Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men rượu vang sim

Để tạo ra rượu vang sim có chất lượng tốt phụ thuộc rất nhiều vào chủng nấm men lên men rượu vang sim và điều kiện môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men.. Mục đích ng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

RƯỢU VANG TỪ SIM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC

Người hướng dẫn khoa học

TS NGUYỄN QUANG THẢO

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới thầy giáo, TS Nguyễn Quang Thảo, vụ Khoa học và Công nghệ, Bộ Công Thương và cô giáo, PGS TS Đinh Thị Kim Nhung, Giảng viên chính, tổ Thực vật – Vi sinh, Trường Đại hoc Sư phạm Hà Nội 2, người đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ

em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài này

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trường Đại học sư phạm Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, Trung tâm thông tin thư viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân, những người đã luôn quan tâm, động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài

Mặc dù đã cố gắng nhưng đề tài của em không tránh khỏi còn nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy

cô, các bạn sinh viên để đề tài được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 28 tháng 4 năm 2016

Sinh viên

Phạm Thị Huyền

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật Đây

là kết quả của riêng tôi Tất cả các số liệu trong bảng biểu và hình ảnh đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố

Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho luận văn của mình

Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Xin trân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 28 tháng 04 năm 2016

Sinh viên

Phạm Thị Huyền

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

5 Điểm mới của đề tài 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về đối tượng 4

1.1.1 Sơ lược về cây sim 4

1.1.2 Thành phần, cấu tạo và công dụng của quả sim 4

1.2 Khái quát chung về lên men rượu vang 5

1.2.1 Khái niệm rượu vang 5

1.2.2 Thành phần và giá trị dinh dưỡng của rượu vang 5

1.2.3 Nguyên liệu sản xuất rượu vang 6

1.2.4 Phân loại vang 6

1.3 Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men 7

1.3.1 Nấm men 7

1.3.2 Vi khuẩn 9

1.3.3 Nấm mốc 10

1.3.4 Các vi sinh vật làm hỏng vang 10

1.3.5 Bệnh vang 10

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của tế bào nấm men 11

1.4.1 Nguồn cacbon 11

1.4.2 Nguồn nitơ vô cơ 11

1.4.3 Nguồn photpho vô cơ 11

1.4.4 Nguồn oxi 11

1.4.5 Các nguyên tố khoáng 12

1.5 Yêu cầu của việc lựa chọn chủng nấm men lên men vang 12

1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 12

1.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 12

1.6.2 Ảnh hưởng của nồng độ cồn 13

1.6.3 Ảnh hưởng của pH 13

1.6.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường và men giống 13

1.6.5 Ảnh hưởng của thời gian lên men 14

1.6.6 Những biến đổi sinh lý, sinh hóa, vi sinh trong quá trình lên men rượu vang 14

1.7 Tổng quan tình hình sản xuất trong nước và ngoài nước 15

1.7.1 Tình hình sản xuất rượu vang trên thế giới 15

1.7.2 Tình hình sản xuất rượu vang trong nước 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng ngiên cứu 18

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 18

2.2.1 Hóa chất 18

2.2.2 Dụng cụ thiết bị 18

2.3 Môi trường 19

2.3.1 Môi trường Hansen (môi trường phân lập, MT1) 19

2.3.2 Môi trường nhân giống (môi trường 2, MT2) 19

2.3.3 Môi trường lên men (Môi trường 3, MT3) 19

2.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Các phương pháp vi sinh 19

2.4.2 Phương pháp hóa học 22

2.4.3 Phương pháp xử lý kết quả thu được bằng thống kê toán học 23

2.5 Phạm vi nghiên cứu 24

2.6 Địa điểm nghiên cứu 24

2.7 Thời gian nghiên cứu 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang sim 25

3.1.1 Phân lập chủng nấm men S.cerevisiae từ dịch siro sim 25

3.1.2 Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang sim 29

3.1.3 Xác định tên khoa học của chủng nấm men M2 35

3.2 Nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men S cerevisiae M2 trong môi trường nhân giống 36

3.3 Nghiên cứu động thái lên men vang sim của chủng nấm men S cerevisiae M2 39

3.4 Ảnh hường của điều kiện môi trường tới quá trình lên men vang sim 41

3.4.1 Nhiệt độ 41

3.4.2 pH 43

3.4.3 Tỷ lệ men giống 45

3.5 Lên men với quy mô phòng thí nghiệm và xây dựng quy trình sản xuất rượu vang sim 47

3.5.1 Lên men với quy mô phòng thí nghiệm 47

3.5.2 Thuyết minh quy trình công nghệ sản xuất rượu vang sim 48

3.5.3 Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất rượu vang sim 49

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

1 SLTB : Số lượng tế bào

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Sản lượng vang tại một số quốc gia trên thế giới(1990 - 2000)

(triệu hectolit) 16

Bảng 3.1 Kết quả phân lập các chủng nấm men 27

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái tế bào học của 3 chủng nấm men M1, M2, M3 28

Bảng 3.3 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của 3 chủng M1, M2, M3 29

Bảng 3.4 Thử hoạt lực lên men của 3 chủng nấm men M1, M2, M3 30

Bảng 3.5 Khả năng lên men của 3 chủng nấm men M1, M2, M3 31

Bảng 3.6 Khả năng lên men các loại đường khác nhau của 3 chủng nấm men 32

Bảng 3.7 Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau của 3 chủng nấm men M1, M2, M3 33

Bảng 3.8 Khả năng tạo hương thơm và độ trong của 3 chủng nấm men 34

Bảng 3.9 Tổng hợp kết quả tuyển chọn chủng nấm men 34

Bảng 3.10 Động thái phát triển của chủng nấm men S cerevisiae M2 trong môi trường nhân giống 37

Bảng 3.11 Sự biến đổi hàm lượng đường và hàm lượng cồn trong quá trình lên men vang sim 39

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men vang sim 41

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men vang sim 43

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của tỷ lệ men giống đến sự biến động số lượng tế bào trong thời gian 72 giờ của chủng S.cerevisiae M2 45

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của tỷ lệ men giống tới quá trình lên men vang sim 46

Bảng 3.16 Kết quả phân tích rượu thành phẩm 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây sim vào vụ thu hoạch 4

Hình 1.2 Sản phẩm rượu vang sim 17

Hình 1.3 Một số sản phẩm rượu vang sim trong nước 17

Hình 3.1 Quả sim thu mẫu 25

Hình 3.2 Các chủng nấm men phân lập được trên môi trường thạch đĩa 26

Hình 3.3 Chủng nấm men M1, M2, M3 trên môi trường thạch nghiêng 28

Hình 3.4 Hình thái tế bào học của 3 chủng nấm men M1, M2, M3 28

Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn chiều cao cột kết lắng của 3 chủng nấm men M1, M2, M3 32

Hình 3.6 Chủng M2 trên kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần 35

Hình 3.7 Chủng nấm men M2 trên môi trường thạch nghiêng 35

Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn động thái phát triển của chủng nấm men S.cerevisiae M2 trong môi trường nhân giống 37

Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn sự biến đổi hàm lượng chất khô và hàm lượng cồn trong quá trình lên men vang sim 40

Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn động thái lên men vang sim của chủng S cerevisiae M2 40

Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men vang sim sau 7 ngày 42

Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men vang sim sau 14 ngày 42

Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men vang sim sau 7 ngày 44

Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men vang sim sau 14 ngày 44

Hình 3.14 Động thái sinh trưởng của chủng nấm men S.cerevisiae M2 ở

các tỷ lệ men giống khác nhau 46 Hình 3.15 Quy trình công nghệ sản xuất rượu vang sim 49

Hằng năm trên thế giới xuất khoảng 29 tỷ lít rượu vang Trong đó các nước sản xuất nhiều nhất là: Pháp, Ý, Angiêri Do nguồn gốc hình thành và nguồn nguyên liệu của đa số các loại rượu vang trên thế giới đều sản xuất từ quả nho nên trong tiềm thức của người dân khái niệm rượu vang đồng nghĩa với vang nho Ở các nước nhiệt đới nóng ẩm như nước ta thì do điều kiện diện tích trồng nho còn hạn hẹp, chất lượng quả nho thấp mà các loại hoa quả nhiệt đới có chứa hàm lượng đường, axit amin, vitamin, khoáng chất… lại vô cùng phong phú Vì vậy, người ta nghĩ đến việc sản xuất rượu vang từ các loại quả nhiệt đới khác nhau: mơ, táo, dứa, xoài, chanh leo, sim, hibiscus… có chất lượng cao và mang hương vị đặc trưng Những sản phẩm hoa quả được ủ sau khi thành phẩm có độ cồn từ 8,5 độ trở lên được xem là vang

Ở Việt Nam, ngành sản xuất rượu vang mới thực sự bắt đầu từ những năm 80 của thế kỷ XX và được đánh dấu bằng sự ra đời của nhà máy vang Thăng Long, sau đó là một số nhà máy khác: vang Gia Lâm, vang Đà Lạt…Giá thành của rượu vang sản xuất trong nước sẽ thấp hơn so với vang nhập từ nước ngoài và vì vậy càng tăng tính cạnh tranh và thúc đẩy sự phát triển của ngành công nghiệp rượu vang trong nước

Sim là một loại quả rất phổ biến ở khu vực trung du và miền núi phía bắc, đây là loại nguyên liệu rẻ tiền, có hàm lượng dinh dưỡng cao Rượu vang sim là một thức uống có nồng độ cồn thấp, mang hương vị thơm ngon đặc trưng và có nhiều tác dụng bổ ích cho cơ thể Sản xuất rượu vang từ quả sim

sẽ làm phong phú thêm chủng loại rượu vang của Việt Nam, rượu sim có hàm lượng dinh dưỡng cao, bồi bổ sức khỏe và tăng thêm thu nhập cho nông dân Để tạo ra rượu vang sim có chất lượng tốt phụ thuộc rất nhiều vào chủng nấm men lên men rượu vang sim và điều kiện môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men Xuất phát từ thực tiễn với những quan điểm trên tôi quyết

định chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài ‘‘Ảnh hưởng của điều kiện môi

trường tới quá trình lên men rượu vang sim’’

2 Mục đích nghiên cứu

Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men rượu vang sim từ đó làm cơ sở xây dựng quy trình công nghệ sản xuất rượu vang sim

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang sim

3.2 Nghiên cứu động thái phát triển của chủng nấm men S cerevisiae đã

tuyển chọn trong môi trường nhân giống và động thái lên men của chủng này 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men vang sim: Nhiệt độ, pH, tỷ lệ men giống

3.4 Ứng dụng lên men vang sim và xây dựng quy trình sản xuất vang sim ở quy mô phòng thí nghiệm

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Ý nghĩa khoa học: Tìm được điều kiện môi trường lên men vang sim, phù hợp với công nghệ và chất lượng sản phẩm

- Ý nghĩa thực tiễn: Tận dụng nguồn nguyên liệu có sẵn của địa phương, tạo ra một sản phẩm rượu vang có hương vị thơm ngon phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng, góp phần làm phong phú thị trường rượu vang trong nước và nâng cao thu nhập cho đồng bào dân tộc vùng cao

5 Điểm mới của đề tài

Đề tài đã phân lập, tuyển chọn được chủng nấm men S cerevisiae M2 có

khả năng lên men vang sim Đã xác định được nhiệt độ: 28-300C, pH: 4-4.5, tỷ lệ giống bổ sung ban đầu: 10% thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát

triển của chủng nấm men S cerevisiae M2 lên men vang sim Xây dựng quy trình lên men rượu vang sim ở quy mô phòng thí nghiệm

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về đối tượng

1.1.1 Sơ lược về cây sim

Cây sim tên khoa học là Rhodomyrtus tomentosa (Ait.) Hassk Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) » Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida) » Phân Lớp Hoa Hồng (Rosidae) » Bộ Sim (Myrtales) » Họ Sim (Myrtaceae) » Chi Rhodomyrtus cùng họ với ổi, mận trám Ngoài ra, còn có tên gọi khác là là hồng sim, đào kim nang, mác nim, piểu ním…

1.1.2 Thành phần, cấu tạo và công dụng của quả sim

Cấu tạo: Qủa mọng, lạc, mềm và thơm Màu tím đỏ thẫm, hạt xếp thành

hai dãy trong mỗi ô

Thành phần hóa học: Qủa sim có chứa các flavon-glucosid, malvidin- 3 glucosid, các hợp chất phenol, các axit amin, đường và axit hữu cơ

Công dụng: Cây Sim mọc nhiều ở đồi núi hoặc được trồng làm cảnh Đã

từ rất lâu sim được ghi nhận như là một biểu tượng của tình yêu và sự tin cậy, gắn liền với tình cảm của con người Qủa sim có chứa anthocyanin, tannin và đường Theo Đông y, tất cả các bộ phận của cây đều có thể dùng làm thuốc Trong đó, quả sim vị ngọt chát, tính bình Qủa tươi hoặc khi ủ thành rượu sim

có thể xem như vị thuốc chữa bệnh suy nhược thần kinh, có tác dụng dưỡng huyết, chỉ huyết (cầm máu), cố tinh, dùng chữa các chứng huyết hư, thổ huyết, mũi chảy máu, tiểu tiện ra máu, kiết lỵ, di tinh, băng huyết…

Hình 1.1 Cây sim vào vụ thu hoạch

Màu tím của trái sim còn tốt cho những bệnh nhân bị các chứng nổi tĩnh mạch xanh dưới da Nhiều tài liệu cho thấy các loại quả có màu tím, xanh, trắng chứa nhiều chất flavonoid, đặc biệt các loại quả chứa nhiều sắc tố như proanthocyanidin và anthocyanidin mang lại màu xanh tím đặc trưng trong trái sim là những chất có hoạt tính cao và tăng cường tính bền chắc cho hệ thống mạch máu Sử dụng các loại quả này còn giảm được nguy cơ nhiễm trùng đường tiết niệu và cải thiện độ chắc của răng Các chất có màu tím (có trong nhóm phytochemical) còn làm giảm cholesterol, triglyceride và thromboxane (là những thành phần tham gia vào sự phát triển tim mạch) trong máu, ngăn ngừa các bệnh tim mạch, đột quỵ và còn có khả năng chống sự lão hóa, già nua của tế bào (Nguyễn Minh Thủy, 2009)

1.2 Khái quát chung về lên men rượu vang

1.2.1 Khái niệm rượu vang

Rượu vang (còn gọi là rượu chát, tiếng anh là wine) là một loại đồ uống

có cồn được lên men từ nước nho hoặc các loại quả khác Nấm men chuyển hóa đường trong quả thành rượu và carbon dioxide Các giống quả khác nhau

và chủng nấm men khác nhau tạo thành các dạng khác nhau của rượu vang Các dạng rượu vang nổi tiếng là kết quả của sự tương tác rất phức tạp giữa phát triển sinh hóa của quả, các phản ứng liên quan đến quá trình lên men, cùng với sự can thiệp của con người trong quá trình tổng thể

1.2.2 Thành phần và giá trị dinh dưỡng của rượu vang

Ethanol: Là thành phần chính của rượu vang Độ cồn trong rượu vang từ

10-15%V, tùy theo công nghệ và độ đường trong quả nho

Đường: Đường trong rượu vang từ 6,2 g/l – 13,2 g/l, chủ yếu là đường

fructozo, glucozo và một ít galactozơ

Khoáng: Chứa một lượng phong phú các loại muối với hàm lượng thấp,

giữ vai trò làm tăng hương vị và giá trị dinh dưỡng của rượu vang

Vitamin: Vitamin có trong nước quả ít bị quá trình lên men phân hủy Axitamin: Có vai trò quan trọng đối với sự sinh sản và phát triển của nấm

men Ngoài lượng axitamin có sẵn trong dịch quả, quá trình lên men vang cũng tạo thêm một số axitamin đã làm cho vang thành phẩm có hương vị đặc trưng Các axitamin như: lizin, treonin, valin,… [17]

1.2.3 Nguyên liệu sản xuất rượu vang

Có rất nhiều nguồn nguyên liệu để sản xuất rượu vang Trên thị trường quốc tế có thể nói nho là nguyên liệu phổ biến cho sản xuất rượu vang nho nhưng hiện nay rượu vang lên men từ các loại quả nhiệt đới khác cũng đang phát triển mạnh

Nho: chất lượng tốt, hương vị đậm đà, vị ngọt, nóng của cồn cân đối với

vị chua chát của axit Thành phần hóa học của nho có (%): 10-26 đường (glucozơ, fructozơ, saccarozơ); 0,5-0,7 axit hữu cơ (axit tactaric, axit malic); 0,1-0,9 các chất protein; 0,1-0,5 chất khoáng; có các vitamin C, B1, B2, cùng

1.2.4 Phân loại vang

Có nhiều cách phân loại rượu vang khác nhau dựa vào màu sắc, đặc điểm chủng trái cây, nhà sản xuất, công nghệ sản xuất

Theo màu sắc:

- Vang trắng ( Aliwen trắng): Vang chiết xuất từ trái nho trắng

- Vang đỏ (Aliwen đỏ): Vang chiết xuất từ trái nho đỏ

- Vang hồng (Aliwen hồng): Vang pha trộn chiết xuất từ nho đỏ và nho trắng

Theo hàm lượng đường trong rượu:

- Vang khô: Trong rượu vang hầu như không có đường

- Vang ngọt: Hàm lượng đường trong vang khoảng 14-20% g/l, dùng để khai vị

- Vang bán khô: Hàm lượng đường trong vang từ 9-12%, thấp hơn vang ngọt

Theo xu hướng chung vang được chia thành hai nhóm chính:

- Vang không có gas: tức là trong vang thành phần không có CO2

- Vang có gas: trong vang thành phẩm có CO2: vang bọt, sâm banh[24]

1.3 Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men

1.3.1 Nấm men

1.3.1.1 Sơ lược về nấm men

Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm men có cấu tạo và sinh sản bằng cách nảy chồi, cũng có khi theo hình thức phân cắt tế bào Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi: trong đất trồng cây, nơi trồng hoa quả, nơi sản xuất rượu vang, nhất là trong môi trường chứa đường và pH thấp [6]

1.3.1.2 Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men S.cereciviae

- Hình thái: Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) có

dạng hình trứng, hình ovan Kích thước nấm men 2-8µm x 4-10µm Nấm men có hình tròn, màu trắng đục hoặc vàng nhạt, bề mặt lồi và căng Hình dạng có thể thay đổi theo điều kiện nuôi cấy và tuổi tế bào Mặc dù cấu tạo đơn bào nhưng nấm men mang đầy đủ tính chất của một cơ thể sống

- Cấu tạo: Nấm men có cấu tạo tế bào khá phức tạp, gần giống như tế

bào thực vật Có đầy đủ các cấu tạo thành tế bào, màng tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ

+ Thành tế bào: Thành tế bào nấm men được cấu tạo bởi hai lớp phân tử

bao gồm 90% là hợp chất glucan và mannan, phần còn lại là protein, lipit và glucozamin Glucan là hợp chất cao phân tử của D – Glucoza, mannan là hợp

chất cao phân tử của D – Manoza Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua đó chất dinh dưỡng được hấp thu và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất được thải ra

+ Màng nguyên sinh chất: Màng nguyên sinh chất của tế bào nấm men

dày khoảng 8nm có cấu tạo tương tự như màng nguyên sinh chất của vi khuẩn

+ Tế bào chất: Nấm men cũng như tế bào chất của vi khuẩn, độ nhớt

của tế bào chất cao hơn của nước 800 lần

+ Nhân tế bào: Nhân tế bào nấm men là điển hình, có dịch nhân bên

trong là chất dịch nhân Cũng như nhân của tế bào sinh vật bậc cao, nhân của

tế bào nấm men ngoài ADN còn có protein và nhiều loại men Hạch nhân của

tế bào nấm men không chỉ có một phân tử ADN như ở vi khuẩn mà có cấu tạo nhiễm sắc thể điển hình và có quá trình phân bào nguyên nhiễm gọi là gián phân

+ Ty thể: Khác với vi khuẩn, nấm men đã có ty thể giống như ở tế bào

bậc cao, đó là cơ quan sinh năng lượng của tế bào Ty thể của nấm men có hình bầu dục, được bao bọc bởi hai lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm răng lược hoặc nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên

+ Riboxom: có hai loại: loại 80S gồm 2 tiểu thể 60S và 40S nằm trong tế

bào chất, một số khác gắn với màng tế bào chất Một số nghiên cứu chứng minh rằng: Các riboxom gắn với màng tế bào chất có hoạt tính tổng hợp protein cao hơn Loại 70S là loại riboxom có trong ti thể Ngoài các cơ quan trên, nấm men còn có không bào và hạt dự trữ volutin

+ Bào tử: Nhiều nấm men có khả năng hình thành bào tử, đó là một hình

thức sinh sản của nấm men Có hai loại bào tử : bào tử bắn và bào tử túi [7], [9]

1.3.1.3 Sinh sản của tế bào nấm men

Nấm men sinh sản dưới hai hình thức: vô tính và hữu tính

Sinh sản vô tính: Các tế bào nấm men nói chung và nấm men thuộc chi

S cerevisiae nói riêng sinh sản chủ yếu theo lối nảy chồi Khi tế bào phát

triển đến một mức độ nhất định thì trên cơ thể nó xuất hiện mầm hay chồi Khi một chồi xuất hiện thì enzim thủy phân phân giải một phần polysacarit của thành tế bào làm cho chồi chui ra khỏi tế bào mẹ Ở mỗi chồi nhận được phần CNS và chất nhân của tế bào mẹ sau đó nó tách ra khỏi tế bào mẹ sống độc lập không tách khỏi mà tạo thành những chồi nhỏ liên kết với nhau tạo thành một chuỗi khuẩn ty giả Trong điều kiện thuận lợi một chồi nấm men trở thành một tế bào con và tách khỏi tế bào mẹ khoảng 20-30 phút [8]

Nấm men cũng có hình thức sinh sản bằng bào tử Bào tử túi được hình thành trong túi bào tử nhỏ gọi là nang, trong nang có từ 1-8 bào tử đôi khi có đến 12 bào tử Đó là quá trình tạo bào tử riêng rẽ không qua quá trình tiếp hợp Bào tử sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào nấm men mới Tiếp theo là quá trình nảy chồi [9]

1.3.1.4 Vai trò của chủng nấm men S.cereviae tới quá trình lên men rượu vang

Nấm men có thể sử dụng đường glucose và fructose trong dịch quả và chuyển hóa chúng theo con đường đường phân pyruvat Qúa trình này cung cấp năng lượng và chất khử để phục vụ sinh tổng hợp cho tế bào Trong điều kiện kỵ khí, nấm men loại CO2 khỏi pyruvat trong phản ứng xúc tác bởi enzym pyruvat decarboxylase tạo ra axetanlđehyt và CO2

Tiếp theo, acetalđehyt khử thành ethanol dưới tác động của enzyme alcohol dehydrogenase và NADH

1.3.2 Vi khuẩn

Trong dịch nho cũng như trong rượu vang có rất nhiều vi khuẩn Những

loại này có thể làm cho rượu vang ngon hơn hoặc cũng có thể làm xấu đi hương vị hoặc làm hỏng rượu vang Do đó chúng ta phải tạo điều kiện cho các

loài vi khuẩn có lợi phát triển, hạn chế các loài có hại phát triển

1.3.3 Nấm mốc

Nấm mốc phát triển ở vỏ quả, bã của quá trình sản xuất, thùng chứa hoặc đến từ không khí

1.3.4 Các vi sinh vật làm hỏng vang

Một số vi sinh vật tồn tại khá nhiều trong rượu vang gây hỏng rượu

vang, vang bị đục, có vị chua gắt, mùi khó chịu như: Bacterium gracile,

Acetobacter xylium, Acetobacter aceti [7]

1.3.5 Bệnh vang

Hiện tượng bệnh vang của lên men rượu vang được Pasteur nghiên cứu

và khám phá Đó là hiện tượng rượu bị chua đi và chất lượng rượu bị giảm rất nhanh Nguyên nhân là do rượu vang tiếp xúc với không khí và do vi khuẩn axetic phát triển đã biến cồn thành axetic Ngoài ra bệnh vang cũng có thể do các vsv lên men kỵ khí gây ra

Đặc điểm: rượu bị chua và có vị đắng

Nguyên nhân: do vi khuẩn lactic phá hủy glixerin tạo thành các acrolin

 Vang chua lactic

Đặc điểm: rượu có vị chua khó chịu

Nguyên nhân: khi quả quá ngọt hoặc cho thêm quá nhiều đường, kỹ thuật lên men thấp, làm cho nấm men ngừng hoạt động, hoặc do cấy men chưa đủ, nhiệt độ cao, thiếu oxy, vi khuẩn lactic sẽ chuyển hóa đường khử

thành đường manit và axit bay hơi

 Vang bị đục

Đặc điểm: vang có bị đục, không trong

Nguyên nhân: Do vang bị kết tủa trong rượu hoặc do sự oxy hóa của thành phần polyphenol có trong nguyên liệu làm rượu, hoặc do sự tạo thành kết tủa bông protein của thành phần tanin trong rượu và một số dạng kết tủa khác [18]

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của tế bào nấm men 1.4.1 Nguồn cacbon

Hợp chất cacbon chiếm vị trí hàng đầu cho sự sống của nấm men

Cacbon có trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzim và sản phẩm trao đổi chất

Nguồn cacbon cung cấp chủ yếu cho nấm men Saccharomyces cerevisiae

được lấy chủ yếu từ các nguồn đường: glucose, saccharose, fructose

1.4.2 Nguồn nitơ vô cơ

Nitơ là thành phần cấu tạo nên tế bào Nguồn nitơ dược nấm men lấy từ

các hợp chất vô cơ và hợp chất hữu cơ Do vậy, khi nhân giống nấm men người ta thường bổ sung thêm lyzin, arginin hoặc (NH4)2SO4 để tăng cường khả năng sinh sản cho nấm men [16]

1.4.3 Nguồn photpho vô cơ

Có vai trò quan trọng đối với tế bào nấm men, là nguyên liệu tổng hợp axit nucleic, các enzim, các hợp chất cao năng ATP

1.4.4 Nguồn oxi

Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rượu vang thuộc chủng giống

Saccharomyces Chúng là nhóm vsv kỵ khí tùy tiện Khi trong môi trường đủ

lượng oxi, nấm men sử dụng đường làm nguồn năng lượng để sinh sản và tăng sinh khối

1.4.5 Các nguyên tố khoáng

Trong môi trường dinh dưỡng cần có một lượng khoáng để đảm bảo cho

sự phát triển của tế bào nấm men Lưu huỳnh tham gia vào thành phần của một số acid amin, albumin, vitamin, và enzim Magie tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men, sắt tham gia vào thành phần của enzim,

sự hô hấp và quá trình khác Kali chứa nhiều trong nấm men, thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào quá trình lên men rượu và góp phần phục hồi photphorin hóa của axitpyruvic…

1.5 Yêu cầu của việc lựa chọn chủng nấm men lên men vang

Có hiệu suất lên men cao, tốc độ lên men lớn

Chịu cồn cao, có pH thấp

Có hương thơm, mùi vị đặc trưng

Dễ lắng trong và dễ lọc

1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men

1.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có tác dụng rõ rệt, ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men và chất lượng rượu vang (độ rượu, đường sót, chất thơm) thông qua các phản

ứng sinh hóa trong tế bào nấm men

Nếu nhiệt độ < 200C: sự lên men diễn ra chậm chạp, độ rượu được tạo thành thấp

Nhiệt độ < 100C: hầu như không diễn ra quá trình lên men

Nhiệt độ ở 350C: quá trình lên men sẽ tạo nhiều hợp chất bất lợi và gây độc cho nấm men

Nhiệt độ > 350C: quá trình lên men dừng lại, lượng đường còn sót cao, vi khuẩn dễ hoạt động, đặc biệt là nhiều vi khuẩn chuyển hóa đường thành axit acetic gây chua, làm giảm chất lượng vang

Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 26-280C [22]

Ở nhiệt độ cao nấm men phát triển càng nhanh thì sự chuyển hóa đường thành rượu càng kém, đồng thời nấm sẽ tiết nhiều chất phụ Nên giữ nhiệt độ

ổn định trong suốt quá trình lên men do nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình lên men và các chất hình thành

1.6.2 Ảnh hưởng của nồng độ cồn

Nấm men có thể phát triển ở nồng độ cồn là 9 – 14%V Trong quá trình lên men nồng độ rượu tăng dần sẽ gây ức chế hoạt động sống của nấm men và kìm hãm hoạt động của nhiều loại enzim nên quá trình lên men tạo rượu bị giảm hoặc dừng

1.6.3 Ảnh hưởng của pH

pH có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của nấm men Đối với dịch quả thường có độ pH từ 2,8 - 3,8 khoảng pH này nấm men vẫn thường hoạt động tốt vùng pH tối thích của nấm men là 4 - 6

Trong sản xuất rượu vang người ta thường sử dụng môi trường dịch quả

có pH 3,5 - 5,0

1.6.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường và men giống

Hàm lượng đường thích hợp cho lên men vang là 12-20%V và trên 25%V sẽ ức chế mạnh mẽ quá trình lên men Tỷ lệ các loại đường có trong dịch lên men cũng ảnh hưởng lớn tới tốc độ và hiệu suất lên men, glucose là loại đường phù hợp nhất cho sự sinh sản và phát triển của nấm men cũng như quá trình lên men rượu vang, tiếp đó là đường fructose và saccharose Vì vậy quả có chứa hàm lượng đường khử càng cao thì càng có lợi cho quá trình lên men cũng như đến chất lượng vang thành phẩm [16]

Tỷ lệ giống cũng có ảnh hưởng rất quan trọng đến quá trình sinh trưởng của nấm men cũng như lên men rượu vang Hàm lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì quá trình lên men càng kéo dài hơn, dễ bị nhiễm vi khuẩn ngược lại hàm lượng men giống trong dịch lên men càng cao

thì thời gian lên men ngắn hơn Nhưng hàm lượng men giống quá cao sẽ làm thay đổi thành phần môi trường lên men, sẽ không có lợi cho quá trình lên men, ảnh hưởng đến chất lượng rượu Nhìn chung hàm lượng men giống thích hợp cho quá trình lên men khoảng 6:10 triệu tb/ml dịch lên men

1.6.5 Ảnh hưởng của thời gian lên men

Thời gian lên men là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm vang Trong thời gian lên men chính, nếu thời gian lên men quá ngắn,

có thể lượng cồn tạo ra quá ít Trong thời gian lên men phụ, nếu thời gian lên men không đủ để hương hình thành, mùi vang sẽ không đặc trưng Đối với đa số nấm men, thời gian lên men chính tốt nhất là 7 - 12 ngày.Thời gian lên men phụ và tàng trữ của các loại rượu vang ít nhất phải vài tháng trở lên [1]

1.6.6 Những biến đổi sinh lý, sinh hóa, vi sinh trong quá trình lên men rượu vang

Nấm men S.cerevisiae được sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất Chủng

nấm men này có khả năng lên men này có khả năng lên men dịch có HL đường cao và tạo được 12% - 15% V cồn Qúa trình lên men rượu được biểu diễn bằng phương trình tổng quát:

C6H12O6 + 2ADP + 2H3PO4 → 2 C2H5OH + 2ATP + H2O Quá trình lên men đường thành rượu là một dãy oxy hóa khử nhờ hệ thống enzim trong tế bào nấm men Tốc độ lên men còn phụ thuộc tùy từng

loại nấm men thuộc chủng nấm men Saccharomyces, tùy thuộc từng loại

đường Quá trình lên men đường thành rượu trải qua một chuỗi phản ứng hóa học, chia 5 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Biến đổi glucozơ thành fructozơ – 1,6 điphotphat dưới tác

dụng của enzim hexokinaza và isomeraza

Giai đoạn 2: Từ fructozơ – 1,6 diphotphat biến đổi thành 3 –

photphoglixeraldehit và photphodiosiaxeton dưới tác dụng của enzim andolaza

Giai đoạn 3: Trước hết là 3 – photphoglyxerat nhờ xúc tác của của các

enzim photphoglyxeratmutaza Sản phẩm cuối cùng của giai đoạn này là sự biến đổi 2 – photphoglyxerat thành axit piruvic dưới tác dụng của enzim aldolaza và kinaza

Giai đoạn 4: Axit pyruvic phân cách thành axetaldehit đồng thời giải

phóng CO2 dưới tác dụng enzim decacboxylaza

Giai đoạn 5: Tạo etanol từ axetandehit nhờ tác dụng của enzim

alcoldehidrogennaza [2]

Trong giai đoạn cuối cùng của sự lên men vì lượng đường còn lại ít trong môi trường lên men, nấm men đã sử dụng glycogen đã được tích lũy trong đó, do đó HL glycogen trong tế bào giảm dần

Tốc độ lên men của các chủng Saccharomyces là khác nhau đối với mỗi

loại đường Tốc độ lên men với đường glucozơ và fructozơ nhanh hơn đường saccarozơ Tốc độ lên men với được xác định bằng lượng CO2 bay ra từ thể tích môi trường nhất định

Kết quả của quá trình lên men rượu là một sản phẩm có thành phần phức tạp, những vật chất cơ bản của dịch quả khi lên men đã chịu những biến đổi lớn, ngoài sự biến đổi của đường, đạm cũng chịu nhiều biến đổi hóa học, từ axit amin tương ứng tạo ra các rượu bậc cao như: amylic, propyonic, izobutylic

1.7 Tổng quan tình hình sản xuất trong nước và ngoài nước

1.7.1 Tình hình sản xuất rượu vang trên thế giới

Trải qua hơn 5000 năm lịch sử ra đời và phát triển Ngày nay, nền công nghiệp sản xuất rượu vang đã trở thành một ngành thương mại phát triển, đem lại hiệu quả kinh tế cao Rượu vang là sản phẩm cực kỳ được ưa chuộng trên thế giới, là một trong những đồ uống không thể thiếu trong tất cả các buổi tiệc gia đình hay lễ hội Nó trở thành thức uống đặc trưng của người Âu – Mĩ Trong đó Châu Âu đứng đầu thế giới về sản xuất rượu vang với 80%, tổng sản lượng rượu vang thế giới, Châu Mĩ 14%, Châu Phi 5%, Châu Á – Úc 0.5%

Bảng 1.1: Sản lượng vang tại một số quốc gia trên thế giới(1990 - 2000)

(triệu hectolit)

Quốc gia 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 Thế Giới 285,1 255,9 290,3 255,67 253,85 252,25 270,15 265,39 267,62 282,33 279,5

(Nguồn: Theo số liệu thống kê của Tổ chức lương thực thế giới FAO)

1.7.2 Tình hình sản xuất rượu vang trong nước

Ngành công nghiệp sản xuất vang ở Việt Nam mới chỉ được khai sinh từ những năm 80 của thế kỉ 20, theo chân của những người nước ngoài, đặc biệt

là người Pháp Tuy nhiên cho đến nay, rượu vang cũng đã trở thành thức uống phổ biến trong các bữa tiệc ở nước ta Quy mô sản xuất từ hộ gia đình nhỏ lẻ nay đã mở rộng theo hướng công nghiệp Năm 1984, vang Thăng Long đứng đầu trong ngành sản xuất vang non trẻ với sản lượng 10.000lít/năm Năm

1986, một số cơ sở sản xuất vang như Hồng Hà, Gia Lâm tiếp tục ra đời nâng sản lượng vang cả nước lên 100.000 lít/năm Tiếp theo sau đó là sự ra đời của hàng loạt các cơ sở sản xuất vang quy mô vừa và nhỏ như: Hà Nội, Đông Đô nhiều dòng vang đã khẳng định được tên tuổi của mình và ngày càng mở rộng hơn nữa, nâng cao về quy mô và chất lượng Theo thống kê của hiệp hội Rượu Bia và Nược giải khát Việt Nam, hiện cả nước có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất và đóng chai rượu vang nhập khẩu với sản lượng vang tăng khoảng 12-13 triệu lít/năm

Hình 1.2 Sản phẩm rượu vang sim

Rượu vang sim là một loại rượu mang hương vị thơm ngon,

bổ dưỡng nhưng chưa được phổ biến rộng rãi, sản phẩm còn mang tính đặc trưng cho địa phương, nổi bật nhất phải kể đến vang sim Phú Quốc Hiện nay ở đảo Phú Quốc đã sản xuất được loại rượu vang đỏ từ trái sim rừng kết hợp với một số trái cây khác có nồng độ 12-14% etanol, là loại rượu vang đỏ có màu rất tươi của trái sim, hoàn toàn tự nhiên, quy trình bí quyết công nghệ sản xuất được chuyển giao công nghệ từ Viện sinh học nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh thuộc Viện khoa học Việt Nam chuyển giao cho cơ

sở Thành Long - Phú Quốc Ngoài ra, ở Phú Quốc có một số gia đình sản xuất rượu sim cung cấp cho thị trường khách du lịch ở đảo và được đăng ký nhãn hiệu chất lượng tại Sở Y tế tỉnh Kiên Giang như Rượu sim Bảy Gáo, Rượu Sim Sơn… bước đầu đã tạo dựng được thương hiệu và chỗ đứng nhất định trong thị trường rượu vang trong nước và trong lòng khách du lịch

Một số sản phẩm rượu vang sim trong nước:

Hình 1.3 Một số sản phẩm rượu vang sim trong nước

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng ngiên cứu

- Qủa sim (Rhodomyrtus tomentosa) được thu mẫu từ địa bàn tỉnh

Vĩnh Phúc

- Chủng nấm men được phân lập từ dịch siro sim 68oBx

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.1 Hóa chất

- Các loại đường chuẩn: saccarozo, fructozo, glucozo

- Một số chất vô cơ và hữu cơ: MgSO4.7H2O; K2HPO4; (NH4)2SO4; (NH4)2HPO4; NaOH; HCl, rượu etylic, pepton, agar, phenolphthalein

2.2.2 Dụng cụ thiết bị

- Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)

- Nồi hấp Tommy (nhật)

- Box vô trùng (Haraeus)

- Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

- Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

- Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl – 10ml

- Máy so màu UV – vis (Nhật)

- Máy đo pH (MP 200R - Thuỵ Sĩ)

- Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)

- Máy cất nước 2 lần (Hamilton – Anh)

- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)

- Kính lúp soi nổi STEMI 2000-C

- Máy điện di

- Máy PCR

- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác

2.3.3 Môi trường lên men (Môi trường 3, MT3)

1 Dịch siro hoa quả 200ml

2.4.1.1 Phương pháp phân lập tuyển chọn và bảo quản, nhân giống nấm men

theo phương pháp Pasteur trên môi trường thạch đĩa

- Để chọn một số chủng nấm men ta sử dụng phương pháp phân lập trên

hộp petri, sau đó tuyển chọn dựa trên việc nghiên cứu hình thái tế bào, xác định số lượng tế bào, hoạt lực lên men Môi trường tuyển chọn các khuẩn lạc nấm men là môi trường Hanen (MT1)

- Cách tiến hành: Môi trường phân lập được khử trùng, phân chia vào các hộp petri vô trùng và để nguội Dịch quả được pha loãng bằng nước cất với độ pha loãng 10-1-10-10 Nhỏ 1-2 giọt huyền phù lên bề mặt thạch, dùng bàn trang đã vô trùng dàn đều Gói kín và nuôi trong tủ ấm ở 28oC-30oC Sau 2-3 ngày, trên bề mặt thạch xuất hiện các khuẩn lạc Ta tiến hành chọn các khuẩn lạc to, màu trắng hoặc vàng nhạt, có hình tròn, bề mặt nhẵn bóng, trên đỉnh có một núm nhỏ, mép có thể có răng cưa hoặc nhẵn Khi quan sát trên kính hiển vi điện tử các tế bào có hình ovan hoặc hình trứng Đó là đặc trưng của khuẩn lạc tế bào nấm men

2.4.1.2 Phương pháp hoạt hóa giống

Các khuẩn lạc được chọn sẽ cấy vào thạch nghiêng để ở 28oC - 30oC trong tủ ấm, sau 48 giờ được giống cấp 1 Nấm men dùng trong nhân giống tiếp được lấy từ thạch nghiêng Giống từ ống thạch nghiêng có thể được bảo quản trong ngăn lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121oC trong 20 phút sau đó đem xử lý trong đèn tím tối thiểu15 phút Cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ ở 28oC - 30oC, được giống cấp 2 Dùng giống cấp 2 để lên men

2.4.1.3 Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men

Gồm 2 phương pháp sau:

- Phương pháp cân bình trọng lượng:

Lên men trong các bình có thể tích 250ml, môi trường có cùng một lượng tế bào nấm men của các giống khác nhau Sau 24 giờ lên men đem cân trọng lượng bình một lần khi lệch giữa hai lần cân là 0,1 thì dừng lại

- Phương pháp xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Goriaev

Cấy giống vào môi trường nhân giống, nuôi ở 28oC lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ loãng canh trường Sau đó dùng pipet lấy dung dịch pha loãng cho một giọt vào khe hở giữa lưới đếm và kính

Chú ý: tránh để rơi xuống các rãnh tạo thành bọt khí rồi đặt lá kính lên, để yên 3 - 5 phút sau đó tiến hành soi trên kính hiển vi quang học ở vật kính x100 với độ phóng đại 1000 lần Đếm số lượng tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau theo công thức sau:

M=A.25.50.N Trong đó: M: số lượng tế bào trong 1 ml dịch huyền phù

N: độ pha loãng của dịch huyền phù A: số lượng tế bào trung bình có trong 1 ô vuông

2.4.1.4 Phương pháp quan sát tế bào nấm men trên KHV quang học có độ phóng đại 1000 lần

Nấm men được nuôi cấy trong môi trường nhân giống (MT2) Sau 24 giờ nuôi cấy ở 28oC-300C, tiến hành nhuộm tiêu bản sống bằng phương pháp nhuộm đơn chỉ sử dụng 1 nhuộm sử dụng một loại thuốc nhuộm.Tiến hành làm vết bôi vi sinh vật, sau đó nhỏ một, hai giọt xanh metylen hay fucshin Sau 2 phút, rửa nhẹ bằng nước, thấm khô tiêu bản, rồi quan sát trên KHV quang học có độ phóng đại 1000 lần

Soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đại 1000 lần)

2.4.1.5 Xác định khả năng kết lắng

Hòa sinh khối nấm men vào dung dịch đệm axetat (có pH: 4,6) được đựng trong các ống nghiệm có hình dạng và kích thước như nhau với thể tích dung dịch đệm và số lượng nấm men hòa tan bằng nhau Lắc kỹ trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong thời gian 3-5 phút, để lắng 15 phút Lúc này toàn bộ khối dịch phân thành hai lớp (phía dưới đáy của ống nghiệm là nấm men đã kết lắng)

Ta tiến hành đo chiều cao của chủng nấm men trong từng ống nghiệm để xác định khả năng kết lắng của chủng nấm men Ống nghiệm nào có chiều cao kết lắng cao nhất là chủng nấm men có độ kết lắng tốt nhất [11]

2.4.2 Phương pháp hóa học

2.4.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng chất khô bằng khúc xạ kế và xác định độ cồn bằng cồn kế

a) Đo hàm lượng chất khô bằng khúc xạ kế

Dùng nước cất rửa sạch mặt kính bên trong khúc xạ kế và dùng giấy thấm lau khô thiết bị Dùng ống nhỏ giọt lấy mẫu nhỏ lên mặt kính của khúc

xạ kế và đậy nắp lại Đưa khúc xạ kế hướng ra ánh sáng và nhìn vào ống kính

ta thấy hai vùng hồng và trắng Vạch ngăn cách giữa hai vùng chỉ vào giá trị nào thì giá trị đó chính là nồng độ chất khô của dung dịch Nếu khi nhìn vào chỉ có vùng sáng thì nồng độ chất khô của dịch có giá trị lớn hơn khoảng giá trị đo có của khúc xạ kế Ngược lại, nếu khi nhìn vào chỉ có vùng tối thì nồng độ chất khô của dịch có giá trị nhỏ hơn khoảng giá trị đo của khúc xạ kế

b) Đo hàm lượng cồn bằng cồn kế

Lấy cồn kế thả trong rượu và căn cứ vào độ chìm/nổi của cồn kế mà đọc chỉ số trên vạch Chỉ số độ cồn chỉ chính xác ở một nhiệt độ thích hợp (18-20 °C)

2.4.2.2 Phương pháp xác định độ pH bằng máy đo pH

2.4.2.3 Phương pháp xác định acid bằng chuẩn độ với NaOH có phenolphtalain 0,1% làm chỉ thị

Cho vào cốc thủy tinh (loại 100ml hoặc 200ml) dịch lên men, thêm vào

đó 1 – 2 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N Chú ý chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt Sau đó tính số gam acid tổng số trong 100 ml dung dịch lên men theo công

thức [10]: