Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng bacterial cellulose của vi khuẩn gluconacetobacter

MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2 5. Phương pháp nghiên cứu 3 6. Điểm mới của đề tài 3 NỘI DUNG 4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter 4 1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của Gluconacetobacter 5 1.3. Bacterial cellulose (BC) 5 1.3.1. Cấu trúc 5 1.3.2. Một số tính chất của màng BC 6 1.3.3. Quá trình tổng hợp BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter 6 1.3.4. Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter 8 1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo màng BC 9 1.4.1. Nguồn cacbon 9 1.4.2. Nguồn nitơ 9 1.4.3. Nguồn dinh dưỡng khoáng 10 1.4.4. Các chất kích thích sinh trưởng 10 1.4.5. Điều kiện nuôi cấy 11 1.4.5.1. Độ pH 11 1.4.5.2. Nhiệt độ 11 1.4.5.3. Độ thông khí 11 1.4.5.4. Thời gian nuôi cấy 11 1.4.5.5. Ảnh hưởng giữa bề mặt và thể tích dịch nuôi cấy (tỷ lệ S/V) 12 1.5. Ứng dụng của màng BC 12 1.5.1. Ứng dụng bảo quản thực phẩm và thay thế túi ni lông 12 1.5.2. Ứng dụng trong y học 13 1.5.3. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác 13 1.6. Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng BC hiện nay 15 1.6.1. Trên thế giới 15 1.6.2. Tại Việt Nam 17 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 20 2.1.1. Giống 20 2.1.2. Thiết bị và hóa chất 20 2.1.2.1. Thiết bị 20 2.1.2.2. Hóa chất 20 2.1.3. Môi trường 21 2.1.3.1. Môi trường giữ giống (MT1) 21 2.1.3.2. Môi trường nhân giống (MT2) 21 2.1.3.3. Môi trường lên men (MT3) 21 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 21 2.2.1. Phương pháp vi sinh 21 2.2.1.1. Phân lập tuyển chọn chủng G. xylinus theo phương pháp truyền thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck) 21 2.2.1.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép 23 2.2.1.3. Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng 23 2.2.2. Phương pháp hóa sinh 23 2.2.2.1. Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase 23 2.2.2.2. Phương pháp kiểm tra khả năng oxy hóa ethanol thành axit acetic 23 2.2.2.3. Xác định khả năng oxy hóa axit acetic 24 2.2.2.4. Xác định khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton 24 2.2.2.5. Xác định khả năng tổng hợp cellulose 24 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter 25 2.2.3.1. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường 25 2.2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ 25 2.2.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng khoáng 25 2.2.4. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC 26 2.2.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 26 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh màng Bacterial cellulose trên một số nguồn nguyên liệu 27 3.1.1. Phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sinh màng BC 27 3.1.1.1. Làm giàu mẫu nguyên liệu 28 3.1.1.2. Phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sinh màng BC 28 3.1.2. Nghiên cứu khả năng tạo màng BC của một số chủng Gluconacetobacter 31 3.1.3. Tuyển chọn chủng có khả năng tạo màng BC dai, mỏng 34 3.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng tới khả năng tạo màng BC từ chủng G. xylinus BHN 2 36 3.2.1. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose tới khả năng lên men tạo màng BC từ chủng G. xylinus 36 3.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH 4 ) 2 SO 4 tới khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn G. xylinus 38 3.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng KH 2 PO 4 tới khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn G. xylinus 40 3.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 .7H 2 O tới khả năng lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn G. xylinus 42 3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn G. xylinus 43 3.2.6. Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa trong môi trường lên men tạo màng BC 45 3.2.7. Môi trường dinh dưỡng nước gạo thay thế nước dừa cho chủng G. xylinus BHN 2 lên men tạo màng BC 49 3.2.7.1. Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trường dinh dưỡng từ nước gạo 50 3.2.7.2. So sánh khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trường nước dừa và môi trường nước gạo thay thế nước dừa 52 3.3. Khảo sát định hƣớng ứng dụng cho sản phẩm màng BC 53 3.3.1. Khảo sát khả năng bảo quản thực phẩm và thay thế túi ni lông 53 3.3.2. Ứng dụng bảo quản thực phẩm và thay thế túi ni lông 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 1. Kết luận 58 2. Kiến nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 DANH MỤC HÌNH, BẢNG, BIỂU ĐỒ Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter 4 Hình 1.2. Quá trình tổng hợp cellulose trong tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter 7 Hình 1.3. Con đường chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter 8 Hình 1.4. Màng sinh học dễ bong, không gây đau rát trong điều trị bỏng 19 Hình 3.1. Qui trình phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter 27 Hình 3.2. Một số mẫu màng BC thu được sau khi làm giàu nguyên liệu 28 Hình 3.3. Vòng phân giải CaCO 3 29 Hình 3.4. Chuyển hóa ethanol thành axit acetic của vi khuẩn acetic 30 Hình 3.5. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter 31 Hình 3.6. Hình thái tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter khi nhuộm Gram 32 Hình 3.7. Một số loại màng do các chủng vi khuẩn hình thành trênbề mặt môi trường dịch thể 33 Hình 3.8. Khả năng tạo cellulose của các chủng G. xylinus 33 Hình 3.9. Hoạt tính catalase 34 Hình 3.10. Màng BC sinh ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter 35 Hình 3.11. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khối lượng tươi màng BC 37 Hình 3.12. Ảnh hưởng hàm lượng (NH 4 ) 2 SO 4 đến độ dày màng BC 39 Hình 3.13. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 .7H 2 O tới độ dày màng BC 43 Hình 3.14.A. Quá trình lên men tĩnh 47 Hình 3.14.B. Thu màng sau 5 ngày lên men 47 Hình 3.15. Màng BC thu được sau 5 ngày lên men 48 Hình 3.16. Lên men tạo màng trên môi trường nước gạo 50 Hình 3.17. Khối lượng màng BC thu được khi thay thế nước dừa bằng nước gạo 51 Hình 3.18. Màng BC tươi của môi trường nước dừa và môi trường nước gạo thay thế nước dừa 52 Hình 3.19.A. Cà chua bọc bằng màng BC 56 Hình 3.19.B. Cà chua hỏng sau 7 ngày 56 Hình 3.20.A. Cà chua bọc túi nilông hỏng sau 12 ngày 56 Hình 3.20.B. Cà chua bọc hỏng màng BC hỏng sau 23 ngày 56 Hình 3.21.A. Roi hỏng sau 4 ngày 56 Hình 3.21.B. Roi hỏng sau 12 ngày 56 Hình 3.22.A. Bảo quản dưa chuột 57 Hình 3.22.B. Dưa chuột hỏng sau 5 ngày 57 Hình 3.23.A. Cam hỏng sau 12 ngày 57 Hình 3.23.B. Cà rốt hỏng sau 5 ngày 57 Bảng 1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC 9 Bảng 1.2. Ứng dụng cellulose vi khuẩn trong nhiều lĩnh vực khác nhau 14 Bảng 3.1. Một số đặc tính của màng BC 34 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến màng BC 36 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH 4 ) 2 SO 4 đến khối lượng tươi của màng BC 38 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH 2 PO 4 đến khối lượng tươi của màng BC.40 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO 4 .7H 2 O đến khối lượng tươi của màng BC 42 Bảng 3.6. Khối lượng tươi của màng BC qua thời gian nuôi cấy 44 Bảng 3.7. Thành phần hóa học của nước dừa già 45 Bảng 3.8. Thành phần vitamin có trong nước dừa 46 Bảng 3.9. Thành phần axit amin của nước dừa 46 Bảng 3.10. Khối lượng tươi màng BC 47 Bảng 3.11. Thành phần dinh dưỡng có trong cám gạo 50 Bảng 3.12. Khối lượng màng BC tươi khi lên men ở môi trường dinh dưỡng nước gạo thay thế nước dừa 51 Bảng 3.13. So sánh khả năng tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên môi trường nước dừa và môi trường nước gạo thay thế nước dừa 52 Bảng 3.14. So sánh bảo quản cà chua bằng màng BC với túi ni lông thông thường và không bảo quản 53 Bảng 3.15. So sánh bảo quản một số loại quả bằng màng BC, túi ni lông và không bảo quản 55 Biểu đồ 3.1. Mối tương quan giữa hàm lượng glucose và khối lượng màng BC 37 Biểu đồ 3.2. Mối tương quan giữa hàm lượng (NH 4 ) 2 SO 4 và khối lượng màng BC 39 Biểu đồ 3.3. Mối tương quan giữa hàm lượng KH 2 PO 4 và khối lượng màng BC 41 Biểu đồ 3.4. Mối tương quan giữa hàm lượng MgSO 4 .7H 2 O và khối lượng màng BC 42 Biểu đồ 3.5. Khối lượng màng BC qua các thời gian nuôi cấy 44 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa tới khối lượng màng BC 48 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Trong quá trình phát triển của lịch sử nhân loại, con người không ngừng tìm kiếm, nghiên cứu những nguồn nguyên liệu mới. Ngày nay, nhờ có sự phát triển mạnh mẽ như vũ bão của khoa học công nghệ mà việc nghiên cứu, tìm kiếm trở nên dễ dàng hơn. Các nhà khoa học đã phát hiện ra rất nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau và ứng dụng chúng trong thực tiễn cuộc sống. Một trong những nguồn nguyên liệu đã và đang được quan tâm gần đây đó là cellulose vi khuẩn hay Bacterial cellulose (BC). BC được cấu tạo bởi những chuỗi polymer 1,4 glucopyranose mạch thẳng được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn Gluconacetobacter xylinus (G. xylinus) [17]. Khi nuôi cấy trên môi trường dịch lỏng, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, G. xylinus sẽ hình thành một lớp màng đó có bản chất là cellulose được liên kết với các tế bào vi khuẩn. Màng BC do G. xylinus tạo ra có cấu trúc hóa học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng lại có một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học và khả năng thấm hút nước cao; đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, khả năng polymer lớn. Hiện nay màng BC được xem là nguồn nguyên liệu mới có tiềm năng được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp thực phẩm, công nghệ giấy, công nghệ sản xuất pin đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được một số nước trên thế giới nghiên cứu ứng dụng làm màng trị bỏng, mặt nạ dưỡng da, mạch máu nhân tạo [8]. Trên thế giới việc nghiên cứu G. xylinus và quá trình sinh tổng hợp BC cũng như ứng dụng của BC bắt đầu từ rất sớm. Những nghiên cứu đầu tiên là của Brown A.J và cộng sự năm (1886) [18]. Trải qua hơn 1 thế kỷ nhưng cho đến nay G. xylinus và màng BC vẫn đang thu hút được sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới. Ở Việt Nam, nghiên cứu về G. xylinus, màng BC 2 và ứng dụng của nó còn là vấn đề khá mới mẻ, chỉ mới được quan tâm gần đây. Các nghiên cứu và công bố về vấn đề này còn rất khiêm tốn. Các nghiên cứu hiện mới dừng ở nghiên cứu quá trình tạo màng BC ứng dụng trong sản xuất thạch dừa, làm giá thể gắn kết tế bào vi khuẩn và làm màng trị bỏng [20]. Nhằm bổ sung những hiểu biết về G. xylinus và quá trình tạo màng BC định hướng nhu cầu nghiên cứu và ứng dụng màng BC sau này, tôi lựa chọn đề tài: “Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter”. 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu khu hệ vi khuẩn Gluconacetobacter từ một số nguồn nguyên liệu ở Việt Nam, nhằm bổ sung vào bộ sưu tập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh màng BC. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng, sự đa dạng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng BC. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh màng Bacterial cellulose trên một số nguồn nguyên liệu 3.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng BC của vi khuẩn G. xylinus BHN 2 3.3. Khảo sát định hướng ứng dụng cho sản phẩm màng BC 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter 4.2. Phạm vi nghiên cứu: khả năng lên men tạo màng của các chủng Gluconacetobacter, ứng dụng trong thực tiễn 5. Phƣơng pháp nghiên cứu 5.1. Phương pháp vi sinh 3 5.2. Phương pháp hóa sinh 5.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter 5.4. Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng BC 5.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 6. Điểm mới của đề tài Đề tài tập trung thực hiện từ nuôi cấy, tuyển chọn, tìm môi trường dinh dưỡng nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn G. xylinus BHN 2, đồng thời định hướng ứng dụng cho chủng nghiên cứu. [...]... 25 màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% nó chuyển hóa thành màu xanh lam 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến khả năng tạo màng BC của chủng Gluconacetobacter 2.2.3.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường Để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường đến quá trình tạo màng BC của chủng G xylinus BHN2, tôi tiến hành sử dụng môi trường. .. nghiệm tiếp theo 2.2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nitơ đến quá trình tạo màng BC của vi khuẩn Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường tạo màng cơ bản có sự thay đổi hàm lượng nitơ; nguồn nitơ sử dụng là (NH4)2SO4 [3] Các yếu tố còn lại của môi trường giữ nguyên theo môi trường lên màng cơ bản (MT3), riêng nguồn đường được bổ... nước: màng BC có khả năng giữ nước đáng kể (lên đến 99%), có tính xốp, độ ẩm cao 1.3.3 Quá trình tổng hợp BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter Khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter trong môi trường có nguồn dinh dưỡng đầy đủ (chủ yếu là carbohydrate, vitamin B 1, B2, B12… và các chất kích thích sinh trưởng), chúng sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất của mình bằng cách hấp thụ dinh dưỡng từ môi trường. .. chuyển hóa cacbon trong vi khuẩn Gluconacetobacter 1.3.4 Chức năng của cellulose đối với vi khuẩn Gluconacetobacter Màng BC nằm ở mặt thoáng của môi trường nuôi cấy có tác dụng như một lớp bảo vệ cho các tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter trước các nhân tố có hại của môi trường Có những ghi nhận rằng cellulose bao quanh tế bào vi khuẩn bảo vệ chúng khỏi tia cực tím Khoảng 23% số tế bào Gluconacetobacter được... khá mới mẻ Các công trình nghiên cứu mới chỉ quan tâm tới quá trình tạo màng, đặc tính và cấu trúc của màng Về ứng dụng thực tiễn, mới chỉ được ứng dụng trong chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng, và được ứng dụng trong sản xuất thạch dừa [3], [6], [7], [10], [14] Hiện nay vi c nghiên cứu tìm môi trường tối ưu cho quá trình tạo màng của vi khuẩn Gluconacetobacter chưa được thực hiện Hầu như có rất... bước đầu nghiên cứu quá trình sinh axit acetic, khả năng tạo màng BC, đặc tính cấu trúc màng BC [8]; gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn Năm 2000, nghiên cứu của nhóm Đinh Thị Kim Nhung, Đỗ Thị Hương, Nguyễn Khắc Thanh, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men cho vi khuẩn G xylinus ứng... 2.2.3.1 Sau 5 ngày lên men tiến hành thu màng, lựa chọn môi trường có hàm lượng (NH4)2SO4 cho màng tốt nhất và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo 2.2.3.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng khoáng Nguồn phospho được sử dụng là KH2PO4 giống như ở môi trường cơ bản (MT3) nhưng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng của KH2PO4 đến khả năng tạo màng BC Tiến hành... tôi tiến hành sử dụng môi trường nghiên cứu tạo màng chuẩn sau đó thay đổi hàm lượng đường glucose, còn các thành phần khác của môi trường giữ nguyên theo tỷ lệ của môi trường lên màng cơ bản (MT3) Sau 5 ngày tiến hành thu màng và so sánh độ dày và khối lượng tươi của màng thu được ở các môi trường thí nghiệm, sau đó chọn ra môi trường có hàm lượng đường cho màng tốt nhất để sử dụng cho các thí nghiệm... SurmaS‟lusarska và cộng sự [20] đã đưa ra phương pháp chế tạo màng và nghiên cứu đặc điểm màng, ảnh hưởng của nguồn cacbon, đường glucose, manitol và xylose đến quá trình tạo màng, cấu trúc sợi cellulose của màng và ứng dụng trong sản xuất giấy Hầu hết các tác giả nước ngoài nghiên cứu theo hướng sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn, ứng dụng của màng BC trong y học, công nghiệp giấy, trong chế biến thực... dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường [31] Ngoài ra còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai trò ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn Gluconacetobacter và quá trình hình thành màng BC như Mg, Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl… Nếu thiếu một trong số các nguyên tố vi lượng thì vi khuẩn Gluconacetobacter không thể sinh trưởng và phát triển bình thường được Đối với Gluconacetobacter, nguyên liệu chủ . vi khuẩn G. xylinus 42 3.2.5. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình lên men tạo màng BC từ chủng vi khuẩn G. xylinus 43 3.2.6. Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa trong môi trường lên men tạo màng. cầu nghiên cứu và ứng dụng màng BC sau này, tôi lựa chọn đề tài: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng Bacterial cellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter . 2. Mục. 3.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng BC của vi khuẩn G. xylinus BHN 2 3.3. Khảo sát định hướng ứng dụng cho sản phẩm màng BC 4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên