổi đường thành gluconic acid, đồng thời sản xuất ra một lượng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi thành acetic acid (tối đa khoảng 3%) tạo cho trà có vị ngọt và có mùi chua của rượu táo lên men Thành phẩm trà sau cùng chứa trung bình 0.5 - 1% alcohol, một lượng nhỏ acid lactic, acid malic, acid acetic, acid malonic và acid oxalic Lượng vitamin B trong thành phẩm khá cao Trà lên men kombucha được xác định là có khả năng kháng khuẩn mạnh Khả năng chống vi khuẩn được quan sát thấy trong các mẫu lên men có chứa tổng số acid là 33g/l (trong đó acid

acetic chiếm 7g/l) Tuy nhiên, Candida albicans không bị ức chế bởi

kombucha Nghiên cứu này cũng chỉ ra khả năng kháng khuẩn của kombucha

là nhờ acid acetic [51], [57]

1.3.2 Công dụng của trà đường lên men

Kombucha đã được Cục quản lí Thực phẩm và Dược phẩm của Mỹ (FDA) chứng nhận là an toàn đối với con người [50] Việc sử dụng rộng rãi thức uống từ kombucha đã được nghiên cứu qua nhiều tài liệu trong suốt thế

kỷ qua Dạng kombucha lỏng và dạng đặc cũng được nghiên cứu và kết quả ban đầu cho thấy trong dịch trà này có chứa chất kháng sinh (diệt khuẩn và

kìm hãm vi khuẩn) có tác dụng chống lại một số vi sinh vật gây bệnh và đã được sử dụng cho mục đích điều trị trong thuốc thú y và thuốc cho người Đầu thế kỷ XX, chủ yếu là những nghiên cứu y học của người Đức, chứng minh kombucha có tác dụng điều tiết đường ruột và có ảnh hưởng tốt đến chức năng nói chung của cơ thể, nhưng cũng dần có hiệu quả cụ thể trong những trường hợp như rối loạn tiêu hóa, táo bón, trĩ, sỏi thận, các vấn đề về túi mật, tiểu đường, cholesterol, cao huyết áp, xơ cứng động mạch, đau đầu, mệt mỏi

…Vào gần giữa thập kỷ, giám đốc “Học viện hóa học” (“Academy of Chemists”) tại Braunschweig ghi nhận rằng kombucha cung cấp năng lượng cho toàn bộ hệ thống các tuyến, dùng cho bệnh gút, thấp khớp, nhọt, xơ cứng động mạch, huyết áp cao và vấn đề về lão hóa, bằng cách làm hài hòa và cân bằng sự trao đổi chất và chuyển các dạng có hại của acid uric và cholesterol thành dạng hòa tan dễ dàng được bài tiết qua thận và ruột Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới thì trà kombucha có nhiều lợi ích đối với con người, thường được tìm mua ở các cửa hàng thực phẩm chức năng Tác dụng của trà kombucha dựa trên các thành phần sau: Acid lactic: cần thiết cho hệ thống tiêu hóa Giúp cho việc lưu thông máu, cân bằng độ acid và kiềm trong cơ thể Trong kombucha, acid này tồn tại ở dạng có lợi nhất (lactic – L) Acid acetic:

là 1 chất bảo quản chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn có hại Acid usnic: là 1 loại chất kháng sinh tự nhiên, giúp chống lại nhiều loại virus Có báo cáo cho rằng môi trường nuôi cấy kombucha có chứa acid usnic nhưng kết quả chưa được xác nhận Acid oxalic là một chất bảo quản hiệu quả và cung cấp năng lượng Acid gluconic tạo ra bởi vi khuẩn, có lợi cho người mắc các bệnh như

nhiễm nấm Candida Acid malic giúp giải độc gan Acid butyric tạo ra bởi

nấm men, bảo vệ màng tế bào, kết hợp với acid gluconic tăng cường thành

ruột chống lại kí sinh trùng, trong đó có nhiễm nấm như Candida Các hợp

chất tanin trong trà: có khả năng kháng khuẩn và phòng chống bệnh ung thư,

làm chậm quá trình lão hóa Caffein trong thành phần của trà có khả năng giảm mệt mỏi, căng thẳng, giảm cảm giác buồn ngủ, cung cấp năng lượng hoạt động cho cơ thể Trà kombucha còn tốt cho da đầu và tóc, kích thích sự phát triển của tóc [50], [51], [53]

1.3.3 Một số lưu ý khi sử dụng

Với những bệnh nhân trong giai đoạn điều trị ung thư do xạ trị hoặc hóa trị, nếu dùng trà cần sự giám sát của thầy thuốc Do trà chứa quá nhiều acid lactic, uống trong một thời gian dài có thể dẫn đến đau khớp, chóng mặt và viêm xoang Trẻ em có thể dùng nhưng liều lượng thay đổi theo tuổi, cân nặng

và quan trọng cần phải được pha loãng với nhiều nước, không nên cho trẻ dưới 2 tuổi uống Phụ nữ có thai không nên dùng vì có đến 1% lượng cồn trong nước trà Không nên uống trong thời gian cho con bú vì gây đau bụng cho trẻ sơ sinh Người tiểu đường chỉ nên dùng trà đang lên men vì hầu hết lượng đường bị biến đổi, tuy nhiên nếu ủ men trà với quá ít đường (dưới 50 gam/lít) thì khó xuất hiện các đặc tính hữu ích của trà kombucha Vì vậy người tiểu đường cũng không nên uống nhiều Trà kombucha gây loãng máu, cần giảm liều và chú ý ngưng một tuần trước khi phẫu thuật; phụ nữ bị rong kinh cũng cần thận trọng và nên ngưng sử dụng trước kinh kỳ tối thiểu một tuần Men trà kombucha có thể bị hư và mất hết tác dụng nếu ủ không đúng quy cách [51], [53], [54]

1.4 Nguyên liệu

1.4.1 Đặc điểm của trà

1.4.1.1 Nguồn gốc và đặc tính thực vật

Cây trà có tên khoa học là Camellia sinensis, có nguồn gốc ở khu vực

Đông Nam Á, nhưng ngày nay nó được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, trong các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới Trà là loài cây xanh lưu niên mọc thành bụi hoặc các cây nhỏ, thông thường được xén tỉa để thấp hơn

2 mét khi được trồng để lấy lá Nó có rễ cái dài, hoa màu trắng ánh vàng, đường kính từ 2,5 – 4cm, với 7 – 8 cánh hoa Hạt của nó có thể ép để lấy dầu

Cả lá và chồi của cây trà đều được sử dụng để sản xuất các sản phẩm trà xanh, trà đen, trà đỏ…Lá trà dài từ 4 – 15cm Lá tươi chứa khoảng 4% caffein Lá non và các lá có xanh lục nhạt được thu hoạch để sản xuất trà khi mặt bên dưới của chúng còn các sợi lông tơ ngắn màu trắng, các lá già có màu lục sẫm… Ở các độ tuổi khác nhau của lá trà tạo ra các sản phẩm trà khác nhau về chất lượng, do thành phần hóa học trong các lá này là khác nhau Thông thường, chỉ có lá chồi và 2 đến 3 lá mới mọc gần thời gian đó được thu hoạch

để chế biến Việc thu hoạch thủ công bằng tay diễn ra đều đặn sau khoảng 1 đến 2 tuần [47]

1.4.1.2 Phương pháp sản xuất trà xanh

Trà xanh được chế biến từ trà tươi, qua các quá trình sau:

Trà tươi → diệt men → vò trà → làm khô → sao lăn gia nhiệt tạo hình

→ phân loại → sao hương → phân loại → sản phẩm

Trong quá trình sản xuất trà xanh, tùy theo từng phương pháp diệt men khác nhau và phương pháp làm khô khác nhau mà chia ra nhiều loại theo tính chất, hương vị đặc biệt của nó [47], [53]

1.4.1.3 Đặc điểm của trà xanh

Ngoại hình: xoăn chặt, màu xanh đen Màu nước xanh tươi hoặc xanh vàng Hương: hương thơm đặc trưng của trà tươi Vị: chát đậm, có hậu vị

Do quá trình diệt men làm đình chỉ hoạt động của enzym, nên các thành phần trong trà xanh rất ít bị biến đổi, hàm lượng polyphenol trích ly trong nước là 30 – 40%, các vitamin và khoáng chất vẫn được giữ lại (đặc biệt là vitamin C) Vì vậy, giá trị dinh dưỡng của trà xanh tương đối cao Trà xanh có khả năng chống ung thư cao, tác dụng tương tự như trà tươi [47]

1.4.1.4 Chỉ tiêu đánh giá chất lượng trà xanh

Bảng 1.1 Các chỉ tiêu cảm quan của trà xanh

Xanh vàng trong sáng

Thơm mạnh tự nhiên thoáng cốm

Đậm dịu có hậu vị ngọt

OP

Màu xanh tự nhiên, cánh trà dài xoăn tương đối đều

Vàng xanh sáng

Thơm tự nhiên tương đối mạnh

Chát đậm, dịu dễ chịu

BP

Màu xanh tự nhiên, mảnh nhỏ hơn trà P tương đối non đều

Vàng tương đối sáng

Thơm tự nhiên,

ít đặc trưng

Chát tương đối dịu, có hậu

BPS

Màu vàng xanh xám, mảnh nhỏ tương đối đều, nhỏ hơn BP

Vàng hơi đậm Thơm vừa

thoáng hăng già

Chát hơi gắt

Chát đậm gắt

Bảng 1.2.: Các chỉ tiêu hoá lý của trà xanh

1 Hàm lượng chất tan, %, không nhỏ hơn

2 Hàm lượng tanin, %, không nhỏ hơn

3 Hàm lượng caffein, %, không nhỏ hơn

4 Hàm lượng chất xơ, %, không nhỏ hơn

5 Hàm lượng tro tổng số, %

6 Hàm lượng tro không tan trong a xít, %, không lớn hơn

7 Hàm lượng tạp chất lạ (không tính tạp chất sắt), %, không lớn hơn

8 Hàm lượng tạp chất sắt, %, không lớn hơn

4 - 8

1 0,3

0,001 7,5

1.4.2 Đặc điểm của trà Shan truyết Hà Giang

Hà Giang là một trong những tỉnh có vùng chè Shan lâu đời nhất nước

ta Ngay từ những năm đầu thế kỷ 20, người Pháp đã tiến hành điều tra chè ở

Hà Giang và đặc biệt chú ý những cây chè cổ thụ vùng cao Đó là thứ chè Shan lá to, búp và lá non có nhiều lông trắng như tuyết, sinh trưởng khoẻ, chịu

ẩm, chịu lạnh, năng suất cao và chất lượng tốt Vì vậy, người ta còn gọi là chè Shan tuyết [56]

Hình 1.4 Cây chè cổ thụ Shan tuyết HG Hình 1.5 Chè cổ thụ Shan tuyết HG

Trong các khu rừng tự nhiên của Hà Giang, cây chè Shan mọc lẫn với các loại cây rừng khác Quá trình du cư đến sinh sống, đồng bào phá rừng làm nương và giữ lại các cây chè, tiếp tục khai thác Có những nơi, đồng bào còn trồng bổ sung bằng hạt, tạo nên những nương chè hỗn giao theo dạng chè rừng Ở Hà Giang, chè Shan phân bố hầu khắp các huyện, trong đó các vùng chè cổ thụ đều có độ cao từ 300-1000m Cho đến nay, một số vùng trong tỉnh

có tính đặc trưng cao cho các tiểu vùng sinh thái có chè shan như: Lũng Phìn- Đồng Văn đại diện cho vùng cao núi đá vôi; Phìn Hồ, Hoàng Su Phì đại diện cho vùng cao núi đất; Tham Vè, Bó Đướt, Vị Xuyên đại diện cho vùng chè cổ nhất Việt Nam Đây cũng chính là những địa phương có sản phẩm chè Shan tuyết thơm ngon nổi tiếng Danh tiếng của chè Shan tuyết Lũng Phìn hay Phìn

Hồ, Cao bồ, Thượng Sơn… không chỉ chinh phục được người tiêu dùng mà cả với những người sành thưởng thức trà Về giống chè Shan Hà Giang có thể chia thành 2 dạng chính đó là chè Shan lá nhỏ, tiêu biểu chè Lũng Phìn với đặc điểm dạng tán hình mâm xôi hoặc dạng nến Chè tán dạng mâm xôi là chè Shan lá nhỏ chiếm tỷ lệ lớn hơn chè tán dạng nến chè shan lá to Dài búp biến động từ 2,3-4,5 cm, trọng lượng búp biến động từ 0,4-1,09g/búp, thuận lợi cho chế biến chè xanh có ngoại hình đẹp Hàm lượng tanin biến động từ

32,25- 37,32%, chất hoà tan 43,24-47,82%, đường khử 2,00-2,95%, cafein 3,05-3,45%, nhất là chất lượng thử nếm cảm quan điểm cao từ 16-18,2 điểm trên nhiều mẫu chè Dạng chè Shan thứ 2 với tiêu biểu vùng chè cổ Bó Đướt, Thượng Sơn, Vị Xuyên Loại chè này đặc biệt nhiều về mức độ lông tuyết ở

cả búp lá 1 và một phần lá 2 Trọng lượng búp chè từ 0,92-1,02g, năng suất 1600-1850g/cây/lứa hái Về thành phần sinh hoá cho thấy tanin biến động từ 27,96-32,98%, chất hoà tan từ 35,81- 40,56%, đường khử từ 1,22-1,90%, cafein từ 2,85-3,00% Ngoài những chỉ tiêu sinh hoá ở mức rất có lợi cho chế biến chè chất lượng cao, chè Shan Hà Giang là nguồn nguyên liệu sạch Bởi

vì, cho đến tận bây giờ, ở các vùng chè Shan lâu đời của Hà Giang, đồng bào vẫn không sử dụng phân hoá học, thuốc bảo vệ thực vật mà chủ yếu là khai thác tự nhiên Người ta thường đốn chè vào vụ Đông, đồng thời với việc phát

cỏ, vun gốc… Sang xuân, vào thời điểm cuối tháng 3, đầu tháng 4, người ta bắt đầu thu hái chè vụ đầu tiên (đây là thời điểm chè cho chất lượng cao nhất) Tiếp tục thu hái vụ chè thứ 2 vào tháng 5 và tháng 6 (là vụ có năng suất cao nhất trong năm) Vụ 3 vào tháng 8 và vụ 4 vào tháng 10, tháng 11 Vì vậy, có thể khẳng định chè Shan Hà Giang là vùng nguyên liệu có giá trị để sản xuất chè an toàn chất lượng cao, đáp ứng yêu cầu của thị trường, phù hợp với xu hướng phát triển nông nghiệp bền vững hiện nay [56]

1.5 Tình hình nghiên cứu kombucha ở trong và ngoài nước

1.5.1 Trên thế giới

Ở trên thế giới đã có rất nhiều các bài báo, các nghiên cứu về kombucha được đăng trên tạp chí quốc tế Đó là các bài báo, các công trình nghiên cứu

về tác dụng của trà kombucha đối với sức khỏe, các nghiên cứu về phân lập hệ

vi sinh vật trong trà kombucha…Đầu tiên phải kể đến các bài báo, các nghiên cứu về tác dụng của kombucha và các nghiên cứu sinh hóa: Bacinskaja (1914)

và cộng sự cho rằng kombucha tốt cho hệ tiêu hóa, điều chỉnh các hoạt động đường ruột, đặc biệt là chống táo bón Đến năm 1927, Madaus đã có những

nghiên cứu và đưa ra kết luận nấm kombucha và các sản phẩm chuyển hóa của nó có tác động tích cực trong việc tái sinh vách tế bào, một phương thuốc tuyệt vời cho bệnh xơ vữa động mạch Vào năm 1987, Veronika Carstens trong nghiên cứu của mình đã chỉ ra: kombucha có tác dụng giải độc cơ thể, cải thiện chức năng hệ miễn dịch [57] Reiss, J (1994) đã tìm hiểu ảnh hưởng của các loại đường khác nhau lên quá trình trao đổi chất của nấm trà [38] Năm 2006, K.H Steinkraus và cộng sự đã có những nghiên cứu về hoạt động kháng sinh của trà nấm kombucha [33] Năm 2007, Velicanski và cộng sự đã cho biết hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha [45] Jayabalan R và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa của nấm trà [30] Cavusoglu K., Gluer P (2010) đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên nhiễm sắc thể gây ra bởi bức xạ gamma trong tế bào bạch huyết ngoại vi của con người trong ống nghiệm [21] Yapar K và cộng sự (2010) đã có những nghiên cứu về tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha đối với chuột bạch tạng bị nhiễm độc do phenol [46] Các nghiên cứu về định danh các chủng vi sinh vật trong kombucha và ứng dụng của các chủng được phân lập từ kombucha cũng đã có từ rất lâu: Từ năm 1928, Hermann đã định

danh hai chủng Bacterium xylinum và B xylinoides và B gluconicum Các

nhà nghiên cứu còn xác định được kombucha là một sự hợp tác cộng sinh giữa

Bacterium xylinum cùng các vi khuẩn khác, với những tế bào nấm men thuộc chủng Saccharomyces, tạo thành một khối như tổ chim Vào năm 1973, List

và cộng sự đã phân lập được Acetobacter ketogenum; Pichia fermentans; Saccharomyces apiculatus; S.ludwigli; B.xylinoides; Schizosaccharomyces pombe từ dịch nuôi cấy kombucha [57] Năm 2001, Kurtzman CP và cộng sự

đã phân lập được một chủng nấm men mới từ kombucha và đặt tên là

Zygosaccharomyces kobuchaensis [34] Vào năm 2006, Dutta D và cộng sự

đã có công trình nghiên cứu về khả năng cố định đạm của chủng Acetobacter

nitrogen nifigens sp.nov được phân lập từ trà kombucha [24] Đến năm 2007,

Dutta D và cộng sự đã có công trình nghiên cứu về khả năng cố định đạm và

sản xuất cellulose của Gluconacetobacter kombucha sp.nov được phân lập từ

kombucha [25] Nguyen, Vu Tuan; Flanagan và cộng sự vào năm 2008 đã có

những nghiên cứu về đặc tính của màng BC bởi chủng Gluconacetobacter xylinus phân lập từ kombucha [37]

Các nghiên cứu về kombucha ở trên thế giới rất phong phú, đa dạng Mặc dù vậy, những nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên quá trình lên men hầu như là rất ít, không đầy đủ

1.5.2 Ở Việt Nam

Hiện nay các nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam còn khá mới mẻ, cho đến nay các công trình nghiên cứu về kombucha có rất ít Theo Vũ Văn Chuyên thì từ năm 1969, ở Bắc Thái (cũ) và Hà Nội, người ta đã phổ biến cho nhau dùng nước thủy hoài sâm để bồi dưỡng và phục hồi sức khỏe, chống lại bệnh tật Từ năm 1994 đến nay, ở tỉnh Bình Định và một số nơi khác ở miền Nam đang lưu hành một loại nước uống có tính chất giải khát đặt tên là “Trà giấm” có tác dụng bồi bổ, tăng cường sức khỏe, làm cho ăn ngon miệng, ngủ yên giấc và chữa được nhiều bệnh, nhất là bệnh huyết áp cao, chứng mất ngủ Theo tác giả guyễn Lân Dũng thì kombucha là một dạng cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn sinh acid gluconic Sản phẩm này có thể tự nhân giống bằng nước chè đường Có lợi cho sức khỏe tương đương như sữa chua Nhiều công

bố đã nói về tác dụng chữa bệnh hiểm nghèo nhưng không có cơ sở khoa học nào chứng thực như vậy Uống chỉ có lợi cho sức khỏe, nhất là cho đường tiêu hóa, không có tác hại gì [54], [57] Theo tác giả Lê Kim Phụng, nguyên giảng viên Trường Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, người đã có một số bài viết về thủy sâm, cho biết: "Hiện nay ở nước ta đang xuất hiện một loại thuốc

bổ ở dạng lỏng như trà mà mọi người gọi là trà "thủy sâm", thực ra đây chính

là một loại thức uống có từ rất lâu được gọi tên là "The Remedy for Immortality", nghĩa là "Phương thuốc Trường sinh" Thủy sâm thực sự chỉ là một loại cái giấm phát triển dưới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng Loại giấm này sinh sôi nhanh trong môi trường nước chè (trà) pha đường Cũng theo tác giả Lê Kim Phụng, lợi ích từ trà thủy sâm rất nhiều "Hầu hết những người uống trà kombucha sẽ thấy khỏe hơn sau một tháng hoặc sớm hơn, rõ rệt nhất là sự gia tăng năng lượng, giúp nam nữ cải thiện chức năng sinh dục và cải thiện làn da, làm tăng tính đàn hồi cho da, giúp tóc mọc dày hơn, gia tăng thị lực, cải thiện vị giác, giải độc cơ thể, nhiều người cho biết những bệnh mạn tính khó chữa như viêm khớp, thấp khớp, chàm, tổ đỉa, vẩy nến, dị ứng, mệt mỏi kinh niên, rối loạn tiêu hóa, huyết áp cao, thiểu năng tuần hoàn não, trầm cảm, thiếu ngủ, cholesterol cao và ngay cả bệnh ung thư cũng thấy thuyên giảm rõ rệt khi họ sử dụng trà kombucha Qua nhiều thế kỷ

và số lượng người sử dụng loại trà này trên thế giới càng ngày càng gia tăng chính là một minh chứng cho thấy trà kombucha đã mang lại các lợi ích rõ ràng" [48] Lương y Đinh Công Bảy, Tổng thư ký Hội Dược liệu thành phố

Hồ Chí Minh, cho biết ông cũng nghe nói đến thủy sâm, tuy nhiên do chưa nghiên cứu nên chưa thể trả lời về công dụng thực sự của loại trà này Theo tác giả Hà Văn Hùng, Phó Viện trưởng Viện Y dược học dân tộc thành phố

Hồ Chí Minh cũng cho rằng cho đến nay Viện cũng chưa có công trình nào nghiên cứu về thủy sâm nên không biết rõ thành phần và công dụng của nó [57] Chuyên gia về dược liệu Phan Đức Bình, Phó chủ tịch Hội Bảo vệ người tiêu dùng thành phố Hồ Chí Minh cho biết, những quảng cáo kiểu trà kombucha có khả năng “cải lão hoàn đồng, tái tạo tóc, ngừa ung thư, trị bách bệnh…” đều không có những bằng chứng xác thực [57] Ở Việt Nam, cũng đã

có một số công trình nghiên cứu về kombucha như: Vào năm 2012, Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cộng sự đã có công trình nghiên cứu “ Nghiên cứu

hệ vi sinh vật của trà kombucha và hiệu quả tác dụng trên một số chỉ tiêu sinh

lý chuột” Kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra hệ vi sinh vật trong kombucha bao gồm: vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic và nấm men, đồng thời khảo sát tác dụng của kombucha trên một số chỉ tiêu sinh lý của chuột như: cân nặng, tổng lượng hồng cầu, tổng lượng bạch cầu, sức khỏe của chuột thí nghiệm qua mô hình bơi kiệt sức Sản phẩm kombucha có tác dụng tăng cường sức khỏe, không gây ảnh hưởng xấu tới các chỉ tiêu sinh lý của chuột [57] Đến năm

2013, Tôn Nữ Liên Hương thuộc khoa Khoa học Tự nhiên, Đại học Cần Thơ

đã có những nghiên cứu về: ảnh hưởng của thời gian chế biến tới một số tính chất và hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha Nghiên cứu của tác giả đã cho biết: tính chất vật lý, hóa học, hàm lượng của các hợp chất hữu cơ có hoạt tính trong Trà giấm kombucha được chế biến từ Trà đóng gói hiệu Lipton và

từ Trà đóng gói hiệu Trà Xanh Một số hoạt tính sinh học của Trà giấm kombucha: tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, độc tính trên tế bào ung thư, theo thời gian lưu mẫu, trên từng loại trà giấm [58] Như vậy, có thể thấy các nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam còn rất ít Chủ yếu là các nghiên cứu về tác dụng của kombucha Các nghiên cứu về chủng nấm men, ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên men hầu như là không có

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị, hóa chất

2.1.1 Nguyên liệu chính

Kombucha; Các chủng nấm men được phân lập từ kombucha

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

* Hóa chất

Ethanol, glucose, fructose, sacrose, lactose

Cao men, pepton, (NH4)2SO4

Box vô trùng (Haraeus)

Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

Micropipet Jinson (Pháp)

Máy đo pH

Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)

Máy cất nước 2 lần (Hamilton – Anh)

Kính hiển vi quang học

Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác

2.1.3 Các loại môi trường

* Môi trường Hanxen (môi trường phân lập)

* Môi trường lên men

Dịch trà Shan tuyết: 200 ml (Tỉ lệ Nước/trà: 200ml/4g)

Glucose: 100 g KH2PO4: 2g

MgSO4.7H2O: 1g (NH4)2SO4:1g Nước: 1000ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Cách làm: môi trường phân lập được khử trùng và được phân bố vào các hộp vô trùng petri để nguội theo phương pháp Pasteur Dịch trà được pha loãng từ 10-1 - 10-10 bằng nước cất Dùng pipet đã vô trùng nhỏ 1, 2 giọt huyền phù với độ pha loãng từ 10-7 - 10-9 lên bề mặt thạch rồi dùng bàn trang

vô trùng dàn đều Gói kín lại và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28-300C trong

ba ngày Sau ba ngày trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc với đặc điểm: to, tròn, lồi, màu trắng, nhẵn, bóng đặc trưng cho nấm men [5], [7]

b Phương pháp nghiên cứu đặc điểm tế bào nấm men

Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế nấm men dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protit đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt

Tiến hành: Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng có khả năng

lên men kombucha làm vết bôi trên lam kính nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đại 1000 lần) [5], [8]

2.2.1.2 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật

a Phương pháp đếm khuẩn lạc

Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa nấm men, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi ở 300C sau 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức [5]

1000 1

100 10 n

Trong đó: N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu

A- Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri

10 -n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy

b Phương pháp xác định tế bào bằng buồng đếm Goriaev

Cấy giống vào môi trường nhân giống ở 280C, lắc đều canh trường dùng pipet chia độ pha loãng canh trường Tuỳ theo mức độ giai đoạn phát triển mà độ pha loãng theo tỷ lệ khác nhau Dùng pipet lấy dịch pha loãng

nhỏ vào một khe hở giữa hai tấm kính, chú ý tránh tạo bọt khí sau đó đặt lá kính lên trên để yên 3 – 5 phút rồi tiến hành soi trên kính hiển vi ở vật kính 10

và 40 đếm số tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau [8]

Cách tính số tế bào trong 1 ml : M = A 50 B

Trong đó: M: Số tế bào trong 1 ml dịch huyền phù

A: Số lượng tế bào trung bình trong 1 ô vuông

B : Hệ số pha loãng

2.2.1.3 Bảo quản chủng giống

Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 30oC Sau đó giữ trong tủ lạnh 4oC dùng cho nghiên cứu tiếp theo Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [5]

2.2.1.4 Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men

Xác định hoạt lực lên men của mẫu nấm men đã được phân lập và tuyển chọn thông qua xác định hàm lượng CO2 thoát ra (g/l dịch lên men) bằng phương pháp cân bình trọng lượng Hàm lượng CO2 thoát ra càng nhiều thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt

Phương pháp cân bình trọng lượng: Dịch được lên men trong các bình

có cùng thể tích 250 ml môi trường, có cùng một lượng tế bào nấm men của các giống khác nhau Sau 24h lên men đem cân trọng lượng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại [17]

2.2.2 Phương pháp hóa sinh

2.2.2.1 Xác định đường khử

* Nguyên tắc

Với một lượng nhất định ferrycyanure K3Fe(CN)6 phản ứng với đường khử, có mặt dung dịch NaOH, sản phẩm thu được là ferrycyanure của đường khử Dựa vào lượng ferrycyanure đã dùng, có thể suy ra lượng đường khử có

mặt trong dung dịch cần xác định Việc chuẩn độ được tiến hành trong môi trường kiềm NaOH, khi đun nóng với chỉ thị methylen blue

Chú ý: đối với nguyên liệu giàu acid hữu cơ, trong quá trình đun khi chiết đường, saccharose có thể bị thủy phân một phần do sự có mặt của lượng