Nghiên cứu hoàn thiện quy trình lên men kombucha từ trà tân cương, thái nguyên

Khi các vi sinh vật được nuôi trong môi trường trà dược, cung cấp đủ nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dưỡng căn bản khác chúng phát triển và biến đổi đường thành axi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH - KTNN -

LỜI CẢM ƠN

Em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến TS.Phương Phú Công đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình thực

hiện và hoàn thành đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh- KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ để hoàn thành khóa luận

Xin chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội

2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh- KTNN, đã tạo mọi điều kiện cho em học tập và hoàn thành đề tài

Em xin cảm ơn các thầy cô và bạn bè, các anh chị học viên cao học đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian làm đề tài

Lời cảm ơn sâu sắc nhất xin dành cho gia đình và những người thân yêu đã động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 08 tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Hằng

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng em.Các kết quả nghiên cứu, số liệu, bảng biểu, hình ảnh được trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với các công trình của các tác giả khác

Hà Nội, ngày 08 tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Hằng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.Tổng quan đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu 4

1.1.1 Giới thiệu về kombucha 4

1.1.2 Hệ vi sinh vật trong kombucha 5

1.2 Lợi ích của trà kombucha 8

1.2.1 Giải độc 8

1.2.2 Hỗ trợ tiêu hóa 8

1.2.3 Tăng thêm năng lượng 9

1.2.4 Tăng cường miễn dịch 9

1.2.5 Tốt cho xương khớp 9

1.2.7 Giảm cân 10

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10

1.3.1 Các nghiên cứu về kombucha trên thế giới 10

1.3.2 Các nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam 11

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng nghiên cứu 13

2.1.1 Mẫu thực vật: Cây trà 13

2.1.2 Mẫu vi sinh vật 13

2.1.3 Hóa chất và thiết bị 13

2.2 Phạm vi nghiên cứu 14

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

2.4 Phương pháp nghiên cứu 14

2.4.1 Phương pháp vi sinh 14

2.4.2 Phương pháp hóa sinh 17

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu hoàn thiện quy trình lên men kombucha

từ trà Thái Nguyên 18

2.4.4 Phương pháp cảm quan 18

2.4.5 Xử lí số liệu bằng thống kê toán học 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 22

3.1 Phân lập các chủng VSV có khả năng lên men kombucha từ trà Tân Cương Thái Nguyên 22

3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn Acetobacter có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên 22

3.1.2 Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên 25

3.2 Tuyển chọn các chủng VSV có khả năng lên men kombucha 27

3.2.1 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha 27

3.2.2 Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men kombucha 28

3.3.2 Động thái sinh trưởng của các chủng nấm men M2 29

3.3 Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến lên men kombucha 30

3.3.1 Hàm lượng đường glucose 30

3.3.2 Nhiệt độ 32

3.4 Hoàn thiện quy trình lên men kombucha từ trà Tân Cương, Thái Nguyên 33

3.4.1 Thuyết minh quy trình 33

3.4.2 Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha bằng phương pháp cảm quan 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

1 Kết luận 38

2 Kiến nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Công thức các loại môi trường 13

Bảng 2.2 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha 19

Bảng 2.3 Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu 20

Bảng 2.4 Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 20

Bảng 3.1 Hàm lượng axit sinh ra sau 7 ngày 27

Bảng 3.2 Chất lượng cảm quan trà kombucha lên men từ 4 chủng VK 28 Bảng 3.4 Động thái sinh trưởng của chủng nấm men M2 29

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men của chủng nấm men M2 31

Bảng 3.6 Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha bằng 37

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 Dịch trà kombucha lên men tự nhiên 22

Hình 3.2 Ảnh chụp khuẩn lạc chủng vi khuẩn K1, K2, K3 trên môi trường thạch đĩa 23

