6. Điểm mới của đề tài
3.1.1.2.Phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter có khả năng sinh màng
Bước 1: vớt mẫu màng, rửa qua bằng nước cất. Tiến hành phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter trên môi trường 1 theo phương pháp của Winogradski 1, [2]. Kết quả phân lập được 12 chủng, trong đó:
3 chủng từ bia Hà Nội ký hiệu B1, B2, B3 3 chủng từ dứa ký hiệu D1, D2, D3
2 chủng từ xoài ký hiệu X1, X2, X3 4 chủng từ trà ký hiệu C1, C2, C3, C4.
Nhận thấy nhóm vi khuẩn acetic có khả năng hình thành màng trên môi trường dịch thể, do đó khi vớt mẫu màng rửa bằng nước cất vô trùng đã loại bỏ phần lớn vi sinh vật không mong muốn3]. Mặt khác môi trường 1 dùng để phân lập được axit hóa bằng axit acetic cũng góp phần ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật khác. Tuy nhiên, ngoài các chủng thuộc chi
Gluconacetobacter còn có rất nhiều các chủng vi khuẩn khác cũng có thể sống trong môi trường có độ pH thấp. Vì vậy, chúng tôi tiến hành sơ tuyển lần tiếp theo bằng cách lựa chọn các chủng có khả năng sinh axit (bước 2).
Bước 2: vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường có chứa CaCO3 điều đó cho thấy axit gluconic đã được tạo thành (Hình 3.3). Chúng tham gia phản ứng với CaCO3 để chuyển môi trường từ màu trắng sang không màu. Sau bước này ta thu được các chủng có khả năng sinh axit nhưng chưa khẳng định được axit đó là axit acetic. Vì vậy, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng oxy hóa ethanol thành axit acetic (bước 3).
H+ + CaCO3 → Ca2+ + H2O + CO2
Bước 3: từ các chủng đã chọn được ở bước 2 tiếp tục tiến hành tuyển chọn Gluconacetobacter theo phương pháp của Carr (1968) [13].
Theo Bergey (2005)36] vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae
trong đó có 2 chi là Gluconacetobacter và Gluconobacter. Cả hai chi đều có khả năng oxy hóa ethanol thành axit acetic. Axit acetic làm môi trường có chứa Blue Bromophenol 0.04% chuyển từ màu xanh lục sang màu vàng (hình 3.4). Các chủng thuộc chi Gluconacetobacter có khả năng phân giải tiếp tục axit acetic thành CO2 và H2O phục hồi màu xanh của môi trường. Ngược lại, các chủng thuộc chi Gluconobacter không có khả năng phân giải axit acetic nên môi trường vẫn giữ màu vàng.
Hầu hết các chủng vi khuẩn đã phân lập được đều có khả năng oxy hóa ethanol thành axit acetic (hình 3.4). Khả năng này mạnh yếu khác nhau tuỳ chủng. Hơn nữa các chủng đã phân lập được gồm 2 nhóm có tốc độ sinh trưởng khác nhau (nhóm sinh trưởng nhanh và nhóm sinh trưởng chậm) do đó việc theo dõi khả năng phục hồi màu xanh của môi trường để phân biệt 2 chi
Gluconacetobacter và Gluconobacter rất khó khăn, thiếu chính xác. Vì thế, sau bước 3 lựa chọn các chủng làm môi trường chuyển màu vàng và tiếp tục khảo sát khả năng oxy hóa acetate nhằm phân biệt các chủng thuộc 2 chi
Gluconacetobacter và Gluconobacter.
Hình 3.4. Chuyển hóa ethanol thành axit acetic của vi khuẩn acetic
Bước 4: cấy các chủng đã tuyển chọn ở bước 3 lên môi trường có chứa