Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men kombucha từ trà ngọc thanh, vĩnh phúc

Trà kombucha còn chứa một lượng nhỏ cafein vì được lên men từ các loại trà như trà xanh, trà đen, trà ô long...Là sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% cồn, acid axetic, acid gluconic,

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

em đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình

Từ những kết quả đạt được này, em xin chân thành cám ơn:

PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung Giảng viên chính, tổ Thực vật – Vi sinh, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và TS Phương Phú Công công tác tại Bộ Giáo dục và Đào tạo đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo, động viên và cho em nhiều ý kiến quý báu, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện

đề tài tốt nghiệp này

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân, những người luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Minh

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của riêng cá nhân em, tất

cả những số liệu đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm và qua xử lý thống kê, hoàn toàn không có số liệu sao chép, bịa đặt Đề tài nghiên cứu này không trùng với công trình nghiên cứu của các tác giả khác

Trong đề tài, em có sử dụng một số dữ liệu của một số tác giả khác, em xin phép các tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình

Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Minh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

6 Điểm mới của đề tài 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về kombucha 4

1.1.1 Sơ lược về kombucha 4

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo 5

1.2.1 Chè Ngọc Thanh, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 6

1.2.1.1 Đặc điểm sinh thái, sinh sản của cây chè 7

1.2.1.2 Thành phần hóa học 8

1.2.2 Hệ vi sinh vật trong kombucha 9

1.2.2.1 Vi khuẩn acetic 9

1.2.2.1.1 Đặc điểm hình thái 9

1.2.2.1.2 Đặc điểm sinh thái 9

1.2.2.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 10

1.2.2.2 Nấm men 10

1.2.2.3 Vi khuẩn lactic 11

1.3 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha 11

1.4 Thành phần và công dụng của kombucha 14

1.5 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15

1.5.1 Trên thế giới 15

1.5.2 Ở Việt Nam 17

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu và thiết bị hóa chất 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1.1 Mẫu thực vật 19

2.1.1.2 Mẫu vi sinh vật 19

2.1.3 Các loại môi trường 20

2.1.4 Phạm vi nghiên cứu 21

2.1.5 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp lên men 21

2.2.2 Phương pháp vi sinh 21

2.2.2.1 Phương pháp phân lập các chủng VSV và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram 21

2.2.2.2 Bảo quản chủng giống 23

2.2.2.3 Phương pháp hoạt lực lên men 23

2.2.2.4 Phương pháp hoạt hóa giống 23

2.2.3 Phương pháp hóa sinh 24

2.2.3.1 Xác định đường khử 24

2.2.3.2 Xác định độ cồn 24

2.2.3.3 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphthalein 0,1% làm chỉ thị 25

2.2.3.4 Phát hiện hoạt tính catalaza 25

2.2.3.5 Phát hiện khả năng oxy hóa acid acetic 25

2.2.4 Phương pháp cảm quan 26

2.2.5 Xử lí số liệu bằng thống kê toán học 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh 29

3.1.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid 29

3.1.1.1 Phân lập vi khuẩn Acetobacter 29

3.1.1.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha tốt 33

3.1.2 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men 35

3.1.2.1 Phân lập các chủng nấm men 35

3.1.2.2 Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men kombucha tốt 36

3.2.2.2 Chất lượng cảm quan của kombucha được lên men từ 4 chủng nấm men 37

3.2 Động thái phát triển của chủng vi khuẩn Acetobacter V1 và chủng nấm men Saccharomyces N 2 38

3.2.1 Động thái phát triển của chủng vi khuẩn Acetobacter V1 38

3.2.2 Động thái sinh trưởng của chủng nấm men Saccharomyces N2 39

3.3 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc 41

3.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose tới quá trình lên men kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc 41

3.3.2 Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 tới quá trình lên men kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc 43

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của MgSO4.7H2O tới quá trình lên men kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

1 Kết luận 49

2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Lớp màng kombucha 6

Hình 1.2: Lá chè tươi 8

Hình 1.3 Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men 12

Hình 3.1: Lá chè Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc 30

Hình 3.2: Dịch kombucha lên men tự nhiên từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc 30

Hình 3.3: Mẫu phân lập vi khuẩn 30

Hình 3.4: Chủng vi khuẩn Acetobacter V1, Acetobacter V2 và Acetobacter V3 trên môi trường thạch nghiêng 30

Hình 3.5: Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn Acetobacter V1 ở độ phóng đại 1000 trên kính hiển vi quang học 31

Hình 3.6 Khả năng oxy hoá acetate 32

Hình 3.7 Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter 33

Hình 3.8: Mẫu phân lập nấm men 35

Hình 3.9: Chủng nấm men Saccharomyces N1 và N3 trên môi trường thạch nghiêng 35

Hình 3.11 Hình thái tế bào học của chủng nấm men Saccharomyces N2 ở độ phóng đại 1000 trên kính hiển vi quang học 36

Hình 3.10: Hình thái tế bào học của chủng nấm men Saccharomyces N3 ở độ phóng đại 1000 trên kính hiển vi quang học 36

Hình 3.12: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng acid tổng số 42

ở các hàm lượng đường glucose khác nhau 42

Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót 42

Hình 3.14 Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha ở các hàm lượng đường khác nhau 43

Hình 3.15: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng acid tổng số 44

ở các hàm lượng (NH4)2SO4 khác nhau 44

Hình 3.16: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót 45

ở các hàm lượng (NH4)2SO4 khác nhau 45

Hình 3.17: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi điểm cảm quan 45

ở các hàm lượng (NH4)2SO4 khác nhau 45

Hình 3.18: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng acid tổng số 47

ở các hàm lượng MgSO4.7H2O khác nhau 47

Hình 3.19: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót 47

ở các hàm lượng MgSO4.7H2O khác nhau 47

Hình 3.20: Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi điểm cảm quan 48

ở các hàm lượng MgSO4.7H2O khác nhau 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của lá trà 8

Bảng 2.1 Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 26

Bảng 2.2 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha 27

Bảng 2.3 Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu 28

Bảng 3.1 Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 4 chủng vi khuẩn Acetocbacter 34

Bảng 3.2 Chất lượng cảm quan trà kombucha lên men từ 4 chủng vi khuẩn Acetobacter 34

Bảng 3.3 Hàm lượng khí CO2 giải phóng sau 7 ngày lên men của 4 chủng nấm men 37

Bảng 3.4 Chất lượng cảm quan của các chủng nấm men 37

Bảng 3.5 Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter V1 39

(x106 tế bào) 39

Bảng 3.6 Động thái sinh trưởng của chủng nấm men N2 40

(x106 tế bào) 40

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose tới quá trình lên men kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc 41

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của hàm lượng(NH4)2SO4 tới quá trình lên men kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc 44

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O tới quá trình lên men kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc 46

BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

3 SCOBY Symbiotic colony of Bacteria and Yeast

Việt Nam

Trà thủy sâm , người Pháp gọi là Champignon De Longuc Vie (nấm

trường sinh), người Nhật gọi nó là kombucha, người Trung Quốc gọi là thủy hoài sâm, Nga gọi là nấm trà Đây là một loại men (giống như men giấm), được nuôi trong dung dịch nước trà đường Lọc nước (trà giấm) để uống Do

dễ uống nên được dùng như một loại nước giải khát Đây là một cấu trúc có dạng như thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn

Thành phần trà kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ Trà kombucha còn chứa một lượng nhỏ cafein vì được lên men

từ các loại trà như trà xanh, trà đen, trà ô long Là sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% cồn, acid axetic, acid gluconic, acid glycuronic, acid L-lactic, acid cacbonic, acid caprilic, acid xitric, acid oxalic, acid usnic, nhiều vitamin nhóm B như B1, B2, B3, B5, B6, B12, vitamin C, acid folic, amino acid và một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc

Hiện nay trà kombucha được phổ biến ở các nước trên thế giới như Pháp, Nhật, Trung Quốc, Nga…Ở Việt Nam cũng có sử dụng trà dưới dạng đóng chai, đồ hộp nhập khẩu, tuy nhiên chưa phổ biến, do đó công trình nghiên cứu kombucha ở nước ta chưa hoàn chỉnh, đầy đủ Đối tượng chè Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc để sản xuất trà kombucha chưa nhiều Đặc biệt là

2

những nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên

men kombucha Vì vậy tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc”

2 Mục tiêu của đề tài

Xác định ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men kom bucha

3.2 Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha

3.3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng của các chủng vi khuẩn, nấm men đã tuyển chọn

3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường glucose tới quá trình lên men kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc

3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 tới quá trình lên men kombucha

từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc

3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O tới quá trình lên men kombucha

từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

5.1 Ý nghĩa khoa học

Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha cho sản phẩm thơm ngon, bổ dưỡng trên môi trường nước trà đường Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc

3

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sử dụng trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc lên men kombucha tạo ra sản phẩm mới, góp phần làm đa dạng các sản phẩm lên men đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng Tận dụng được nguồn nguyên liệu rẻ tiền, phổ biến lên men tạo sản phẩm thơm ngon, bổ dưỡng, có lợi cho sức khỏe con người

6 Điểm mới của đề tài

Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men từ trà Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc Tìm ra được hàm lượng đường glucose là 100(g/l), (NH4)2SO4 là 2(g/l) và MgSO4.7H2O là 1,5(g/l) thích hợp cho quá trình lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh, Vĩnh Phúc

4

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về kombucha

1.1.1 Sơ lược về kombucha

Kombucha đã được sử dụng phổ biến qua hơn 200 năm ở vùng Viễn Đông và khoảng hơn 100 năm ở Đông Âu Một số tài liệu ghi chép cho thấy

có một số cư dân sống tại vùng Caucase đã thọ trên trăm tuổi Những người sống trường thọ như vậy còn tìm thấy tại một số làng mạc ở Poltaya, Ukraine, Tây Tạng và Tây Ban Nha Những người trường thọ ở Nga cho biết họ sống lâu như vậy nhờ từ hàng trăm năm nay họ có thói quen dùng loại trà lên men kombucha

Trà “thủy sâm” kombucha là một loại nước uống có lợi cho sức khỏe Đây là một cấu trúc có dạng như thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn [20]

Nấm kombucha là một khối vi sinh vật được phân loại theo tên khoa học

là “Zoogleal mat” liên kết với nhau thành màng phủ kín trên bề mặt nước trà đường Trong quá trình lên men, màng nấm kombucha lớn dần tạo thành khối dày giống như một cái bánh, thường được gọi là “nấm”, “cái dấm” hoặc bằng các từ viết tắt SCOBY (Symbiotic colony of Bacteria and Yeast: khối cộng sinh của vi khuẩn và nấm men) Các vi khuẩn và nấm men trong nấm kombucha làm chuyển hóa đường trong dung dịch nước trà đường thành rượu

và axit hữu cơ và có thể một số chất tan từ trà cũng được chuyển hóa trong quá trình lên men, tạo thành một loại nước giải khát có độ cồn thấp, vị chua ngọt, chát nhẹ Các vi sinh vật biến đổi đường thành gluconic acid, đồng thời sản xuất ra một lượng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi thành acetic acid Thành phần trà sau cùng chứa: acid folic, gluco Thành phần trà

5

Kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ Vì đây là sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% cồn, acid axetic, acid gluconic, acid glycuronic, acid L-lactic, acid cacbonic, acid caprilic, acid xitric, acid oxalic, acid usnic, nhiều vitamin nhóm B như B1, B2, B3, B6, B12, vitamin

C, acid folic, amino acid, và một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng

và giải độc Trà Kombucha còn chứa một lượng nhỏ cafein vì nó được lên men từ các loại trà như trà xanh, trà đen, trà ô long hoặc trà kukicha

Nồng độ acid và rượu trong kombucha giúp chống nhiễm các nấm mốc trong không khí và các bào tử vi khuẩn Kết quả là kombucha có thể tương đối dễ dàng lên men trong điều kiện thường Các vi khuẩn và nấm men trong kombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh

Trong quá trình làm cẩn thận để tránh cho trà không bị nhiễm các loại nấm mốc gây độc cho cơ thể Các yếu tố để đảm bảo an toàn cho việc lên men: môi trường sạch sẽ, nhiệt độ thích hợp, pH thấp

Nếu quá trình lên men bị nhiễm, có thể nhận thấy bằng mắt thường như trên bề mặt con nấm có xuất hiện màu xanh lá cây, xanh dương hoặc màu

đen, mốc trắng hình cầu thì đó có thể là các loài nấm mốc Aspergillus parasiticus, Aspergillus flavus, Penicillium citricum… Các loại nấm mốc trên

sẽ sản sinh ra mycotocin, citrinin, aflatoxin… đều là các độc tố có khả năng gây ung thư, khi xuất hiện sẽ làm sản phẩm mất giá trị dinh dưỡng và gây mùi khó chịu

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo

Kombucha là môi trường cộng sinh của vi khuẩn và nấm men Hệ vi

sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng Acetobacter như: Acetobacter xylinum, Acetobacter xylinoides, Acetobacter Ketogenum…

và nấm men: Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe… Ngoài ra còn có

6

thể có các chủng Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium gluconicum… Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha Kombucha

còn được gọi là nấm trà Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đường Bởi vậy, thường được sử dụng để lên men dung dịch trà đường, nên gọi là nấm trà Trong quá trình lên men kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên bề mặt dịch trà và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một kombucha thứ hai (thường gọi là kombucha con) tách biệt với kombucha ban đầu Hình dạng và kích thước của kombucha phụ thuộc vào hình dạng tiết diện của bình chứa

1.2 Tổng quan về nguyên liệu

1.2.1 Chè Ngọc Thanh, Phúc Yên, Vĩnh Phúc

Ngọc Thanh là xã miền núi duy nhất của thị xã Phúc Yên tỉnh Vĩnh Phúc Với địa hình trung du miền núi Bắc bộ, Ngọc Thanh tập chung vào gieo trồng các loại cây có hiệu quả kinh tế cao Trong đó cây chè là một trong những cây được chú trọng Toàn xã có 470 mẫu chè, cho 500 tấn chè mỗi năm

Hình 1.1: Lớp màng kombucha

7

Cây chè đã có mặt trên đất Ngọc Thanh từ hàng trăm năm nay Với điều kiện khí hậu thoáng mát, thổ nhưỡng phù hợp nên cây chè ở đây sinh trưởng phát triển tốt, chất lượng thơm ngon mang đặc trưng hương vị riêng của chè Ngọc Thanh Ngay cả những cụ già lớn tuổi cũng chỉ biết rằng khi mình sinh

ra thì ở đây đã có cây chè rồi Nhiều người đã làm quen với việc hái chè, xao chè từ nhỏ và đến bây giờ họ vẫn làm công việc đó Làm chè đã trở thành một nghề truyền thống góp phần tạo công ăn việc làm, thu nhập cho nhiều gia

đình, nhiều thế hệ người dân địa phương

1.2.1.1 Đặc điểm sinh thái, sinh sản của cây chè

Vụ Thu Đông (Tháng 11): hái chừa lá cá , tháng 12 hái cả lá cá

Với các giống chè có dạng thân bụi, sinh trưởng đỉnh đều có thể hái kéo hay hái bằng máy để nâng cao năng suất lao động

Chu kỳ phát triển

Chu kỳ của một cây chè bao gồm ba giai đoạn Giai đoạn đầu tiên là giai đoạn cây non hay giai đoạn thiết kế cơ bản Các bụi chè phải trồng 3-4 năm kể từ khi gieo trồng mới phát triển thành cây trưởng thành Sau đó là giai đoạn cây lớn và giai đoạn cuối là giai đoạn chè già cỗi Giai đoạn chè lớn kéo dài 20 – 30 năm, tuỳ giống, điều kiện đất đai, dinh dưỡng và khai thác Chăm sóc kém và khai thác nhiều sẽ làm cho cây chè bị suy thoái, già trước tuổi Đây là giai đoạn chè cho năng suất cao nhất Sau đó là giai đoạn chè già cỗi, cây chè suy yếu dần, lá nhỏ, búp ít, chóng mù xoè, hoa quả nhiều, cành tăm hương nhiều, chồi gốc mọc nhiều vì lý do này

Các thành phần trong nước chè xanh có tác dụng lớn đối với sức khỏe Chất catechin có tác dụng giảm nguy cơ gây ung thư, giảm kích thước khối u, chống phóng xạ, giảm lượng đường máu, giảm cholesterol, diệt khuẩn, diệt virut cúm Chè xanh chứa chất cafein có tác dụng chống buồn ngủ, giảm mệt mỏi và lợi tiểu Vitamin C làm tăng sức đề kháng, vitamin nhóm B giúp cho quá trình trao đổi cacbon hydrat Flavonoid có tác dụng giảm huyết áp, tăng độ bền vững thành mạch

(-) Epigallocatechin gallate (EGCG) 8 – 12

(-) Epicatechin gallate (ECG) 3 – 6

(-) Epigallo catechhin (EGC) 3 – 6

Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Acetobacteraceae Dạng hình

que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy) mà các

vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt dạng

kéo dài hoặc phình to ra Kích thước thay đổi tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0µm)

Có thể di động, hoặc không di động Không sinh nha bào tử Hiếu khí bắt buộc Chịu được độ acid cao

1.2.2.1.1 Đặc điểm hình thái

Các đặc điểm hình thái thường được khảo sát gồm màu sắc, hình dạng khuẩn lạc, trạng thái nhuộm Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thước tế bào Ngoài ra, số lượng và cách sắp xếp roi trên tế bào cũng có vai trò trong định danh vi khuẩn acetic

1.2.2.1.2 Đặc điểm sinh thái

Đặc điểm phân bố của vi khuẩn acetic thường gắn liền với các nguồn dinh dưỡng chứa đường hay alcohol như các loại hoa, quả, bia, rượu và các nơi sản xuất giấm Tuy nhiên trong một số trường hợp, đặc điểm sinh thái được đánh giá là đặc điểm điển hình của giống hay loài Cụ thể như

Acidomonas chỉ có thể phân lập được trong bùn hoạt tính có methanol; Granulibacter được tìm thấy trong cơ thể người bị u hạch

10

1.2.2.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid được phân biệt bởi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa như: Oxy hóa acetate tạo CO2 và H2O; phát triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau; phát triển sinh khối trong các môi trường chứa D- glucose 30%; acetic acid 0,35%

1.2.2.2 Nấm men

Hình thái và cấu tạo

Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ…, thường có kích thước rất lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình: chiều dài: 9 – 10 μm, chiều rộng: 2 – 7 μm Hình dạng và kích thước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau

Sự sinh sản của nấm men

Nấm men có một số hình thức sinh sản: nảy chồi; phân đôi; sinh sản bằng bào tử và hình thành bào tử (tiếp hợp đẳng giao; tiếp hợp dị giao; sinh sản đơn tính)

Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men

Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon, nitơ, phospho, kali, magiê…

Dinh dưỡng cacbon: nguồn cacbon cung cấp là các loại đường khác nhau: saccharose, maltose, lactose, glucose…Dinh dưỡng oxy, hydro: được cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch Dinh dưỡng nitơ: nấm men không có men ngoại bào để phân giải protein, nên không thể phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, amid, urê Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat…Các vitamin và chất khoáng: Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống

1.2.2.3 Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium Đây là những trực

khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện

Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5,5 ÷ 6, khi pH nhỏ hơn 5,5 quá trình lên men bị dừng lại Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 500C Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn.[8] 1.3 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha

Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá trình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau:

12

Lên men ethanol

Hình 1.3 Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2 Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối (với sự

có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối), thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2 (giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2) Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa

13

theo chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic Tiếp theo acid pyruvic

sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chất này có thể chuyển hoá thành glyxerol Trong môi trường pH acid, glycerol chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ Ngược lại, trong môi trường pH kiềm lượng glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men

Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:

C6H12O6 + 2ADP +2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP

Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế bào chất của nấm men Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men trong điều kiện kỵ khí Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men thải vào môi trường lên men Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những hợp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este Trong quá trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990) Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trình lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic

* Lên men acetic:

Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dưới tác dụng của vi khuẩn

C2H5OH + O2 → CH3CHO (Acetaldehyde) + H2O

CH3CHO + H2O → CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyde)

CH3CH(OH)2 + O2 → CH3COOH + H2O

14

* Lên men lactic:

Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng Các phân tử ATP được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi hóa lý khác Bản chất là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật

Phương trình phản ứng:

C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + 94kcal Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men đồng hình), acid acetic, ethanol, CO2 (lên men dị hình) trong dịch lên men còn xuất hiện cả trăm hợp chất hóa học mới khác Chúng là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men

Trong quá trình lên men yếm khí, trà kombucha chứa một lượng cồn khác nhau từ 0,5 – 1,5% phụ thuộc vào thời gian lên men yếm khí và vi sinh vật Trà kombucha giúp tăng sức chịu đựng dẻo dai của cơ thể, làm giảm đau cơ, triệu chứng mệt mỏi Nhờ sản sinh axit lactic, giúp tăng lượng vi khuẩn có lợi

15

cho đường ruột, tăng nhanh quá trình lên men trong ruột, ngừa táo bón, nhiễm trùng đường ruột, kiết lị, rối loạn tiêu hóa Trà kombucha tăng tính đàn hồi cho da, làm màu da tươi sáng hơn Acid glycuronic kết hợp với các độc tố trong gan làm chúng dễ tan trong nước, sau đó bài tiết qua nước tiểu giúp giải độc cơ thể Ngoài ra, kombucha còn có tác dụng kháng sinh, chống trầm cảm, chữa thiếu ngủ, giúp gia tăng thị lực [25]

Nhiều nghiên cứu cho thấy, sản phẩm trà kombucha có lợi cho sức khỏe hơn so với những sản phẩm lên men từ sữa và có khả năng như một chất kháng sinh, kháng virut, kháng nấm Ngoài ra, còn giúp giảm stress và phục hồi chức năng gan Nhiều báo cáo cho biết uống trà kombucha làm giảm cao huyết áp, chống lại bệnh viêm khớp, xơ cứng động mạch, bệnh hen suyễn, bệnh viêm phế quản, tăng hệ miễn dịch cho cơ thể và chữa bệnh ung thư… sử dụng kombucha có lợi cho dạ dày, ruột và các hoạt động của hệ nội tiết, giúp bài tiết độc tố, ngăn ngừa xơ cứng động mạch, giảm căng thẳng và các vấn đề về lão hóa Nó cũng có thể có tác dụng như thuốc nhuận tràng, làm giảm nguy cơ mắc các bệnh thấp khớp, bệnh gút, bệnh trĩ [20] Trong những nghiên cứu gần đây còn chỉ ra rằng kombucha có khả năng liên kết với các gốc tự do và chống oxy hóa

Trà thủy sâm kombucha là loại nước uống có lịch sử lâu đời ở nhiều nước và thấy có lợi cho sức khỏe Tuy nhiên chưa thấy tài liệu khoa học chính thức nào công bố về hiệu quả chữa bệnh Sử dụng kombucha không có phản ứng phụ và nên uống sau mỗi bữa ăn, mỗi lần 100ml, ngày 2 lần

1.5 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.5.1 Trên thế giới

Ở trên thế giới đã có rất nhiều các bài báo, các nghiên cứu về kombucha được đăng trên tạp chí quốc tế Đó là các bài báo, các công trình nghiên cứu về tác dụng của trà kombucha đối với sức khỏe, các nghiên cứu về

16

phân lập hệ vi sinh vật trong trà kombucha…Đầu tiên phải kể đến các bài báo, các nghiên cứu về tác dụng của kombucha và các nghiên cứu sinh hóa: Bacinskaja (1914) và cộng sự cho rằng kombucha tốt cho hệ tiêu hóa, điều chỉnh các hoạt động đường ruột, đặc biệt là chống táo bón Đến năm 1927, Madaus đã có những nghiên cứu và đưa ra kết luận nấm kombucha và các sản phẩm chuyển hóa của nó có tác động tích cực trong việc tái sinh vách tế bào, một phương thuốc tuyệt vời cho bệnh xơ vữa động mạch…

Vào năm 1987, Veronika Carstens trong nghiên cứu của mình đã chỉ ra: kombucha có tác dụng giải độc cơ thể, cải thiện chức năng hệ miễn dịch Reiss, J (1994) đã tìm hiểu ảnh hưởng của các loại đường khác nhau lên quá trình trao đổi chất của nấm trà Năm 2006, K.H Steinkraus và cộng sự đã có những nghiên cứu về hoạt động kháng sinh của trà nấm kombucha Năm

2007, Velicanski và cộng sự đã cho biết hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha Jayabalan R và cộng sự (2010) đã nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa của nấm trà Cavusoglu K., Gluer P (2010) đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên nhiễm sắc thể gây ra bởi bức xạ gamma trong tế bào bạch huyết ngoại vi của con người trong ống nghiệm Yapar K và cộng sự (2010) đã có những nghiên cứu về tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha đối với chuột bạch tạng bị nhiễm độc do phenol Các nghiên cứu về định danh các chủng vi sinh vật trong kombucha và ứng dụng của các chủng được phân lập từ kombucha cũng đã có từ rất lâu: Từ năm

1928, Hermann đã định danh hai chủng Bacterium xylinum và B xylinoides

và B gluconicum Các nhà nghiên cứu còn xác định được kombucha là một

sự hợp tác cộng sinh giữa Bacterium xylinum cùng các vi khuẩn khác, với những tế bào nấm men thuộc chủng Saccharomyces, tạo thành một khối như

tổ chim Vào năm 1973, List và cộng sự đã phân lập được Acetobacter ketogenum; Pichia fermentans; Saccharomyces apiculatus; S.ludwigli;

17

B.xylinoides; Schizosaccharomyces pombe từ dịch nuôi cấy kombucha Năm

2001, Kurtzman CP và cộng sự đã phân lập được một chủng nấm men mới từ

kombucha và đặt tên là Zygosaccharomyces kobuchaensis Vào năm 2006,

Dutta D và cộng sự đã có công trình nghiên cứu về khả năng cố định đạm của

chủng Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov được phân lập từ trà kombucha

Ngoài ra còn một số tác giả cũng nghiên cứu về kombucha như Teoh AL., Heard G., Cox J (2004)[22]

Theo Vũ Văn Chuyên thì từ năm 1969, ở Bắc Thái (cũ) và Hà Nội, người

ta đã phổ biến cho nhau dùng nước thủy hoài sâm để bồi dưỡng và phục hồi sức khỏe, chống lại bệnh tật Theo tác giả Hà Văn Hùng, Phó Viện trưởng Viện Y dược học dân tộc thành phố Hồ Chí Minh cũng cho rằng cho đến nay Viện cũng chưa có công trình nào nghiên cứu về thủy sâm nên không biết rõ thành phần và công dụng của nó Ở Việt Nam, cũng đã có một số công trình nghiên cứu về kombucha như: Vào năm 2012, Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cộng sự đã có công trình nghiên cứu “ Nghiên cứu hệ vi sinh vật của trà kombucha và hiệu quả tác dụng trên một số chỉ tiêu sinh lý chuột” Kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra hệ vi sinh vật trong kombucha bao gồm: vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic và nấm men, đồng thời khảo sát tác dụng của

18

kombucha trên một số chỉ tiêu sinh lý của chuột như: cân nặng, tổng lượng hồng cầu, tổng lượng bạch cầu, sức khỏe của chuột thí nghiệm qua mô hình bơi kiệt sức Sản phẩm kombucha có tác dụng tăng cường sức khỏe, không gây ảnh hưởng xấu tới các chỉ tiêu sinh lý của chuột… Năm 2013, tác giả

Lâm Thị Hồng Liên, đại học Sư phạm Hà Nội 2, thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang” đã

phân lập được 25 mẫu nấm men, sơ bộ định loại 5 chủng nấm men

Saccharomyces M1; Saccharomyces M2; Schizosaccharomyces M3;

Schizosaccharomyces M4; Saccharomyces M5 Tuyển chọn 2 chủng nấm men

M1 và M2 phù hợp cho quá trình lên men kombucha [9] Và một vài tài liệu

nghiên cứu của tác giả Hoàng Ánh Sáng (2014), “ Nghiên cứu ảnh hưởng của

vi khuẩn tới quá trình lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang”, luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Sư phạm Hà Nội 2[14] Tuy nhiên, có thể thấy các nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam vẫn còn ít Chủ yếu là các nghiên cứu về tác dụng của kombucha Các nghiên cứu về chủng vi khuẩn, nấm men còn ít

19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu và thiết bị hóa chất

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Ethanol, glucose, fructose, sacrose, lactose

Cao men, pepton, (NH4)2SO4

Box vô trùng (Haraeus)

Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

Micropipet Jinson (Pháp)

Máy đo pH

Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)

Máy cất nước 2 lần (Hamilton – Anh)

Glucose:50

KH 2 SO 4 :3g (NH 4 ) 2 SO 4 :2 MgSO 4 7H 2 O:2 Thạch aga: 20 Pepton: 10 Nước:1000ml

Môi trường nhân giống cơ bản

(MT2) (g/l)

Glucose:20

KH 2 SO 4 :2 (NH 4 ) 2 SO 4 :3 MgSO 4 7H 2 O:2 Pepton:4 CaCO 3 :5 Nước: 1000ml Axit axetic 2%, rượu etylic 2%

Glucose:50

KH 2 SO 4 :3 (NH 4 ) 2 SO 4 :2 MgSO 4 7H 2 O:2 Pepton:10 Nước: 1000ml

Môi trường lên men kombucha

(MT3) (g/l)

Saccarose:100

Lá chè: 150 Nước:1000ml