Hình 3.3 Chủng K1, K2, K3 trên môi trường thạch nghiêng 24

Hình 3.4 Tế bào vi khuẩn K2, K3 trên kính hiển vi quang học X 1000 lần 24

Hình 3.5 Ảnh chụp khuẩn lạc chủng nấm men M1, M2 trên môi trường thạch đĩa 25

Hình 3.6 Chủng M1, M2 trên môi trường thạch nghiêng 26

Hình 3.7 Tế bào nấm men M1, M2 trên kính hiển vi quang học X

1000 lần 26

Hình 3.8 Môi trường dịch thể 4 chủng VK 27

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng NM M2 29

Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót ở 32

các nhiệt độ lên men 32

Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng acid tổng số 32

ở các nhiệt độ lên men 32

Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha

sau 9 ngày lên men ở các nhiệt độ khác nhau 33

Hình 3.13 Sơ đồ quy trình lên men kombucha………36

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Trà kombucha hay được gọi là trà “thủy sâm” hay “Thủy hoài sâm” hay

“Trà giấm” là một thứ nước pha chế từ loại con giấm gọi là thủy sâm hay thủy hoài sâm Đây là một thức uống được lên men trong dung dịch trà đường, là môi trường hỗn hợp phức tạp cộng sinh giữa vi khuẩn và nấm men Thủy sâm là một loại cái giấm phát triển dưới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng Khi các vi sinh vật được nuôi trong môi trường trà dược, cung cấp đủ nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dưỡng căn bản khác chúng phát triển và biến đổi đường thành axit lactic, axit gluconic, đồng thời sản xuất ra một lượng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi thành axit axetic (tối đa khoảng 3%) tạo cho trà có vị ngọt và có mùi chua giống mùi của rượu táo lên men Thành phần trà sau cùng chứa trung bình 0,5-1% alcohol, một lượng nhỏ axit lactic, axit malic, axit acetic, axit malonic và axit oxalic Lượng vitamin B trong thành phẩm khá cao, ngoài ra còn có một lượng nhỏ vitamin C Trà lên men kombucha là loại đồ uống thông dụng và phổ biến ở các nước Đông Âu và các nước khác, nó được biết đến như một loại thực phẩm có lợi cho sức khỏe Ở nước ta, loại trà lên men này đã được sản xuất nhỏ lẻ trong một số hộ gia đình, nhưng chưa có nghiên cứu nào sản xuất trên quy mô công nghiệp Sản phẩm trà lên men kombucha được sử dụng ngay sau khi lên men, hoặc bảo quản lạnh trước khi dùng Điều này gây hạn chế thời gian, điều kiện bảo quản và khả năng tiêu thụ sản phẩm [20] Trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về trà kombucha như quá trình phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật; nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men như môi trường dinh dưỡng, điều kiện môi trường,… Có thể nói việc hoàn thiện một quy trình lên men là cả một quá trình gồm nhiều công đoạn và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khi làm thí nghiệm lên men vào mùa

ẩm ướt thì sản phẩm kombucha dễ bị nhiễm mốc thì không uống được hay

trong quá trình nhân giống chúng ta cho nhiều pepton quá thì trà kombucha có mùi khó chịu Như vậy việc hoàn thiện đó đã trực tiếp quyết định đến chất lượng của trà kombucha Sản phẩm cuối cùng mang lại là kết quả cuối cùng

và phải mang hương vị thơm, ngon, màu sắc đẹp mắt Chính vì vậy, em quyết

định chọn đề tài: “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình lên men kombucha từ trà Tân Cương, Thái Nguyên”

2.Mục đích nghiên cứu

Xây dựng được quy trình lên men tạo sản phẩm kombucha mang hương vị thơm ngon từ trà Thái Nguyên

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập chủng VSV có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên 3.2 Tuyển chọn chủng VSV có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên

3.3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến lên men kombucha từ trà Thái Nguyên

3.4 Hoàn thiện quy trình lên men kombucha từ trà Tân Cương Thái Nguyên quy mô phòng thí nghiệm

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa học

Các nghiên cứu về trà kombucha đem lại cho con người những hiểu biết

về sinh trưởng và phát triển về hệ vi sinh vật , biết được quy trình lên men kombucha từ trà Thái Nguyên nói chung và áp dụng với nhiều loại trà từ các vùng khác nhau để có sản phẩm khác nhau

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tạo sản phẩm kombucha mang hương vị thơm ngon như mong muốn

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1 Phương pháp vi sinh

5.2 Phương pháp hóa sinh

5.3 Xử lí số liệu bằng thống kê toán học

6 Điểm mới của đề tài

Nghiên cứu được một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men kombucha

để hoàn thiện quy trình lên men như hàm lượng glucose là 100g/l, nhiệt độ thích hợp là 300C

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tổng quan đối tượng, lĩnh vực nghiên cứu

1.1.1 Giới thiệu về kombucha

Kombucha - không thật sự là một loại nấm mà là một cấu trúc có dạng như thạch jelly màu xám, giống như miếng pancake đường kính có thể khoảng 15cm, thật ra là một hỗn hợp phức tạp cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn Kombucha đã có một thời nổi tiếng tại Châu Âu và Hoa Kỳ, nhiều bài báo đã được viết về kombucha, đăng tải trên các tạp chí quốc tế Kombucha có thể được xếp vào loại thực phẩm lên men, và việc sử dụng dung dịch kombucha rất có lợi cho sức khoẻ Nước trích do lên men kombucha đã được dùng trong

y học dân gian từ hàng chục thế kỷ Sách thuốc cổ Trung Hoa đã ghi chép về một loại “Thiên Trà” từ năm 221 trước Tây Lịch, trà này được xem là một phương thuốc trường sinh Tuy nhiên theo GW Frank trong tập sách

‘Kombu’ (1991) thì kombu là tiếng Nhật để gọi một loại rong biển và ‘cha’ là trà và kombucha phát xuất từ một loại nuớc uống chế tạo từ rong biển Trà kombucha sau đó được lan truyền sang Ấn Độ, Nga và các nước Đông Âu Trong thập niên 60, một y sĩ Đức, Ông Sklenar đã đưa ra “một phương pháp sinh học” để trị ung thư, sử dụng phần chính là kombucha Đối với các nước Đông Âu và một số nước khác nói chung và Việt Nam nói riêng, trà đã trở nên quen thuộc và gần gũi Uống trà không những chỉ để giải khát mà còn có khả năng phòng trị bệnh tật, nâng cao sức khỏe, kéo dài tuổi thọ cho con người Quá trình lên men được bắt đầu bằng con nấm giống hay chính là sự lên men cộng sinh của vi khuẩn và nấm men Sản phẩm trà lên men kombucha được sử dụng ngay sau khi lên men, hoặc bảo quản lạnh trước khi

dùng [19]

1.1.2 Hệ vi sinh vật trong kombucha

1.1.2.1 Acetobacter

Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae, phân bố rộng rãi

trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, giấm, rượu, bia, hoa quả… Có khoảng 20 loài

thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có

ý nghĩa kinh tế

* Đặc điểm chung của chủng Acetobacter

Chủng Acetobacter có dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế

bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra Kích thước thay đổi tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0μm) Có thể di động (có tiên mao đơn hoặc chu mao) hoặc không di động (không có tiên mao) Hiếu khí bắt buộc, chịu được

độ acid cao Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn

cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột Tế bào đứng riêng lẽ hoặc kết thành từng chuỗi Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng,

khả năng tạo thành váng thay đổi tùy loại: Acetobacter xylinum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã Acetobacter có khả

năng đồng hoá muối (NH4)+ và phân giải pepton Một số loài đòi hỏi một số acid amin nhất định như acid pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe,

P, S …ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ Do đó bia, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây…là nguồn dinh dưỡng rất tốt

cho sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter Ngoài khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B1, vitamin B2, oxy hoá sorbit thành đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C) [4]

1.1.2.2 Nấm men

* Hình thái và cấu tạo tế bào

Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ… kích thước rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình: Chiều dài: 9 – 10μm, chiều rộng: 2 – 7μm Hình dạng và kích thước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản như: glucan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin… Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzyme permeaza…Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit, gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó Nhân tế bào và những thành phần cơ quan con khác: không bào, ty lạp thể, riboxom,…

* Sự sinh sản của nấm men

Nấm men có một số hình thức sinh sản: nảy chồi; phân đôi; sinh sản bằng bào

tử và hình thành bào tử (tiếp hợp đẳng giao; tiếp hợp dị giao; sinh sản đơn tính)

* Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men

Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon, nitơ, phospho, kali, magiê…

Dinh dưỡng cacbon: nguồn cacbon cung cấp là các loại đường khác nhau: saccharose, maltose, lactose, glucose…Dinh dưỡng oxy, hydro: được cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch Dinh dưỡng nitơ: nấm men không có men ngoại bào để phân giải protein, nên không thể phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton, urê Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat…Các vitamin và chất khoáng:

Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men Phospho:

có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết có năng lượng lớn Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và enzyme Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê

*Cơ chế vận chuyển các chất dinh dưỡng vào trong tế bào nấm men

Nấm men hoàn toàn không có cơ quan dinh dưỡng riêng biệt, các chất dinh dưỡng mà nó sử dụng chủ yếu được vận chuyển qua thành tế bào theo hai con đường cơ bản: Thẩm thấu bị động: trên thành tế bào nấm men có những lỗ nhỏ, những lỗ này có tác dụng làm cho chất dinh dưỡng vận chuyển vào trong

tế bào từ môi trường bên ngoài nhờ áp suất thẩm thấu, ngược lại chất thải trong quá trình trao đổi cũng được thải ra theo con đường này Hấp thu chủ động: các thành phần dinh dưỡng không có khả năng xâm nhập vào tế bào theo con đường thứ nhất thì lập tức có hệ permeaza hoạt hóa Permeaza là một protiein hoạt động, chúng liên kết với chất dinh dưỡng tạo thành hợp chất và hợp chất này chui qua thành tế bào trong, tại đây chúng lại tách ra và permeaza lại tiếp tục vận chuyển tiếp [4]

1.1.2.3 Giống vi khuẩn lên men lactic

Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium Đây là những trực khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không

có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất Nhiệt

độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 500C Tuy nhiên mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn

1.2 Lợi ích của trà kombucha

Trà là một thức uống phổ biến của nhiều dân tộc trên thế giới Đặc biệt ở các nước châu Á, ngoài việc dùng làm thức uống hàng ngày, người ta còn nâng việc thưởng thức nó lên thành “trà đạo” – một thú tiêu khiển mang tính nghệ thuật cao chứ không còn chỉ là một món giải khát

1.2.1 Giải độc

Kombucha có chứa nhiều acid glucuronic (GA) GA giúp giải độc gan bằng cách kết hợp với các chất thải, độc tố sinh ra từ các dược phẩm và ô nhiễm môi trường rồi chuyển hoá chúng thành các hợp chất dễ hoà tan mà cơ thể có

thể dễ dàng đẩy ra ngoài Trong một nghiên cứu, nhờ uống kombucha mà các

tế bào gan đã được bảo vệ khỏi sự oxy hóa và vẫn duy trì sinh lý bình thường mặc dù bị tiếp xúc với một chất độc cụ thể Theo các nhà nghiên cứu, đây là

"do các hoạt động chống oxy hóa của kombucha và có thể có lợi đối với bệnh

gan, nơi stress oxy hóa (oxidative stress) xảy ra"

1.2.2 Hỗ trợ tiêu hóa

Kombucha có khả năng chống oxy hóa nên có thể chống lại các gốc tự do gây rối loạn tiêu hóa Bên cạnh đó, vì là men tiêu hóa, kombucha giúp gia tăng lượng vi khuẩn có lợi trong ruột, nhờ sản sinh acid lactic Vi khuẩn này

tác động giống như vi khuẩn Acidophilus thường có trong các loại sữa chua

Ngoài ra, hai loại acid lactic và acid acetic giúp tăng nhanh quá trình lên men trong ruột, giúp ngừa táo bón, nhiễm trùng đường ruột, kiết lỵ, rối loạn tiêu hóa, chữa viêm loét ruột và dạ dày Kombucha còn có thể giúp chữa lành nhiễm trùng nấm men (nấm candida) trong ruột và giúp khôi phục lại sự cân bằng cho hệ tiêu hóa

1.2.3 Tăng thêm năng lượng

Kombucha có thể tiếp thêm sinh lực con người nhờ sự hình thành của chất sắt trong quá trình lên men trà đen Nó cũng chứa một lượng rất nhỏ caffeine

và vitamin B có khả năng tăng năng lượng cho cơ thể Kombucha giàu chất sắt có thể giúp tăng lượng hemoglobin trong máu, cải thiện nguồn cung cấp oxy đến các mô và kích thích quá trình sản xuất năng lượng ở cấp độ tế bào Nói cách khác, bằng cách giúp cơ thể tạo ra nhiều năng lượng (ATP), loại trà

cổ xưa này còn có thể giúp những người thường xuyên uống nó tràn đầy sinh lực

1.2.4 Tăng cường miễn dịch

Kombucha có thể kiểm soát các gốc tự do thông qua các biện pháp chống oxy hóa, nhờ đó giúp tăng cường miễn dịch Bởi lẽ, stress oxy hoá làm suy yếu hệ thống miễn dịch nhưng sẽ bị triệt tiêu nhờ một chất chống oxy hóa mạnh mẽ được gọi là acid D -Arabino-1,4-lactone (DSL) đã được phát hiện trong quá trình lên men kombucha Các nhà khoa học cho rằng DSL và các vitamin C hiện diện trong kombucha chính là bí mật giúp nó chống lại các tổn thương tế bào, chống viêm, các khối u và trầm cảm

1.2.5 Tốt cho xương khớp

Kombucha có thể giúp chữa lành, sửa chữa và ngăn ngừa tổn thương xương khớp theo nhiều cách: kombucha kết hợp các glucosamine làm tăng sản xuất acid hyaluronic, hỗ trợ việc duy trì các collagen và ngăn ngừa cơn đau do viêm khớp Bên cạnh đó, nó cũng hỗ trợ sản xuất collagen trên toàn bộ

cơ thể và làm giảm sự xuất hiện của các nếp nhăn

1.2.6 Phòng chống ung thư

Kombucha cũng có lợi trong việc phòng chống ung thư và tăng khả năng phục hồi sức khoẻ ở các bệnh nhân mắc bệnh này Uống kombucha thường xuyên giúp ngăn chặn sự phát triển ung thư ở giai đoạn đầu nhờ glucuronic, acid lactic và acid acetic cũng như các hợp chất kháng sinh của nó Nó có thể

có tác dụng chống ung thư đặc biệt là đối với các khối u phụ thuộc vào hormone Nhiều nghiên cứu cho thấy, kombucha có thể hữu ích trong phòng ngừa và điều trị ung thư tuyến tiền liệt, chống ung thư phổi, u xương ác tính, ung thư thận

kể nồng độ cholesterol LDL từ đó ngăn ngừa xơ vữa động mạch, ngăn ngừa thiếu máu, giảm stress [20]

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.3.1 Các nghiên cứu về kombucha trên thế giới

Trà kombucha được sử dụng rộng rãi ở một số nước trên thế giới như: Trung Quốc, Nhật Bản, Nga, Pháp,…Từ 1852, trà kombucha đã được chú trọng nghiên cứu, chủ yếu là ở Châu Âu Khoảng thời gian từ năm 1925 đến

1950, một số nghiên cứu y khoa đã xác nhận những tuyên bố truyền thông về kombucha và báo cáo một số lợi ích của trà kombucha Có thể kể đến là: Bacinskaja (1914) và cộng sự cho rằng kombucha tốt cho hệ tiêu hóa, điều chỉnh các hoạt động đường ruột, đặc biệt là chống táo bón Đến năm 1927, Madaus đã có những nghiên cứu và đưa ra kết luận nấm kombucha và các sản phẩm chuyển hóa của nó có tác động tích cực trong việc tái sinh vách tế bào, một phương thuốc tuyệt vời cho bệnh xơ vữa động mạch Vào năm 1987, Veronika Carstens trong nghiên cứu của mình đã chỉ ra: kombucha có tác dụng giải độc cơ thể, cải thiện chức năng hệ miễn dịch Các nghiên cứu về

định danh các chủng vi sinh vật trong kombucha và ứng dụng của các chủng được phân lập từ kombucha cũng đã có từ rất lâu: Từ năm 1928, Hermann đã

định danh hai chủng Bacterium xylinum và B xylinoides và B gluconicum

Các nhà nghiên cứu còn xác định được kombucha là một sự hợp tác cộng sinh

giữa Bacterium xylinum cùng các vi khuẩn khác, với những tế bào nấm men thuộc chủng Saccharomyces, tạo thành một khối như tổ chim Vào năm 1973, List và cộng sự đã phân lập được Acetobacter ketogenum; Pichia fermentans; Saccharomyces apiculatus; S.ludwigli; B.xylinoides; Schizosaccharomyces pombe từ dịch nuôi cấy kombucha Năm 2001, Kurtzman CP và cộng sự đã

phân lập được một chủng nấm men mới từ kombucha và đặt tên là

Zygosaccharomyces kobuchaensis Vào năm 2006, Dutta D và cộng sự đã có công trình nghiên cứu về khả năng cố định đạm của chủng Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov được phân lập từ trà kombucha

Các nghiên cứu về kombucha trên thế giới rất đa dạng , phong phú Mặc

dù vậy nghiên cứu về quy trình hoàn thiện quá trình lên men kombucha còn ít

1.3.2 Các nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam

Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về trà kombucha Lương y Đinh Công Bảy, Tổng thư ký Hội Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh, cho biết ông cũng nghe nói đến thủy sâm, tuy nhiên do chưa nghiên cứu nên chưa thể trả lời về công dụng thực sự của loại trà này Theo Hà Văn Hùng cho rằng cho đến nay Viện cũng chưa có công trình nào nghiên cứu về thủy sâm nên không biết rõ thành phần và công dụng của nó Tác giả Phan Đức Bình cho biết, những quảng cáo kiểu trà kombucha có khả năng “cải lão hoàn đồng, tái tạo tóc, ngừa ung thư, trị bách bệnh…” đều không có những bằng chứng xác thực Ở Việt Nam, cũng đã có một số công trình nghiên cứu về kombucha như: Vào năm 2012, Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cộng sự đã có công trình nghiên cứu “ Nghiên cứu hệ vi sinh vật của trà kombucha và hiệu quả tác dụng trên một số chỉ tiêu sinh lý chuột” Kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra hệ vi sinh vật

trong kombucha bao gồm: vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic và nấm men, đồng thời khảo sát tác dụng của kombucha trên một số chỉ tiêu sinh lý của chuột như: cân nặng, tổng lượng hồng cầu, tổng lượng bạch cầu, sức khỏe của chuột thí nghiệm qua mô hình bơi kiệt sức Sản phẩm kombucha có tác dụng tăng cường sức khỏe, không gây ảnh hưởng xấu tới các chỉ tiêu sinh lý của chuột Gần đây là đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chế biến tới một số tính chất và hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha” của Thạc sĩ Tôn Nữ Liên Hương trường Đại học Cần Thơ năm 2012, đề tài “Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang” của ThS Lâm Thị Hồng Liên và “Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Thái Nguyên” của ThS Lê Thi Huệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 năm

2013 Đề tài: “Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha

từ chè Ngọc Thanh” của tác giả Đinh Thị Tuyết trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 năm 2015

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Bảng 2.1 Công thức các loại môi trường

STT Thành phần Môi trường vi khuẩn Môi trường nấm men

MT1 : Môi trường phân lập giống vi khuẩn

MT2 : Môi trường nhân giống cơ bản của vi khuẩn

MT3 : Môi trường lên men kombucha đối với vi khuẩn

MT4 : Môi trường phân lập nấm men (môi trường Hanxen)

MT5 : Môi trường nhân giống nấm men

MT6 : Môi trường lên men nấm men

- Pipet (lapsystem-Phần Lan)

Một số dụng cụ cần thiết khác như: vontex, cân, kính kiển vi quang học, ống nghiệm, que trang, bình tam giác,……

2.2 Phạm vi nghiên cứu

Quy trình hoàn thiện quá trình lên men kombucha từ trà Thái Nguyên

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian:Từ tháng 8 năm 2015 đến tháng 5 năm 2016

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiêm vi sinh vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1.1.2 Phương pháp nghiên cứu hình thái tế bào

Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng có khả năng lên men kombucha làm vết bôi trên lam kính nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 1000 lần

 Với nấm men: Nhuộm đơn là chỉ dùng 1 loại thuốc nhuộm và theo quy trình như sau:

Bước 1: Làm tiêu bản

Bước 2: Chỉ cần nhuộm bằng fucshin (tím gentian hoặc xanh metylen)

từ 1- 2 phút

Bước 3: Rửa tiêu bản bằng nước cất

Bước 4: Thấm khô tiêu bản và soi kính

 Với vi khuẩn: Nhuộm kép là nhuộm với 2 thuốc nhuộm trở lên và theo quy trình sau:

Bước 1: Làm tiêu bản

Bước 2: Nhuộm tím gentian từ 1- 2 phút

Bước 3: Nhuộm Lugol từ 1-2phút

Bước 4: Rửa mẫu bằng nước cất

Bước 5: Tẩy bằng cồntrong 30 giây

Bước 6: Rửa mẫu bằng nướccất

Bước 7: Nhuộm mẫu bằng Fucshintrong 1 phút

Bước 8: Rửa mẫu bằng nước cất

Bước 9: Thấm khô mẫu và soi kính [5]

2.4.1.1.3 Phương pháp đếm số lượng tế bào

Tiến hành: Cấy giống vào môi trường nhân giống ở 280C, lắc đều canh trường dung pipet chia độ pha loãng canh trường.Dùng pipet lấy dịch pha loãng nhỏ vào một khe hở giữa 2 tấm kính, chú ý tránh tạo bọt khí sau đó đặt lá kính lên trên để yên 3-5p rồi tiến hành soi kính hiển vi ở vật kính 10 và 40 đếm số tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau

Cách tính số tế bào nấm men trong 1ml: M= A 50 B

Trong đó: M: Số tế bào trong 1ml dịch huyền phù

A: Số lượng tế bào trung bình trong 1 ô vuông

B: Hệ số pha loãng

- Cách tính số tế bào vi khuẩn: N= Ax25:V:n

Trong đó: A:Số lượng tế bào trung bình trong 1 ô lớn

V: Thể tích của 1 ô lớn

n :Độ pha loãng của mẫu

2.4.1.1.4 Bảo quản chủng giống

Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 300C Sau đó giữ trong tủ lạnh

40C dùng cho nghiên cứu tiếp theo Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kì hai tháng một lần

2.4.1.1.5 Phương pháp hoạt lực lên men

Xác định hoạt lực lên men của mẫu nấm men đã được phân lập và tuyển chọn thông qua xác định hàm lượng CO2 thoát ra( g/l dịch lên men) bằng phương pháp cân bình trọng lượng Hàm lượng CO2 thoát ra càng nhiều thì chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt