Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng Biocellulose trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ===o0o=== NGÔ THỊ NGỌC OANH ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN DINH DƯỠNG TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO MÀNG BIOCELLULOSE TRONG MÔI TRƯỜNG CÓ BỔ SUNG T

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

===o0o===

NGÔ THỊ NGỌC OANH

ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN DINH DƯỠNG TỚI

QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO MÀNG BIOCELLULOSE

TRONG MÔI TRƯỜNG CÓ BỔ SUNG TẢO XOẮN

LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả tấm lòng kính trọng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể thầy cô trong

tổ vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và khuyến khích em trong thời gian học tập

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 và Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu

Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã quan tâm giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày … tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Ngô Thị Ngọc Oanh

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật Đây là kết quả nghiên cứu của riêng em Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả đã công bố

Nếu sai em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, ngày … tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Ngô Thị Ngọc Oanh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.Lý do chọn đề tài 1

2.Mục đích nghiên cứu 2

3.Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

4.Điểm mới của đề tài 2

NỘI DUNG 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về tảo xoắn Spirulina 3

1.1.1 Lịch sử 3

1.1.2 Phân loại tảo Spirulina 3

1.1.3 Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina 4

1.2 Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới 8

1.2.1 Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới 8

1.2.2 Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter 8

1.3 Đặc điểm và cơ chế hình thành màng Biocellulose 10

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc của màng Biocellulose 10

1.3.2 Một số tính chất của màng Biocellulose 11

1.3.3 Cơ chế tổng hợp Biocellulose 12

1.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter 12

1.4.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 13

1.4.2 Nhu cầu nitơ của vi sinh vật 13

1.4.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng 13

1.4.4 Các chất kích thích sinh trưởng 14

1.5 Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng Biocellulose hiện nay 14

1.5.1 Trên thế giới 14

1.5.2 Tại Việt Nam 15

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu và hóa chất 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 17

2.1.3 Môi trường 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp vi sinh 18

2.2.2 Phương pháp hóa sinh 20

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến khả năng tạo màng Biocellulose 21

2.2.4 Thử nghiệm khả năng tạo màng Biocellulose trên môi trường đã chọn 23

2.2.5 Phương pháp xác định trọng lượng tươi của màng Biocellulose 23

2.2.6 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 23

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh màng Biocellulose trên môi trường có bổ sung dịch tảo xoắn Spirulina 25

3.1.1 Phân lập Gluconacetobacter có khả năng sinh màng Biocellulose 25

3.1.2 Nghiên cứu khả năng tạo màng Biocellulose của một số chủng Gluconacetobacter 29

3.1.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng Biocellulose dai, mỏng 31

3.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng G xylinus T1 33

3.2.1 Hình thái và tế bào học chủng vi khuẩn G xylinus T1 33

3.2.2 Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa 343.2.3 Sinh trưởng trên môi trường lỏng 34

3.2.4 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn G xylinus T1 35

3.3 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới khả năng tạo màng

Biocellulose trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina 37

3.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng glucose tới khả năng lên men tạo

màng Biocellulose 37

3.3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng nitơ tới khả năng lên men tạo màng

Biocellulose 39

3.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 tới khả năng lên men tạo

màng Biocellulose từ chủng vi khuẩn G xylinus T1 41

3.3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O tới khả năng lên men

tạo màng Biocellulose từ chủng vi khuẩn G xylinus T1 43 3.3.5 Thử nghiệm khả năng tạo màng Biocellulose trên môi trường đã

chọn 46KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình dạng tảo Spirulina dưới kính hiển vi 4

Hình 1.2 Sợi cellulose của màng Biocellulose 11

Hình 3.1 Qui trình phân lập vi khuẩn Gluconacetobacter 255

Hình 3.2 Vòng phân giải CaCO3 277

Hình 3.3 Chuyển hóa ethanol thành acid acetic của vi khuẩn acetic 277

Hình 3.4 Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter 299

Hình 3.5 Hình thái tế bào vi khuẩn Gluconacetobacter khi nhuộm Gram × 1000 trên kính hiển vi quang học 299

Hình 3.6 Hình ảnh màng Biocellulose do chủng vi khuẩn T1 và T2 tạo ra trên môi trường lỏng 30

Hình 3.7 Khả năng tạo cellulose của các chủng G xylinus 30

Hình 3.8 Hoạt tính catalase 311

Hình 3.9 Màng Biocellulose sinh ra từ vi khuẩn Gluconacetobacter 322

Hình 3.10 Chủng vi khuẩn G xylinus T1 trên môi trường thạch nghiêng 333

Hình 3.11 Kết quả nhuộm Gram của G xylinus × 1000 trên kính hiển vi quang học 333

Hình 3.12 Khuẩn lạc chủng vi khuẩn G xylinus trên môi trường thạch đĩa 344

Hình 3.13 Chủng vi khuẩn G xylinus trên môi trường lỏng 344

Hình 3.14 Hoạt tính catalase 355

Hình 3.15 Khả năng oxy hóa acetat của vi khuẩn G xylinus 366

Hình 3.16 Kết quả nhuộm màng Biocellulose 366

Hình 3.17 Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 tới độ dày của màng Biocellulose 40 Hình3.18 Ảnh hưởng của MgSO4 H2O tới độ dày của màng Biocellulose 455

Hình 3.19 Màng Biocellulose thu được ở môi trường MT3 và môi trường đã chọn 466

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của Spirulina 5

Bảng 1.2 Thành phần vitamin trong Spirulina 6

Bảng 1.3 Thành phần khoáng trong Spirulina 7

Bảng 1.4 Thành phần acid amin trong Spirulina 7

Bảng 1.5 Các chất màu trong Spirulina 8

Bảng 1.6 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter theo Frateur 10

Bảng 3.1 Một số đặc tính của màng Biocellulose 311

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 377

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 422

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 444

Biểu đồ 3.1 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng glucose đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 388

Biểu đồ 3.2.Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4 đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 40

Biểu đồ 3.3 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 422

Biểu đồ 3.4 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả năng tạo màng Biocellulose cho chủng G xylinus T1 444

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1 ADP : adenozin diphosphate

2 ATP : Adenosine triphosphate

4 G xylinus : Gluconacetobacter xylinus

9 NADP : Nicotinamit adenozin đinucleotit phosphate

11 UGP :Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Màng Biocellulose được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn, có bản chất

là cellulose được liên kết với các tế bào vi khuẩn, màng này vừa có cấu trúc và đặc tính cơ học rất giống với cellulose của thực vật, nhưng lại có một số tính chất hóa lý đặc biệt như: độ bền cơ học và khả năng thấm hút nước cao; đường kính sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, khả năng polymer hóa lớn

Trên thế giới, màng Biocellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các

lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử

lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm Đặc biệt trong lĩnh vực y

học, màng Biocellulose đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong

quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị các bệnh tim mạch: làm mặt nạ dưỡng da cho con người [6]

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng Biocellulose còn là

vấn đề khá mới mẻ, chỉ mới được quan tâm gần đây Các nghiên cứu và công

bố về vấn đề này còn rất khiêm tốn Các nghiên cứu hiện mới dừng ở nghiên

cứu quá trình tạo màng Biocellulose ứng dụng trong sản xuất thạch dừa, làm

giá thể gắn kết tế bào vi khuẩn và làm màng trị bỏng [11]

Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Vi sinh khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập, tuyển chọn được chủng

Gluconacetobacter xylinus (G xylinus) có khả năng tạo màng Biocellulose với

năng suất và chất lượng tốt trên các nguồn nguyên liệu như: nước dừa, nước

gạo Hiện nay, đang tiến hành lên men tạo màng Biocellulose trên môi trường tảo xoắn Spirulina để ứng dụng vào việc làm mặt nạ dưỡng da cho con

người Tuy nhiên, do chưa có được nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình

Nhằm tìm ra nguồn dinh dưỡng phù hợp nhất cho quá trình tạo màng

Biocellulose của vi khuẩn G xylinus trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina, tôi quyết định tiến hành thực hiện đề tài: “Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới quá trình lên men tạo màng Biocellulose trong môi trường có

bổ sung tảo xoắn Spirulina”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố dinh dưỡng đến quá trình

hình thành màng Biocellulose trong môi trường có bổ sung tảo xoắn

Spirulina Từ đó, tìm ra nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình lên men

tạo màng Biocellulose trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn G xylinus

có khả năng lên men tạo màng Biocellulose trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina Kết quả nghiên cứu là dữ liệu góp phần bổ sung cho các nghiên cứu và ứng dụng của chủng vi khuẩn G xylinus trong đời sống

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tạo màng Biocellulose trên môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina

có triển vọng ứng dụng vào trong cuộc sống đặc biệt là lĩnh vực thẩm mỹ dưỡng da

4 Điểm mới của đề tài

Tìm được nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình lên men tạo màng

Biocellulose dai, mỏng và nhẵn trong môi trường có bổ sung tảo xoắn Spirulina gồm: Nguồn cacbon phù hợp là glucose 10-15 (g/l) Nguồn nitơ:

(NH4)2SO4 1,0-1,5 (g/l) Nguồn khoáng: KH2PO4 0-0,5 (g/l); MgSO4 7H2O 1,0-1,5 (g/l)

NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về tảo xoắn Spirulina

1.1.1 Lịch sử

Spirulina do nhà tảo học Deurben (người Đức) đặt năm 1827, dựa trên

hình thái của tảo là dạng sợi xoắn ốc (spiralis) [30]

Cũng vào năm 1827, Turpin lần đầu tiên phân lập được tảo Spirulina từ

nguồn nước tự nhiên Năm 1963, giáo sư Clement (người Pháp) đã nghiên

cứu thành công việc nuôi Spirulina ở qui mô công nghiệp Do hình dạng “lò

xo xoắn” với khoảng 5-7 vòng đều nhau không phân nhánh dưới kính hiển vi

nên được gọi là Spirulina với tên khoa học là tảo Spirulina platensis (bắt

nguồn từ chữ spire, spiral có nghĩa là “xoắn ốc”) và trước đây được coi là

thuộc chi Spirulina Thực ra, đây không phải là sinh vật thuộc tảo (algae) vì tảo thuộc sinh vật có nhân thật (Eukaryota) Spirulina thuộc vi khuẩn lam

(Cyanobacteria) nên chúng thuộc sinh vật nhân sơ hay nhân nguyên thủy (Prokaryote) [30]

1.1.2 Phân loại tảo Spirulina

Tảo là một nhóm vi sinh vật, nhưng chúng khác với vi khuẩn và nấm men ở chỗ chúng có diệp lục và có khả năng tổng hợp các chất hữu cơ từ chất

vô cơ dưới tác dụng ánh sáng mặt trời Tảo chia làm 9 ngành: tảo lam

(Cyanophyta); tảo lục (Chorophyta); tảo silic (Diatomea); tảo vàng ánh (Chysophyta); tảo giáp (Pynophyta); tảo mắt (Euglenophyta); tảo roi lệch

(Hererocontac); tảo đỏ (Rhodophyta); tảo nâu [5], [11]

Tảo Spirulina thuộc:

Ngành: Cyanophyta Lớp: Cyanophyceae

Bộ: Oscillatoriales Họ: Oscillatoriaceae Giống: Spirulina

1.1.3 Đặc điểm sinh học của tảo Spirulina

Tảo Spirulina có dạng xoắn lò xo khoảng 5-7 vòng đều nhau không

phân nhánh Đường kính xoắn khoảng 35-50 micromet, bước xoắn 60 micromet, chiều dài thay đổi có thể đạt 0,25mm Nhiều trường hợp tảo xoắn

Spirulina có kích thước lớn hơn Tảo là trung gian giữa vi khuẩn và tảo nhân

thực Người ta cho rằng tảo Spirulina giống với vi khuẩn hơn, do đó tảo

Spirulina còn có tên là vi khuẩn lam [5], [11]

Hình 1.1 Hình dạng tảo Spirulina dưới kính hiển vi [30]

1.1.3.1 Đặc điểm cấu tạo tế bào của tảo Spirulina

Là tảo lam đa bào dạng sợi, gồm nhiều hình trụ xếp không phân nhánh Mỗi tế bào của sợi có chiều rộng 5 μm, dài 2mm Không có lục lạp mà chỉ chứa thylacoid phân bố đều trong tế bào Không có không bào Không có nhân điển hình, vùng nhân không rõ, trong đó có chứa DNA (Hedeskog và Hifsten A.1980) Thành tế bào tảo gồm các lớp lipopolysaccharide, các sợi nhỏ protein và các phân tử peptidoglucan Màng tế bào nằm sát ngay dưới thành tế bào và nối với màng quang hợp thylacoid tại một vài điểm

Spirulina có chứa 3 nhóm sắc tố chính: Chlorophyll hấp thụ ánh sáng

lam và đỏ Carotenoid hấp thụ ánh sáng lam và lục Phycobillin hấp thụ ánh sáng lục, vàng và da cam

1.1.3.2 Sinh sản của tảo Spirulina Spirulina có phương thức sinh sản vô tính, từ một cơ thể mẹ trưởng

thành (gọi là trichome), tự phân chia thành nhiều mảnh, mỗi mảnh gồm một

số vòng xoắn (2-4 tế bào, gọi là hormogonia) Để tạo thành các hormogonia,

sợi Spirulina sẽ hình thành các tế bào chuyên biệt cho sự sinh sản (gọi là đoạn

necridia) Các necridia hình thành các đĩa lõm ở hai mặt và tạo ra hormogonia bởi sự chia cắt tại vị trí các đĩa Khi đã phát triển, dần dần phần đầu hormogonia bị tiêu giảm và trở nên tròn nhưng vách tế bào vẫn có chiều dày không đổi Các hormogonia phát triển, trưởng thành và chu kì sinh sản lặp lại

để đảm bảo vòng đời của Spirulina [10], [11], [22]

1.1.3.3 Thành phần hóa học của tảo Spirulina Spirulina chứa hàm lượng protein rất cao và chứa đầy đủ các vitamin Spirulina có giá trị dinh dưỡng cao vì chứa hàm lượng protein cao và các chất

có hoạt tính sinh học khác Giá trị protein trung bình của Spirulina là 65%, cao hơn so với nhiều loại thực phẩm Bảng thành phần hóa học của Spirulina

được liệt kê trong bảng 1.1:

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của Spirulina [11],[29]

Spirulina là nguồn giàu vitamin B12 nhất Ngoài ra, Spirulina còn chứa

các vitamin khác như A, B1, B2, B6, E và H (Fox, 1986) Spirulina cung cấp

21% thiamin và riboflavin so với nhu cầu hàng ngày Thành phần vitamin của

Spirulina được liệt kê trong bảng 1.2:

Bảng 1.2 Thành phần vitamin trong Spirulina [24],[29]

Vitamin Trên 10g Nhu cầu hàng ngày

Spirulina giàu sắt và calcium, hỗ trợ tốt cho máu, cho xương và răng

Lượng calcium của Spirulina cao hơn trong sữa Lượng sắt trong Spirulina

cao hơn 12 lần so với trong các loại thực phẩm khác Thành phần khoáng của

Spirulina được liệt kê trong bảng 1.3:

Bảng 1.3 Thành phần khoáng trong Spirulina [24], [29]

Khoáng Trên 10 g Nhu cầu hàng ngày % so với nhu cầu hàng ngày

Bảng 1.4 Thành phần acid amin trong Spirulina [11], [29]

Acid amin thiết yếu

Hàm lượng trong 10 g

% tổng Các Acid amin

khác

Hàm lượng trong 10 g

% tổng

Phenylalanine 280 µg 4,5 % Glycine 320 µg 5,2 % Threonine 320 µg 5,2 % Histidine 100 µg 1,6 % Tryptophan 90 µg 1,5 % Proline 270 µg 4,3 %

Các chất màu trong Spirulina: Spirulina có màu xanh lam-lục là do

Spirulina chứa nhiều sắc tố với hàm lượng cao như chlorophyll, phycocyanin,

β-caroten Các chất màu trong Spirulina được thể hiện trong bảng 1.5:

Bảng 1.5 Các chất màu trong Spirulina [11], [29]

Chất màu Màu sắc Hàm lượng trong 10 g % Spirulina

Như vậy, chúng ta nên sử dụng tảo xoắn Spirulina cho hướng nghiên cứu tìm hiểu về nguồn dinh dưỡng lên men tạo màng Biocellulose

1.2 Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconacetobacter trong sinh giới

1.2.1 Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới

Đã có rất nhiều công trình phân loại vi khuẩn acetic như Rothenback

1898, Beijerinck 1898, Hoyer 1899, Hansen 1911, Heneberg 1926, Fraterur

1950 Thuật ngữ “Gluconacetobacte” được dùng đầu tiên cho cấp độ phân loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984) nhận

thấy các thành phần ubiquinone chính trong thành phần màng tế bào vi khuẩn sinh acetic khác nhau

Gluconacetobacter thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonasdaceae, bộ Pseudomonasdales, lớp Schizomycetes

Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn

Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điểm khác nhau Vì vậy,

đòi hỏi cần nhiều nghiên cứu hơn nữa về loại vi khuẩn này

1.2.2 Đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter

Đặc điểm hình thái - tế bào học

Chủng Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích

thước khoảng 2 μm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo váng nhăn và dày Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iôt sẽ bắt màu xanh (do phản ứng của hemicellulose), chúng có thể tích luỹ 4,5% acid acetic trong môi trường Khi nồng độ acid acetic cao vượt giới hạn cho phép, nó ức chế hoạt động của vi khuẩn

Đặc điểm nuôi cấy

Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Gluconabacter hình thành khuẩn

lạc nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phẳng hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong suốt, khuẩn lạc bằng phẳng hoặc lồi lên dễ tách khỏi môi trường

Vi khuẩn Gluconacetobacter khi nuôi cấy trong môi trường dịch thể ở điều

kiện tĩnh, chúng sẽ hình thành trên bề mặt một lớp màng cellulose, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với các phân tử cellulose, trong tế bào xảy ra quá trình trao đổi chất nói chung còn ở màng cellulose xảy ra quá trình trao đổi oxy và các chất dinh dưỡng [5], [20]

Ngược lại trong điều kiện nuôi lắc, cellulose hình thành dạng nhỏ với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trường dinh dưỡng tạo ra những đặc tính hình thái khác hẳn cellulose trong điều kiện nuôi cấy tĩnh

Đặc điểm sinh lý - sinh hóa

Đặc điểm sinh lý

Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25 - 35oC, pH = 4 -

6 Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống Ở 37oC, tế bào sẽ suy thoái

hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu Gluconacetobacter có khả năng

chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic và môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ

Đặc điểm sinh hóa Năm 1950, Fruteur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ

vào các tiêu chuẩn: khả năng oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt

tính catalase; Gluconacetobacter là chủng thuộc chi Acetobacter, họ

Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadaceae, lớp Schizomycetes Đặc điểm

phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi được trình bảng dưới đây:

Bảng 1.6 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn Gluconacetobacter

theo Frateur

quả

1

Oxy hóa ethanol thành acid acetic Chuyển hóa môi trường chứa

Bromphenol Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng

+

2 Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí +

3 Sinh trưởng trên môi trường Hoyer Sinh khối không phát triển -

4 Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton

Tạo kết tủa đỏ gạch trong dịch sau

5

Chuyển hóa glucose thành acid Vòng sáng xuất hiện xung quanh

khuẩn lạc trên môi trường chứa CaCO 3

+

6 Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu Không hình thành sắc tố nâu -

7 Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose

Váng vi khuẩn xuất kiện màu lam

+

1.3 Đặc điểm và cơ chế hình thành màng Biocellulose

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc của màng Biocellulose

Màng Biocellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β - 1,4

glucopyranose mạch thẳng Nó có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính của nó lại khác xa nhau

Chuỗi polyme β - 1,4 glucopyranose mới hình thành liên kết với nhau

tạo thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm Những sợi nhỏ kết tinh tạo

sợi lớn hơn - sợi vĩ mô, những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bó và cuối

cùng tạo dải lớn Những dải lớn từ tế bào này khi đẩy ra ngoài sẽ liên kết với những dải lớn của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc vandesvan tạo thành dạng sệt (gel) hay một lớp màng mỏng Kích thước bên của màng tăng lên khi quần thể vi khuẩn sinh trưởng [8], [9], [23]

Màng Biocellulose có cơ chế kết tinh khác hẳn cellulose của thực vật ở

chỗ chúng không có sự kết hợp hemixellulose, lignin hay những thành phần phụ khác mà được cấu tạo từ các sợi microfibil tạo nên những bó sợi song song cấu thành mạng lưới cellulose [1]

Hình 1.2 Sợi cellulose của màng Biocellulose

1.3.2 Một số tính chất của màng Biocellulose

Chung và Shyu (1999) đã nghiên cứu tính chất của Biocellulose như độ

cứng, độ dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dịch đường, muối lên tính chất

của Biocellulose [20] Các mảnh Biocellulose có độ cứng là 3,68 kg/cm2 Độ

cứng của các miếng Biocellulose giảm khi chúng được nhúng vào dung dịch

đường và độ cứng tăng lên khi được nhúng bằng dung dịch muối Sản phẩm của cellulose vi khuẩn có một số tính chất sau:

Độ bền hóa học, độ bền cơ học và sức căng cao

Khả năng giữ nước và độ ẩm cao, do đó có thể điều chỉnh độ xốp

Có thể theo dõi, kiểm soát lý tính của cellulose do cấu trúc của cellulose vi khuẩn có khả năng biến đổi trong quá trình nuôi cấy

Kiểm soát được kích thước, cấu trúc và chất lượng của cellulose (kiểm

soát được cellulose kết tinh dị hình) trong quá trình nuôi cấy tạo cellulose

Cellulose vi khuẩn là cellulose sinh học duy nhất được tổng hợp mà không gắn lygnin, có thể dễ dàng phân hủy bởi một số nhóm vi sinh vật Vì vậy, cellulose vi khuân được xem là nguồn vật liệu mới có nhiều ưu thế trong tương lai [8], [12]

1.3.3 Cơ chế tổng hợp Biocellulose

Quá trình tổng hợp Biocellulose là một tiến trình bao gồm nhiều bước

được điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp xúc tác các loại protein điều hòa [15], [17]

Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 ennzyme tham gia

xúc tác tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter: Glucokinase,

Phosphoglucomutase, Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase (UDPG pyrophosphorylase hay UGP), Cellulose synthase (CS) Trong đó UGP à enzyme có vai trò quan trọng nhất

Hình 1.3 Con đường sinh tổng hợp cellulose ở Gluconacetobacter

1.4 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter

Để đảm bảo hoạt động sống bình thường của vi khuẩn, môi trường thức

ăn ngoài rượu, nước còn phải cung cấp thêm muối khoáng, nguồn cacbon,

nguồn nitơ dễ hấp thụ như: CaHPO4, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, MgSO4 7H2O,

KH2PO4,… tùy thuộc nhu cầu cụ thể của từng loài [26]

1.4.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong các phân tử enzim, acid nucleic và sản phẩm trao đổi chất Vì vậy, hợp chất hữu cơ chứa cacbon

có ý nghĩa quan trọng trong đời sống vi sinh vật Người ta dùng đường làm nguồn cung cấp cacbon chủ yếu cho phần lớn vi sinh vật dị dưỡng Để tránh hiện tượng ở nhiệt độ cao và trong môi trường kiềm đường bị chuyển hóa khi khử trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5 atm 1100 trong 30 phút Để nuôi cấy vi khuẩn thường dùng 0,2 – 0,5% đường Hầu hết các vi khuẩn chỉ đồng hoá được các loại đường ở dạng đồng phân D

1.4.2 Nhu cầu nitơ của vi sinh vật

Ý nghĩa chủ yếu của nguồn nitơ là cung cấp cho cơ thể sinh vật nguyên liệu để hình thành các nhóm amin (-NH2 và -NH-) trong các phân tử aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên sinh chất [25]

Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+ Vi sinh vật có khả năng đồng hóa rất tốt nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ Do đó

khi nuôi cấy vi khuẩn Gluconacetobacter người ta thường sử dụng nguồn

nitơ vô cơ là (NH4)2SO4, NH4NO3, nguồn nitơ hữu cơ là peptone, cao thịt, cao nấm men [25]

1.4.3 Nguồn dinh dưỡng khoáng

Phospho chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các nguyên tố khoáng của tế bào

vi sinh vật Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng phospho, người ta dùng các loại phospho vô cơ: KH2PO4, K2HPO4, KNO3 Bổ sung phosphat các môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra tính đệm của môi trường

Ngoài ra, còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai trò ảnh hưởng đến

như Mg, Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl… Nếu thiếu một trong số các nguyên tố này

thì chủng Gluconacetobacter không sinh trưởng và phát triển bình thường

1.4.4 Các chất kích thích sinh trưởng

Các vitamin pyridoxine, acid nicotinic, p-aminobenzoic acid (pABA), biotin được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp cellulose, trong khi pantothenate và riboflavin cho kết quả ngược lại [18],

[21], [26]

Nước dừa già là nguồn nguyên liệu chủ yếu được sử dụng để nuôi cấy

Gluconacetobacter thu màng Biocellulose Tùy theo giống dừa, tuổi của quả

dừa mà các thành phần hoá học trong nước dừa có khác nhau Lượng đường khử tổng và protein trong nước dừa tăng lên khi dừa càng chín (cao nhất là vào tháng thứ 9, sau đó giảm dần) Đường ở đây có thể là glucose, fructose, sucrose hay sorbitol Ngoài ra, nước dừa có nhiều khoáng chất, vitamin, acid

amin… phù hợp cho quá trình sinh trưởng và hình thành màng Biocellulose của vi khuẩn Gluconacetobacter [1], [18]

1.5 Tình hình nghiên cứu và sản xuất màng Biocellulose hiện nay

1.5.1 Trên thế giới

Vi khuẩn G xylinus và màng Biocellulose đã thu hút được sự chú ý của

nhiều nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực

Trong công nghệ thực phẩm, sử dụng chủng G xylinus tạo màng Biocellulose dày để sản xuất thạch dừa, màng Biocellulose để bảo quản thực phẩm Trong công nghiệp giấy, màng Biocellulose được dùng để sản xuất giấy chất lượng

cao, dùng để làm màng lọc nước trong công nghệ môi trường, làm chất mang đặc biệt cho các pin và tế bào năng lượng Trong lĩnh vực mỹ phẩm, màng

Biocellulose được dùng làm mặt nạ dưỡng da Trong lịnh vực y học, màng Biocellulose bước đầu được nghiên cứu làm màng trị bỏng, da nhân tạo thay

thế tạm thời, mạch máu nhân tạo… Các nghiên cứu hiện nay về màng

Biocellulose trên thế giới đã tập trung vào vấn đề sản xuất và ứng dụng các

sản phẩm từ màng Biocellulose vào các lĩnh vực khác nhau

Nghiên cứu về màng Biocellulose từ vi khuẩn G xylinus và những

ứng dụng của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới Đặc biệt, trong

y học, người ta đã chế tạo các phức chất (vật liệu composite) từ sự kết hợp giữa cellulose và chitosan, hoặc cellulose và polyvinyl, các phức chất này được sử dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét

da, làm mạch máu điều trị các bệnh tim mạch

Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng trong phẫu thuật và nha khoa Ngoài ra, màng BC còn được sử dụng làm mặt

nạ dưỡng da cho phụ nữ, làm giấy chất lượng cao, microbial cellulose được dùng chế tạo màn hình điện tử, vải nonwoven (vải không qua dệt), thực phẩm phụ gia, làm cơ chất để cố định protein hay cho sắc kí, …

Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm Czaja và cs, (2006) sử dụng màng

BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [26], [29]

1.5.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về G xylinus và màng

Biocellulose ngày càng được nhiều tác giả quan tâm Ngày càng có nhiều các

nghiên cứu, công bố liên quan đến chủng G xylinus sự hình thành màng

Biocellulose và ứng dụng màng Biocellulose Các công trình nghiên cứu mới

chỉ quan tâm tới quá trình tạo màng, đặc tính và cấu trúc của màng Về ứng dụng thực tiễn, mới chỉ được ứng dụng trong chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng, và được ứng dụng trong sản xuất thạch dừa [6], [8], [13], [17]

Hiện nay việc nghiên cứu tìm môi trường tối ưu cho quá trình tạo màng của vi

khuẩn Gluconacetobacter chưa được thực hiện Hầu như có rất ít các nghiên cứu liên quan đến sự hình thành Biocellulose và ứng dụng màng Biocellulose

Việc nghiên cứu và sử dụng màng Biocellulose từ chủng G xylinus

ngày càng được nhiều tác giả quan tâm Ngày càng có nhiều các nghiên cứu,

công bố liên quan đến chủng G xylinus sự hình thành màng Biocellulos và các hướng ứng dụng màng Biocellulose Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn

Thanh, Trưởng bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh, Trường đại học Y Dược học Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học dầu mù u bằng

phương pháp lên men Màng Biocellulose có khả năng thấm nước cao, kết

dính chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thể thay thế da tạm thời Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều

có nguồn gốc thiên nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích ứng da [6], chính vì vậy dùng màng sinh học để ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thương bỏng, tạo điều kiện che phủ sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời gian điều trị và giảm thiểu sẹo xấu trên vùng bỏng sâu

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu và hóa chất

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng Gluconacetobacter nhận từ phòng Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN,

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Dịch tảo xoắn Spirulina

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

2.1.2.1 Thiết bị

Trong quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tôi đã sử dụng những dụng

cụ thiết bị như: nồi hấp khử trùng, tủ sấy (Haraeus, Đức), box cấy vô trùng (Haraeus, Đức), cân điện tử (Precica XT 320 M, Thụy Sỹ), micropipep (Gilson, Pháp), tủ lạnh (Tawasi, Nhật), kính hiển vi quang học (olympus

CX41, Nhật), hộp lồng, ống nghiệm, pipet, bàn trang thủy tinh, bình tam giác, lam kính, la men, đèn cồn,… và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác

Tất cả các dụng cụ, thiết bị và hóa chất trên đều do phòng Vi sinh, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp

2.1.2.2 Hóa chất

- Nguồn đường: glucose, saccarose, ethanol, fructose, sorbitol

- Nguồn nitơ:

+ Nguồn nitơ vô cơ: (NH4)2SO4

+ Nguồn nitơ hữu cơ: pepton, cao thịt

- Một số hóa chất vô cơ: KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH

- Một số loại thuốc nhuộm: tím gentian, dung dịch fushsin, dung dịch lugol

- Nước dừa, agar,…

2.1.3.2 Môi trường nhân giống (MT2)

Dịch tảo xoắn Spirulina: 1000 ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Phân lập tuyển chọn chủng G xylinus theo phương pháp truyền thống (Phương pháp Vinogradski và Beijerinck)

Nguồn vật liệu: từ dịch tảo xoắn Spirulina cho lên men tự nhiên từ 10

đến 12 ngày tạo thành một lớp màng trắng, mỏng trên bề mặt dịch nuôi cấy

Từ các màng thu được, dùng đũa thuỷ tinh vô trùng vớt màng, lấy một lượng nhỏ màng, rửa qua bằng nước cất vô trùng cho vào ống nghiệm chứa nước cất thanh trùng, vontex đều, thu được ống nghiệm chứa mẫu màng gốc

Chuẩn bị 10 ống nghiệm có đậy nút bông, sấy vô trùng, cho vào mỗi ống nghiệm 9 ml nước cất, đậy nút bông, hấp thanh trùng trong nồi hấp giữ ở

1210C, 1atm trong thời gian 15 phút Chuyển vào bốc cấy vô trùng, dùng pipet vô trùng hút 1 ml dịch từ ống nghiệm chứa mẫu màng gốc cho vào ống nghiệm thứ nhất, đậy nút bông, vontex trong 5 phút, thu được ống nghiệm chứa dịch pha loãng mức 10-1 Tiếp tục hút 1ml dịch ở ống có độ pha loãng

10-1 cho vào ống nghiệm thứ hai, thu được dịch pha loãng ở mức 10-2 Tiếp tục pha loãng ở các độ pha loãng 10-3; 10-4…;10-7 Căn cứ vào số lượng vi khuẩn có ở trong mẫu, chúng tôi chọn các mẫu ở độ pha loãng 10-4 - 10-7 để tiến hành các bước tiếp theo

Phương pháp phân lập trên môi trường thạch đĩa: chuẩn bị môi trường

1 đã hấp khử trùng, đổ môi trường thạch đĩa Dùng pipet vô trùng hút 100ml dịch màng đã chuẩn bị ở trên (với các độ pha loãng 10-4 - 10-7) nhỏ vào các hộp lồng đã chứa môi trường thạch, dùng que trang thủy tinh trang đều trên khắp bề mặt thạch Đặt ngược các hộp lồng, bao gói cẩn thận, để trong tủ ấm

300C, sau 3 – 4 ngày lấy ra quan sát khuẩn lạc (hình thái, kích thước, màu sắc,

độ trơn bóng, viền mép khuẩn lạc, vòng phân giải CaCO3)

Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO3), tách các khuẩn lạc riêng rẽ từ hộp lồng, cấy chuyển vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng đã khử trùng, nuôi trong tủ ấm ở 300C Sau 3 – 4 ngày, quan sát, làm tiêu bản nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm gram [16]

2.2.1.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái và cách sắp xếp tế bào trên tiêu bản nhuộm kép

Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam kính, cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram [16]:

9 Đưa lên vật kính 5 – 40 quan sát sau đó đưa tiêu bản dưới vật kính dầu 100 với độ phóng đại 1000 lần Nếu tế bào vi khuẩn nhuộm có màu hồng

là Gram âm, đó chính là vi khuẩn Gluconacetobacter

2.2.1.3 Phương pháp bảo quản chủng giống trên môi trường thạch nghiêng

Các chủng giống sau khi phân lập và sơ bộ xác định là

Gluconacetobacter được cấy trên môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ

CaCO3), nuôi trong tủ ấm 3 - 4 ngày ở 300C Sau đó, giữ lạnh ở tủ 40C để bảo

quản giống Cấy truyền giữ giống trên môi trường thạch nghiêng hai tháng

một lần [11], [15], [17]

2.2.1.4 Phương pháp hoạt hoá giống

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật

cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu

chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1100 trong 20 phút Sau đó

đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy truyền giống từ ống thạch nghiêng vào

và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [5], [11], [16]

2.2.1.5 Phương pháp lên men tạo màng Biocellulose

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 1100C trong 20 phút để tránh phân rã đường Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong

15 phút Bổ sung vào môi trường 10% giống hoạt hoá Nuôi cấy ở điều kiện

tĩnh trong 4 - 8 ngày [8], [9], [10]

2.2.2 Phương pháp hóa sinh

2.2.2.1 Phương pháp kiểm tra hoạt tính catalase

Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +)

Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -) [16]