Hoàn thiện quá trình lên men kombucha từ trà phú thọ

Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 4 chủng vi khuẩn Acetobacter .... Các sản phẩm phụ khác được hình thành, bao gồm acid gluconic, acid lactic, các loại v

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

Khoa Sinh – KTNN - -

HÀ NỘI, 2016

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và tiến hành thực hiện đề tài: “Hoàn thiện

quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ”, em đã nhận được sự hướng

dẫn, giúp đỡ tận tình, quý báu của các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:

TS Phương Phú Công và PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo, động viên và cho em nhiều ý kiến quý báu, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện đề tài tốt nghiệp này

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân, những người luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài

Hà Nội, tháng năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Chung

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật Đây

là kết quả của riêng em Tất cả các số liệu trong bảng biểu và hình ảnh đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố dưới sự hướng dẫn của TS Phương Phú Công và PGS TS Đinh Thị Kim Nhung

Trong đề tài, em có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác,

em xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Chung

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

6.1 Ý nghĩa khoa học 3

6.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

7 Đóng góp của đề tài 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Sản phẩm kombucha 4

1.1.1 Sơ lược về nguồn gốc và sản phẩm kombucha 4

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo 5

1.1.3 Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men kombucha 6

1.1.3.1 Vi khuẩn acetic 6

1.1.3.2 Nấm men 7

1.1.3.3 Vi khuẩn lactic 9

1.1.4 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha 9

1.1.5 Thành phần hóa học và công dụng của trà kombucha 12

1.1.5.1 Thành phần hóa học của trà kombucha 12

1.1.5.2 Công dụng của kombucha 12

1.1.5.3 Một số lưu ý khi sử dụng trà 13

1.2 Nguồn nguyên liệu trà Phú Thọ 14

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 14

1.3.1 Trên thế giới 14

1.3.2 Ở Việt Nam 16

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 18

2.1.1 Vi sinh vật 18

2.1.2 Thiết bị và hóa chất 18

2.1.2.1 Thiết bị 18

2.1.2.2 Hóa chất 18

2.1.3 Môi trường 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Phương pháp vi sinh 19

2.2.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn và nấm men theo phương pháp Vinogradski 19

2.2.1.2 Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản 20

2.2.1.3 Bảo quản chủng giống 21

2.2.1.4 Phương pháp hoạt hóa giống 22

2.2.1.5 Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men 22

2.2.2 Phương pháp hóa sinh 22

2.2.2.1 Phát hiện hoạt tính catalase 22

2.2.2.2 Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic 23

2.2.2.3 Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose 23

2.2.2.4 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị 23

2.2.2.5 Xác định đường sót 23

2.2.2.6 Phương pháp kết lắng 24

2.2.2.7 Xác định hàm lượng vitamin C 24

2.2.3 Phương pháp cảm quan 25

2.2.4 Phương pháp toán học 27

CHƯƠNG 3 28

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Phân lập chủng vi khuẩn, nấm men lên men kombucha từ trà Phú Thọ 28

3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter lên men kombucha từ trà Phú Thọ 28

3.1.2 Phân lập chủng nấm men lên men kombucha từ trà Phú Thọ 30

3.1.2.1 Phân lập 30

3.1.2.2 Nhuộm đơn để quan sát hình dạng tế bào 30

3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha

từ trà Phú Thọ 31

3.2.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha 31

3.2.1.1 Xác định hàm lượng acid tổng số được tạo ra của mỗi

chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn 31

3.2.1.2 Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha được lên men từ

4 chủng vi khuẩn 32

3.2.2 Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men

kombucha 32

3.2.2.1 Hoạt lực lên men 32

3.2.2.2 Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha được lên men từ 7 chủng nấm men 33

3.3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter A3 và chủng nấm men Saccharomyces M4 34

3.3.1 Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter A3 34

3.3.2 Động thái sinh trưởng của chủng nấm men M4 35

3.4 Xác định nguồn cacbon thích hợp lên men kombucha từ trà Phú Thọ 37

3.5 Tìm một số điều kiện thích hợp cho quá trình lên men kombucha

từ trà Phú Thọ 40

3.5.1 Hàm lượng giống bổ sung 41

3.5.2 Nhiệt độ lên men 43

3.5.3 pH ban đầu 45

3.5.4 Xác định thời gian lên men và thu mẫu sản phẩm kombucha

từ trà Phú Thọ 47

3.6 Hoàn thiện quy trình lên men và bảo quản sản phẩm kombucha từ trà Phú Thọ quy mô phòng thí nghiệm 50

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

1 Kết luận 54

2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trà kombucha 12

Bảng 2.1 Công thức các loại môi trường 19

Bảng 2.2 Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 25

Bảng 2.3 Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu 26

Bảng 2.4 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha 26

Bảng 3.1 Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 4 chủng vi khuẩn Acetobacter 31

Bảng 3.2 Chất lượng cảm quan trà kombucha lên men từ 4 chủng vi khuẩn Acetobacter 32

Bảng 3.3 Chất lượng cảm quan trà kombucha lên men từ 7 chủng nấm men 33

Bảng 3.4 Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter A3 34

Bảng 3.5 Động thái sinh trưởng của chủng nấm men M4 36

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sản phẩm kombucha 5

Hình 1.2 “Con nấm” (SCOBY) 6

Hình 1.3 Sơ đồ phân giải đường thành rượu nhờ nấm men 10

Hình 3.1 Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn A1 (x1000 lần) 28

Hình 3.2 Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn A3 (x1000 lần) 28

Hình 3.3 Hình thái tế bào của chủng nấm men M1 (x1000 lần) 30

Hình 3.4 Hình thái tế bào của chủng nấm men M4 (x1000 lần) 30

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn lượng CO2 thoát ra 33

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter A3 35

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng nấm men M4 36

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH, acid tổng số, ethanol ở các pH khác nhau 37

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đường sót các mức đường bổ sung khác nhau 38

Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm theo mức đường bổ sung khác nhau 38

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH, acid tổng số, ethanol ở các hàm lượng giống bổ sung khác nhau 41

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đường sót ở các hàm lượng giống bổ sung khác nhau 42

Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm ở các hàm lượng giống bổ sung khác nhau 42

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH, acid tổng số, ethanol,

vitamin C ở các nhiệt độ khác nhau 44 Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đường sót ở các

nhiệt độ khác nhau 44Hình 3.16 Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm ở các nhiệt độ

khác nhau 45

Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên acid tổng số, ethanol, vitamin C

ở các nhiệt độ khác nhau 46 Hình 3.18 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đường sót ở các pH khác nhau 46Hình 3.19 Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm ở các pH

khác nhau 47

Hình 3.20 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên pH acid tổng số, ethanol ở

thời gian lên men khác nhau 48 Hình 3.21 Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đường sót ở các

thời gian khác nhau 48Hình 3.22 Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm ở các

thời gian lên men khác nhau 49

BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

1 ATP Adenozin triphotphat

3 SCOBY Symbiotic colony of Bacteria and Yeast

4 NADP Nicotiamide adenine

7 MT Môi trường

8 SLTB Số lượng tế bào

dễ uống nên được dùng như 1 loại nước giải khát Đây là một cấu trúc có dạng như thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn Ở Nhật Bản, Nga, Trung Quốc và nhiều nước Đông Âu, Kombucha được sử dụng phổ biến

Đã có rất nhiều nghiên cứu khoa học chứng minh tác dụng có lợi đối với sức khỏe con người từ kombucha Vi khuẩn và nấm men trong trà kombucha thể hiện mối quan hệ cộng sinh rất chặt chẽ, có thể ngăn chặn sự phát triển của nhiều vi sinh vật tạp nhiễm Trong quá trình lên men, nấm men phân giải đường sucrose thành fructose và glucose, sinh khí CO2 và ethanol Một phần lượng ethanol sinh ra sẽ được oxi hóa bởi vi khuẩn acid acetic tạo sản phẩm chính là acid acetic Các sản phẩm phụ khác được hình thành, bao gồm acid gluconic, acid lactic, các loại vitamin, phối hợp với các hợp chất thơm như aldehyde, amino acid, cùng với các poly phenol có trong trà tạo nên hương vị rất đặc biệt của trà kombucha Ngoài ra trong quá trình lên men một lượng kháng sinh nhỏ cũng được tổng hợp, kết hợp với các thành phần khác tạo nên nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe người dùng

Ở Việt Nam trà là loại đồ uống khá gần gũi và phổ biến với người dân, tuy nhiên đối với các dòng sản phẩm lên men từ trà thì còn khá mới mẻ đối với người tiêu dùng Mặc dù nước ta có tiềm năng rất lớn về nguồn nguyên

2

liệu và thị trường tiêu thụ Việc lên men trà kombucha trước đây mới chỉ manh nha xuất hiện ở một số hộ gia đình với qui mô nhỏ lẻ, thủ công Bên cạnh đó các cơ sở sản xuất lại chưa đưa ra được những minh chứng khoa học cho sản phẩm của mình làm cho sản phẩm kombucha rất khó cạnh tranh trên thị trường

Khác với các sản phẩm lên men thông thường, kombucha là sản phẩm tổng hợp của nhiều quá trình lên men Chất lượng và thành phần của kombucha cũng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố Trong đó lựa chọn được chủng giống và nguồn nguyên liệu trà là yếu tố đầu tiên cho quá trình sản xuất kombucha Trong vài năm trở lại đây tại Việt Nam đã có những nghiên cứu lên men kombucha từ các loại trà khác nhau như trà Thái Nguyên, trà Tuyên Quang, San Tuyết Hà Giang Tuy nhiên, các đề tài nghiên cứu kombucha từ

trà Phú Thọ còn hạn chế Vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Hoàn thiện

quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ”.

2 Mục tiêu của đề tài

Hoàn thiện quy trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ tạo sản phẩm

trà đạt chất lượng tốt

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ

3.2 Xác định hàm lượng đường sucrose thích hợp cho quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ

3.3 Tìm một số điều kiện thích hợp cho quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ

3.4 Hoàn thiện qui trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ quy mô phòng thí nghiệm.

3

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ

5 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp vi sinh: Phương pháp phân lập vi khuẩn, nấm men và quan

sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram; phương pháp đếm số lượng tế bào vi sinh vật; phương pháp bảo quản chủng giống; Phương pháp xác định hoạt

lực lên men của nấm men…

Phương pháp hóa sinh: Phát hiện hoạt tính catalase; phát hiện khả năng

oxy hoá acid acetic; phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng

chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị…

Đã tuyển chọn được chủng vi khuẩn Acetobacter A3 và chủng nấm men

Saccharomyces M4 có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ; Đã xác định được nhiệt độ: 300C, pH: 4, hàm lượng giống bổ sung ban đầu : 10%, hàm lượng đường sucrose: 100g/l là điều kiện thích hợp cho quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ; Hoàn thiện quy trình lên men và bảo quản sản phẩm trà kombucha quy mô phòng thí nghiệm

4

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Sản phẩm kombucha

1.1.1 Sơ lược về nguồn gốc và sản phẩm kombucha

Trà kombucha là một sản phẩm được bắt nguồn từ phương Đông cũng

có thể là từ Trung Quốc cách đây khoảng 2000 năm Loại nước uống len men này biết đến đầu tiên ở Trung Quốc từ 221 trước Công Nguyên tên gọi là thủy hoài sâm và được xem như một loại thần dược

Trà kombucha đã trở nên phổ biến ở nhiều nước Đông Âu, Nga, Nhật Bản trong suốt nhiều thập kỉ qua Qui trình lên men kombucha được biết đến

ở Nga và Ukraine vào cuối những năm 1800 và trở nên phổ biến vào đầu năm

1900 Hệ vi sinh vật trong kombucha chỉ biết đến đó là một màng nấm (tea mushroom), và tên gọi của loại đồ uống này là kvass trà Đối với các gia đình người Nga từ ngày đó đến nay trà kombucha được xem như một loại nước uống phổ biến và dùng để chữa bệnh Tại đất nước Nhật Bản, trà kombucha được biết đến vào những năm 415 sau Công Nguyên Một bác sĩ người Đại Hàn có tên là Kombu đã sử dụng sản phẩm lên men trà để chữa bệnh và cái tên kombucha bắt nguồn từ đó, đó là sự kết hợp giữa tên của ông vớí

“cha”(trà) Sau đó kombucha phổ biến dần dần đến Phần Lan, Đức, Đan Mạch Nhưng nó bị lãng quên trong suốt chiến tranh thế giới thứ 2 Sau chiến tranh thế giới thứ 2, nó được bác sĩ Rudolph Skelnar phục hồi lại tại Đức khi ông sử dụng nó để thử nghiệm trong điều trị cho bệnh nhân ung thư, rối loạn chức năng, cao huyết áp và đái tháo đường

Từ năm 1852 kombucha mặc dù được sử dụng khá phổ biến nhưng những công trình nghiên cứu trên thế giới phần lớn tập trung đến việc xác định thành phần vi sinh vật, thành phần hóa học và phương pháp lên men

5

nhưng việc nghiên cứu tác dụng, dược tính của trà kombucha đối với sức khỏe con người vẫn còn rất hạn chế Trong những năm gần đây các nhà khoa học trên thế giới đang đi theo hướng nghiên cứu, chứng minh tác dụng có lợi đối với sức khỏe con người khi sử dụng kombucha Sản phẩm kombucha đã được chứng minh chứa rất nhiều hợp chất có lợi cho sức khỏe người sử dụng như: các acid hữu cơ, các vitmin nhóm B, vitamin C và các acid amin tự do Các công trình nghiên cứu đã được thực nghiệm trên chuột và các dòng tế bào

ở người hay thông qua các cuộc điều tra, khảo sát về tác dụng có lợi của kombucha đã được công bố

Hình 1.1 Sản phẩm kombucha 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo

Kombucha là môi trường cộng sinh của vi khuẩn và nấm men Hệ vi

sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng Acetobacter như: Acetobacter xylinum, Acetobacter xylinoides, Acetobacter Ketogenum…

và nấm men: Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus,

Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe… Ngoài ra còn có

thể có các chủng Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium

gluconicum… Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha Acetobacter

6

xylinum có khả năng tạo màng hemicellulose khá dày và chắc, tạo màu xanh

với thuốc nhuộm Iod và H2SO4 Nên kombucha trông giống một cái bánh dẹp, thường được gọi là “con nấm” hay SCOBY Kombucha sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đường, thường được sử dụng để lên men dung dịch trà đường Trong quá trình lên men, kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên

bề mặt dịch trà và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một lớp màng thứ hai (thường gọi là “nấm con”), tách biệt với lớp màng ban đầu ( “nấm mẹ”)

Hình 1.2 “Con nấm” (SCOBY) 1.1.3 Hệ vi sinh vật trong quá trình lên men kombucha

1.1.3.1 Vi khuẩn acetic

Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadieae, phân bố rộng

rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả… Có khoảng 20 loài

thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có

ý nghĩa kinh tế

Đặc điểm chung của chủng Acetobacter

Dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường

nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái

7

khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra Kích thước thay đổi tùy loài (0.3-0.6

x 1.0-8.0µm) Có thể di động, hoặc không di động Không sinh nha bào tử

Hiếu khí bắt buộc Chịu được độ acid cao Vi khuẩn Acetobacter có khả năng

đồng hóa nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột Tế bào đứng riêng rẽ hoặc kết thành từng chuỗi Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tùy loại:

Acetobacter xylinum: tạo thành váng cenllulose khá dày và chắc

Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc

Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo

Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã

Acetobacter curvum: sinh acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo thành

váng không chắc chắn

Acetobacter có khả năng đồng hóa muối (NH4)+ và phân giải pepton Một số đòi hỏi có acid amin nhất định như acid pntothenic và các chất khoáng

K, Mg, Ca, Fe, P, S…ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ Ngoài

khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng

hợp vitamin B1, vitamin B2, oxy hóa sorbit thành đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C)…

1.1.3.2 Nấm men

* Hình thái và cấu tạo

Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ…, thường có kích thước rất lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình: chiều dài: 9 – 10 m, chiều rộng: 2 – 7 m Hình dạng và kích thước

tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần

cơ bản sau:

8

Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau Chủ yếu là: glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin, volutin,…Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit enzyme permeraza…Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit, gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó Nhân tế bào Những bào quan khác: không bào, ty lạp thế, riboxom,…[5]

* Sự sinh sản của nấm men

Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: Sinh sản bằng cách nảy chồi; Sinh sản bằng cách phân đôi; Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử: Tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinh sản đơn tính

* Phân loại nấm men

Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi

imporfecti)

Lớp nấm men thật (Ascomyces): Phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces

Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti) bao gồm giống: Crytococus

(toscula, tornlopsis), Mycoderma, Eandida, Geotrichum, Rhodotorula

* Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men

Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon, nito, phospho, kali, magie,…

Dinh dưỡng Cacbon: Nguồn Cacbon cung cấp là các loại đường khác nhau: saccharose, maltose, lactose, glucose…Dinh dưỡng oxy, hydro: được cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch Dinh dưỡng Nitơ: Nấm men không có men ngoại bào để phân giải protid, nên không thể phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin,

9

pepton, amid, urê Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat…Các vitamin và chất khoáng: Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo

ra liên kết có năng lượng lớn Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và enzyme Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê

1.1.3.3 Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium Đây là những trực

khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không

có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5,5 ÷ 6, khi pH nhỏ hơn 5,5 quá trình lên men bị dừng lại Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 500C Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn

1.1.4 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha

Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá

trình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau:

* Lên men ethanol

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2 Quá trình lên men

10

rượu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối (với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối), thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2 (giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2) Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa theo chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic Tiếp theo acid pyruvic sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chất này có thể chuyển hoá thành glyxerol Trong môi trường pH acid, glycerol chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ Ngược lại, trong môi trường pH kiềm lượng glycerol sinh ra

sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men

Hình 1.3 Sơ đồ phân giải đường thành rượu nhờ nấm men

Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:

C6H12O6 + 2ADP +2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP

Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế bào chất của nấm men Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men trong điều kiện kỵ khí Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men thải vào môi trường lên men Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những

11

hợp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este Trong quá trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990) Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trình lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ

chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, acetic, lactic

* Lên men acetic:

Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dưới tác dụng của vi khuẩn

C2H5OH + O2 → CH3CHO (Acetaldehyde) + H2O

CH3CHO + H2O → CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyde)

CH3CH(OH)2 + O2 → CH3COOH + H2O

* Lên men lactic:

Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng Các phân tử ATP được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi hóa lý khác Bản chất là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật

Phương trình phản ứng:

C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + 94kcal

Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men đồng hình), acid acetic, ethanol, CO2 (lên men dị hình) trong dịch lên men còn xuất hiện cả trăm hợp chất hóa học mới khác Chúng là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men

12

Phương trình tổng quát:

C 6 H 12 O 6 CH 3 CHOHCOOH + CH 3 COOH + C 2 H 5 OH + COOH(CH 2 ) 2 COOH + CO 2

Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, nói chung thì acid lactic thường chiếm 40% lượng đường đã được phân hủy, acid succinic 20%, ethanol chiếm 10%, acid axetic 10% và các loại khí gần 20%

1.1.5 Thành phần hóa học và công dụng của trà Kombucha

1.1.5.1 Thành phần hóa học của trà Kombucha

Theo nghiên cứu của tổ chức The American FDA and CDC tỷ lệ các

chất hóa học có trong trà kombucha như sau:

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của trà kombucha

1.1.5.2 Công dụng của Kombucha

Hội nghị khoa học quốc tế tổ chức tại Nhật Bản năm 1997 đánh giá thuỷ sâm có 3 chất cơ bản mà nếu không có các chất ấy thì con người không thể hình thành ra được và rất quan trọng trong việc chống lão hoá

Theo giáo sư, TS, bác sĩ Paupell ở Nhật thì thuỷ sâm Kombucha có thể trị dứt/hoặc giảm bớt các bệnh như đái tháo đường hoặc tiểu đường (Thủy sâm điều hoà được lượng đường trong cơ thể đối với những người bị bệnh tiểu đường); trị bệnh cao huyết áp Đối với những người cao tuổi, giảm

13

cholestorol trong máu, ngăn ngừa xơ cứng động mạch, phù thủng; bệnh tái đỏ,

nổi mụn vòng quanh bụng; chống lão hoá, giảm nếp nhăn trên trán, mặt; chống

ung thư, giảm bớt sự nhạy cảm với hoá chất, men gan cao đối với bệnh nhân

điều trị xạ trị ung thư,các bệnh về thận; làm sáng mắt, trị bệnh mắt kéo mây

(mắt có cảm giác có sợi tơ trong mắt), chữa mắt có vấng nâu xám làm mờ mắt

sưng húp; làm cơ bắp rắn chắc hơn; chữa khỏi bệnh chai mạch máu do sự chậm

tiêu hoá các chất độc khi ăn uống; mỏi nhức gân cốt, xuyên, lác, ung nhọt, lở

loét; sung sức về sinh lý, cơ thể cường tráng; chữa các bệnh trong đường đông

mạch máu; chữa chân tay đổ mồ hôi, đau lưng và các khớp xương; đặc trị bệnh

mất ngủ (hay bị tỉnh giấc về đêm, đảm bảo dùng sẽ khỏi hoàn toàn) giúp ăn

ngon miệng hơn; trị sạm mặt, đau gan, đau bao tử; đăc trị bệnh viêm đường ruột,

các bệnh mật, tiêu chảy (các bệnh về đường ruột như hay ăn thức ăn lạ bị đi

ngoài,viêm ruột,hay bị đi ngoai ko rõ nguyên nhân); trị táo bón làm cho nhuận

tràng; trị chóng mặt do thiếu máu lên lão; trị bệnh trĩ; làm tóc bạc trở lên đen

hơn,tóc mọc dày hơn; trị gan nhiễm mỡ; trị bệnh máu nhiễm mỡ,máu nhiễm

mỡ, có tác dụng làm tan mỡ trong máu,gan,thanh lọc cơ thể; giải độc, trị men

gan cao,giải độc bị nhiễm thuỷ ngân,tăng cường sự hoạt động của gan và túi

mật; trị bệnh về thận; trị bênh thấp khớp; trị bệnh đau cơ bắp, vai, cổ; trị căng

thẳng thần kinh, điều hoà thần kinh; làm cân đối với những bệnh nhân béo phì,

những người phì mập (nấm có tác dụng đào thải, làm giảm cân, giảm từ 2 đến 4

kg và làm săn chắc cơ thể) [25]

1.1.5.3 Một số lưu ý khi sử dụng trà

Với những bệnh nhân trong giai đoạn điều trị ung thư do xạ trị hoặc hóa

trị, nếu dùng trà cần sự giám sát của thầy thuốc Do trà chứa quá nhiều acid

lactic, uống trong một thời gian dài có thể dẫn đến đau khớp, chóng mặt và

viêm xoang; trẻ em có thể dùng nhưng liều lượng thay đổi theo tuổi, cân nặng

và quan trọng cần phải được pha loãng với nhiều nước, không nên cho trẻ

14

dưới 2 tuổi uống; phụ nữ có thai không nên dùng vì có đến 1% lượng cồn trong nước trà, không nên uống trong thời gian cho con bú vì gây đau bụng cho trẻ sơ sinh; người tiểu đường chỉ nên dùng trà đang lên men vì hầu hết lượng đường bị biến đổi, tuy nhiên nếu ủ men trà với quá ít đường (dưới 50 g/l) thì khó xuất hiện các đặc tính hữu ích của trà kombucha vì vậy người tiểu đường cũng không nên uống nhiều Men trà kombucha có thể bị hỏng và mất hết tác dụng nếu ủ không đúng quy cách [24]

1.2 Nguồn nguyên liệu trà Phú Thọ

Với các thành phần hóa học của lá chè tại Phú Thọ đã làm cho các sản phẩm chế biến từ chè Phú Thọ có hương vị đặc biệt khác hẳn cây chè ở những vùng đất khác Chè ngọt mát, thơm, hàm lượng tanin cao

Đối với chè xanh: Hình dáng màu xanh tự nhiên, cánh chè dài, xoăn đều non, màu nước xanh và trong, hương thơm mạnh tự nhên, thoảng cốm

Đối với chè đen: Hình xoăn, tương đối đều, đen tự nhiên, màu nước đỏ nâu sáng, rõ viền vàng, vị đậm, dịu, có hậu ngọt, chè có vị ngọt, tính mát

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.3.1 Trên thế giới

Trước năm 1990 những nghiên cứu về kombucha còn hạn chế, chỉ bước đầu nghiên cứu về khu hệ vi sinh vật Đến năm 1995 trong một cuốn sách

“Kombucha: Healthy Beverage and Natural Remedy from the Far East” tác

giả Gunther W Frank , đã cung cấp thông tin cơ bản hữu ích, cách thức sử dụng và những thắc mắc cơ bản về kombucha Theo những nghiên cứu của Reiss (1994) đã kết luận về các giá trị chữa bệnh và các hướng ứng dụng trong sản xuất của kombucha như: hiệu lực trong điều trị các bệnh chuyển hóa, hỗ trợ tiêu hóa ứng dụng sản xuất enzyme và vitamin nhóm B Năm

2000 tác giả Chen C và Liu B.Y [17] đã đưa ra kết luận về sự biến thiên hàm lượng các chất trong quá trình lên men: hàm lượng đường sucrose giảm tuyến

15

tính theo thời gian, trong khi đó hàm lượng ethanol tăng lên, nhưng có dấu hiệu chậm lại, hàm lượng acid acetic tăng lên đáng kể và tăng chậm sau ngày thứ 7 của quá trình lên men làm pH dịch lên men giảm đáng kể Tác giả Dufresne và Farm Worth (2000) trong nghiên cứu của mình đã cho thấy những tác dụng có lợi của kombucha như tăng cường miễn dịch, ngăn ngừa ung thư Vijayaraghavan R & cs (2000), đã tiến hành các liệu pháp thử nghiệm trên chuột sau quá trình sử dụng kombucha sau 90 ngày đã kết luận rằng kombucha là đồ uống có nhiều lợi ích cho sức khỏe và là liệu pháp thay thế Cũng trên đối tượng trên chuột tác giả Dipti P & cs (2003) đã đưa ra kết quả cho sự chống ôxy hóa, giảm GSH và tăng cường miễn dịch Cavusoglu K., Gluer P (2010) đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên nhiễm sắc thể gây ra bởi bức xạ gamma trong tế bào bạch huyết ngoại vi của con người trong ống nghiệm Dutta D., Gachhui R (2006) [18] đã phân lập vi khuẩn Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov cố định đạm từ trà kombucha Dutta D., Gachhui R (2007) đã phân lập từ trà kombucha vi khuẩn cố định

đạm và cellulose là Gluconacetobacter kombucha sp.nov J Reiss, (1994) đã

tìm hiểu ảnh hưởng của các loại đường khác nhau lên quá trình trao đổi chất của nấm trà Jayabalan R., Malini K., Sathishkumar M., Swaminathan K.,Yun S.-E (2010) tìm hiểu đặc điểm sinh hóa của nấm trà K.H Steinkraus, K.B Shapiro, J.H Hotchkiss, R.P Mortlock,(1996) viết về hoạt động kháng sinh của trà nấm kombucha Nguyen Vu Tuan; Flanagan, Bernadine; Gidley, Michael J.; Dykes, Gary A (2008) tìm hiểu đặc tính của màng BC bởi chủng

Gluconacetobacter xylinus phân lập từ kombucha Petrushevska-Tozi L.,

Bauer-petrovska B (2000) đã xác định được hàm lượng vitamin hòa tan và khoáng trong nước uống kombucha Velicanski, Aleksandra; Cvetkovic, Dragoljub; Markov, Sinisa; Tumbas, Vesna; Savatovic, Sladjana (2007) viết

về hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha Yapar K.,

Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cs (2012), Đại học Mở TP Hồ Chí Minh

đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu hệ vi sinh vật của trà kombucha và hiệu quả tác dụng trên một số chỉ tiêu sinh lý chuột” Trong đề tài này nghiên cứu về

hệ vi sinh vật trong kombucha bao gồm: vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic và nấm men, đồng thời khảo sát tác dụng của kombucha trên một số chỉ tiêu sinh

lý của chuột như: cân nặng, tổng lượng hồng cầu, tổng lượng bạch cầu, sức khỏe của chuột thí nghiệm qua mô hình bơi kiệt sức Kết luận: sản phẩm trà kombucha có tác dụng tăng cường sức khỏe, không gây ảnh hưởng xấu tới các chỉ tiêu sinh lý của chuột

Tôn Nữ Liên Hương thuộc khoa Khoa học Tự nhiên – Đại học Cần Thơ

đã có bản báo cáo khoa học với tên đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chế biến tới một số tính chất và hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha”, tháng 3 năm 2013 Nội dung của bản báo cáo khoa học: giới thiệu trà giấm kombucha, định hướng nghiên cứu thực nghiệm, tóm tắt các kết quả nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học của trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt kết quả khảo sát hàm lượng của các hợp chất hữu cơ có hoạt tính trong trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt về một số hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha: tính kháng khuẩn,

đề tài chỉ thực hiện trên đối tượng trà Thái Nguyên và chỉ tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên[4]

Lâm Thị Hồng Liên, Đại học Sư phạm Hà Nội 2 thực hiện đề tài

“Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang” Đề tài đã thực hiện: Phân lập và sơ bộ định loại một số chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang, tuyển chọn chủng nấm men lên men kombucha, nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển nấm men trong môi trường lên men, nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên men kombucha, xây dựng quy trình sản xuất kombucha Đề tài chỉ được thực hiện trên đối tượng trà Shan tuyết Hà Giang và chỉ tuyển chọn nấm men lên men kombucha [3]

Lương Huyền Trang, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, nghiên cứu đề tài: “ Lên men kombucha từ trà Suối Giàng, Yên Bái” Đề tài đã tiên hành: Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Suối Giàng Yên Bái; Xác định hàm lượng sucrose thích hợp lên men kombucha từ trà Suối Giàng, Yên Bái; Tìm một số điều kiện lên men kombucha từ trà Suối Giàng, Yên Bái; Xây dựng qui trình lên men kombucha từ trà Suối Giàng, Yên Bái Tuy nhiên, đề tài chỉ thực hiện ở đối tượng trà Suối Giàng, Yên Bái[6]

18

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Vi sinh vật

Các chủng vi khuẩn Acetic và nấm men thuần khiết phân lập từ

kombucha lên men từ trà Phú Thọ

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

2.1.2.1 Thiết bị

Khúc xạ kế; Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức); Nồi hấp Tommy (Nhật); Box

vô trùng (Haraeus); Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh); Máy li tâm Kubota (Đức); Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ); Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức); Tủ lạnh Daewoo; tủ lạnh sâu; hộp lồng; ống nghiệm; bình tam giác; que trang; lamen; đèn cồn; cồn kế; nhiệt kế…

2.1.2.2 Hóa chất

Nguồn cacbon: glucose (C6H12O6 ), acid acetic

Nguồn nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4

Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4

Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol, …

H2SO4 , CaCO3 , thạch agar…

19

2.1.3 Môi trường

Bảng 2.1 Các loại môi trường

20

10-8 nhỏ lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp petri, dùng que trang trang đều Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong 2 - 3 ngày Dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trưng ra khỏi môi trường phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 40C

2.2.1.2 Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản

Đối với vi khuẩn

Để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn thì chúng tôi tiến hành phương pháp nhuộm Gram.Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm kép để phân biệt hai nhóm vi khuẩn G+ và G- do Christian Gram (Đan Mạch) đề xướng năm 1884 Khi cùng nhuộm và tẩy màu tế bào theo một phương pháp: Vi khuẩn G+ vẫn giữ được màu của thuốc nhuộm tím, còn vi khuẩn G- bị mất màu Cơ sở khoa học của các bước nhuộm như sau:

Bước nhuộm màu cơ bản bằng thuốc nhuộm tím (gential violet hoặc Cristal violet) Tất cả các vi khuẩn đều bắt màu tím

Nhuộm tăng cường: củng cố màu bằng dung dịch Lugol (KI + I2) Thuốc nhuộm này kết hợp với thuốc nhuộm Gential violet thành phức hợp bền màu hơn ở các vi khuẩn G+

Tẩy màu: dùng chất tẩy màu (thường là cồn 90%) tổ hợp Gential violet

và dung dịch Lugol Ở thành tế bào G- thì liên kết giữa tổ hợp thuốc nhuộm này lỏng lẻo hơn ở vi khuẩn G+ nên dễ bị rửa trôi

Nhuộm phân biệt bằng thuốc nhộm khác (thường dùng là Safranin, cũng có thể thay bằng Fuchsin bazo loãng) nhằm nhuộm các tế bào đã bị tẩy

màu thành một màu tương phản với màu tím để dễ phân biệt

Cách tiến hành

Bước 1 Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh 0,5-1 phút

Bước 2 Rửa bằng nước

21

Bước 3 Nhuộm bằng dung dịch lugol từ 0,5-1 phút

Bước 4 Rửa bằng nước

Bước 5 Tẩy màu bằng cồn 90% trong 10-20 giây

Bước 6 Rửa bằng nước

Bước 7 Nhuộm bằng fucshin 30 giây

Bước 8 Rửa bằng nước

Bước 9 Thấm khô, soi kính dầu

Đối với nấm men

Để quan sát hình thái tế bào nấm men, chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm đơn Nhuộm đơn là dùng 1 loại thuốc nhuộm để nhuộm Các loại thuốc nhuộm thường dùng để nhuộm đơn là : Fuchsin kiềm, xanh metylen,

tím gentian, đỏ trung tính

Cách tiến hành nhuộm

Bước 1 Làm vết bôi vi sinh vật

Bước 2 Làm khô vết bôi

Bước 3 Cố định vết bôi

Bước 4 Nhuộm tiêu bản

Bước 5 Rửa tiêu bản

Bước 6 Thấm khô tiêu bản

2.2.1.3 Bảo quản chủng giống

a Bảo quản trên thạch nghiêng

Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 300C Sau đó giữ trong tủ lạnh 40C dùng cho nghiên cứu tiếp theo Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [11]

22

b Bảo quản trong dung dịch glycerin 15%

Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng ở 300C sau

48 giờ đem li tâm dịch nuôi cấy trong 20 phút ở 3000 vòng/ phút, tách lấy phần sinh khối Hoà đều sinh khối trong 1ml dung dịch glycerin 15% vô trùng giữ ở -800C trong các ống eppendof vô trùng Bảo quản theo phương pháp này cho phép giữ giống trong vòng 1 đến 3 năm [9]

2.2.1.4 Phương pháp hoạt hóa giống

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 20 phút Sau

đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ

2.2.1.5 Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men

Sử dụng phương pháp cân bình trọng lượng để xác định hoạt lực lên men của mẫu nấm men thông qua thông số hàm lượng CO2 thoát ra Hàm lượng CO2 thoát ra càng nhiêu thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt

Phương pháp cân bình trọng lượng: Dịch được lên men trong các bình

có cùng thể tích 250 ml môi trường, có cùng một lượng tế bào nấm men của các giống khác nhau Sau 24h lên men đem cân trọng lượng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại

2.2.2 Phương pháp hóa sinh

2.2.2.1 Phát hiện hoạt tính catalase

Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +) Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -)

23

2.2.2.2 Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic

Sử dụng môi trường sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn

Thành phần (g/l): Cao nấm men : 10g Canxi acetat: 10g

Thạch : 20g Nước máy: 1000ml

pH : 7,0-7,2 Quan sát hiện tượng nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi

là phản ứng dương tính, ngược lại là âm tính [3]

2.2.2.3 Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose

Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28 - 300C trong vòng 3 - 4 ngày, quan sát sự hình thành màng Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% nó chuyển hoá thành màu xanh lam

2.2.2.4 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị

Cho vào cốc thủy tinh (loại 100ml hoặc 200ml) dịch lên men, thêm vào

đó 1-2 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N Chú

ý chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt Sau đó tính số gam acid tổng số trong 100ml dung dịch lên men theo công thức:

X= .100

10

V K

(g/ml) Trong đó: X: Số gam acid tổng số trong 100ml dung dịch lên men

V: Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 10ml dung dịch lên men

K: Lượng acid tổng số tương ứng với 1ml NaOH 0,1N (K=0,006)

10: Số ml dịch lên men đem chuẩn độ

2.2.2.5 Xác định đường sót

Dùng khúc xạ kế có khoảng đo từ 0 – 32o Bx