Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh chế polyphenol từ chè xanh vụn phế liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI o0o LÊ THỊ BÁCH DIỆP NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TINH CHẾ POLYPHENOL TỪ CHÈ XANH VỤN PHẾ LIỆU Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS HÀ DUYÊN TƯ Hà Nội, 2010 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vài nét giới thiệu chè [11], [15] 1.1.1 Tên gọi nguồn gốc chè .3 1.1.2 Đặc điểm hình thái chè 1.1.3 Các giống chè trồng chủ yếu Việt Nam 1.1.4 Các vùng chè Việt Nam .4 1.1.5 Thành phần hóa học chè .5 1.2 Các hợp chất Polyphenol có chè .7 1.2.1 Hợp chất catechin 1.2.2 Hợp chất anthoxanthin [19] 11 1.2.3 Hợp chất anthocyanin 12 1.2.4 Hợp chất leucoanthocyanin [19] 12 1.2.5 Các axit phenol cacboxylic 13 1.3 Hoạt tính sinh học hợp chất polyphenol chè xanh .13 1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa flavonoid 13 1.3.2 Tác dụng enzym 15 1.3.3 Tác dụng kháng sinh, chống viêm nhiễm [21] 16 1.3.4 Tác dụng ung thư 16 1.3.5 Các tác dụng khác chè xanh [2] 17 1.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất polyphenol từ chè xanh 17 1.4.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất polyphenol giới .17 1.4.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất polyphenol chè xanh Việt Nam.18 1.5 Công nghệ tách tinh chế polyphenol từ chè xanh [6], [4], [3] 19 1.5.1 Chiết tách clorophyl, cafein chất khác [3], [26], [10] 19 1.5.2 Chiết tổ hợp polyphenol-catechin [3], [4], [17], [26] 20 1.5.3 Quy trình trích ly – tinh chế polyphenol từ chè xanh : [3], [13], [14] 21 1.6 Quy hoạch thực nghiệm [18] 22 1.6.1 Định nghĩa quy hoạch thực nghiệm 22 1.6.2 Các bước quy hoạch thực nghiệm 23 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu .24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Chuẩn bị dịch chiết chè .24 2.2.2 Tối ưu hóa trình tách, tinh chế polyphenol 24 2.2.3 Phương pháp phân tích thành phần chế phẩm polyphenol 24 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính sinh học chế phẩm polyphenol.28 2.2.5 Quy hoạch thực nghiệm theo kế hoạch bậc hai trực giao [18] 30 2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Khảo sát sơ nguyên liệu 32 3.2 Tối ưu hóa trình tách, tinh chế polyphenol 33 3.2.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình tách, tinh chế polyphenol33 3.2.2 Thiết lập mô hình 36 3.2.3 Tối ưu hóa 41 3.2.4 Hoàn thiện quy trình trích ly – tinh chế polyphenol từ vụn chè xanh 42 3.3 Đánh giá hàm lượng, độ tinh khiết chế phẩm PP 43 3.4 Nghiên cứu đánh giá tác dụng sinh học chế phẩm PP 48 3.4.1 Phân tích khả kháng khuẩn 48 3.4.2 Phân tích hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả quét gốc tự DPPH 49 KẾT LUẬN .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO .52 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: KẾT QUẢ TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TÁCH, TINH CHẾ CHÈ XANH VỤN PHỤ LỤC B: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CATECHIN VÀ CAFEIN CỦA CHẾ PHẨM PP DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT EC : (-) – epicatechin ECG : (-) – epicatechin gallate EGC : (-) – epigallocatechin EGCG : (-) – epigallocatechin gallate GC : (+) – gallocatechin C : (+) – catechin GCG : (+) – gallocatechin gallate GTTB : Giá trị trung bình v/v : thể tích/thể tích PP : polyphenol HCBVTV : Hóa chất bảo vệ thực vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các catechin có chè xanh [7] Bảng 1.2: Hàm lượng catechin búp chè chiết etyl axetat [5] 11 Bảng 1.3: Khả ức chế catechin số gốc tự [25] .15 Bảng 1.4 Chiết tách tạp chất khỏi dịch chiết chè dung môi khác [3] 20 Bảng 3.1 - Độ hấp thụ màu axit gallic λ = 760nm 32 Bảng 3.2 - Kết khảo sát nguyên liệu chè vụn 32 Bảng 3.3 - Giá trị mã hóa thực nghiệm yếu tố thực nghiệm 36 Bảng 3.4 - Các thí nghiệm tiến hành kết .37 Bảng 3.5 - Kết phân tích hồi quy-hàm lượng polyphenol (Y1) 38 Bảng 3.6 - Kết phân tích hồi quy-hoạt tính chống oxy hóa (Y2) .39 Bảng 3.7 - Kết phân tích hồi quy-hàm lượng cafein (Y3) 39 Bảng 3.8- Kết phân tích thành phần chế phẩm PP .47 Bảng 3.9 - Đường kính vòng kháng khuẩn .48 Bảng 3.10 - Khả quét gốc tự DPPH chế phẩm .50 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 - Lá chè (Camellia sinensis) .3 Hình 1.2 - Công thức tổng quát catechin Hình 1.3 - Gốc galloyl .8 Hình 1.4 - Các công thức cấu tạo catechin chè [7] 10 Hình 1.5 – Sơ đồ quy trình trích ly polyphenol chè xanh 21 Hình 1.6 – Sơ đồ đối tượng nghiên cứu 23 Hình 3.1 - Đường chuẩn axit gallic 32 Hình 3.2 – Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi clorofooc/dịch chè .34 Hình 3.3 – Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi etyl axetat/dịch chè 35 Hình 3.4 – Ảnh hưởng nồng độ dịch chè 35 Hình 3.5 - Ảnh hưởng yếu tố đến trình tách tinh chế polyphenol .40 Hình 3.6 - Bề mặt đáp ứng hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa 41 polyphenol hàm lượng cafein 41 Hình 3.7 - Mức độ đáp ứng mong đợi – tinh chế polyphenol 42 Hình 3.8 - Sắc ký đồ phân tích catechin chế phẩm PP HPLC/DAD 43 Hình 3.9 – Đồ thị đường chuẩn catechin 45 Hình 3.10 – Phổ phân tích cafein chế phẩm PP GC/MS 46 Hình 3.11 – Đồ thị đường chuẩn cafein 47 Hình 3.12 - Hình ảnh vòng kháng khuẩn 49 MỞ ĐẦU Từ hàng nghìn năm nay, chè loại thức uống quen thuộc Việt Nam nhiều nước châu Á Về sau nước chè ngày phổ biến nước khác khắp giới Trong năm gần đây, nhờ áp dụng phương pháp nghiên cứu khoa học đại, người ta xác định thành phần chất có chè xanh, đặc biệt quan tâm nhóm hợp chất polyphenol với nhiều chất có hoạt tính sinh học mạnh mẽ chiếm hàm lượng tương đối lớn chè Do có tính chất chống oxy hóa mạnh, polyphenol từ chè sử dụng với nhiều mục đích, nhiều lĩnh vực khác dùng để bổ sung vào sản phẩm thực phẩm Hiện nay, việc sản xuất sản phẩm polyphenol trích ly từ chè mang lại lợi nhuận cao nhiều so với sản phẩm chè truyền thống hướng ưu tiên tất nước trồng chè giới Các sản phẩm polyphenol từ chè có giá trị thương mại cao sản xuất với quy mô công nghiệp nước có vùng trồng chè tập trung lớn Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ,… Việt Nam nước có diện tích trồng chè sản lượng chè lớn giới có điều kiện phù hợp cho ngành trồng chè Tuy nhiên việc khai thác, chế biến chè Việt Nam dừng lại việc sản xuất sản phẩm chè xanh từ búp, từ non chè xanh chủ yếu tập trung sản phẩm truyền thống trà đen, trà xanh, trà oolong, chưa trọng đến việc phát triển sản phẩm polyphenol Do đó, bỏ phí lượng lớn chè già, chè vụn phế phẩm trình sản xuất chưa khai thác hết tiềm chè Chính vậy, việc nghiên cứu khai thác nguồn polyphenol chè xanh từ nguồn nguyên liệu chè xanh phế liệu hướng nghiên cứu nhằm nâng cao giá trị nguồn lợi từ chè Việt Nam Kế thừa từ kết nghiên cứu khả quan gần công nghệ trích ly polyphenol từ chè xanh, với mục đích nhằm thu chế phẩm polyphenol có độ tinh khiết cao, thêm hiểu biết rõ ràng hơn, tạo sở cho ứng dụng polyphenol chè xanh vào đời sống ngày, đặc biệt lĩnh vực thực phẩm, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh chế Polyphenol từ chè xanh vụn phế liệu” với nhiệm vụ đặt sau: • Mục đích nghiên cứu: Hoàn thiện quy trình tinh chế Polyphenol từ chè xanh vụn phế liệu • Yêu cầu nghiên cứu: Xác định yếu tố ảnh hưởng tới trình tách, tinh chế polyphenol Chế phẩm Polyphenol phải đạt độ tinh khiết cao (hàm lượng polyphenol đạt 80%, hàm lượng cafein 10%) giữ hoạt tính sinh học (hoạt tính chống ôxy hóa hoạt tính kháng vi sinh vật) • Đối tượng nghiên cứu: Chè xanh vụn phế liệu vùng Phú Hộ, Phú Thọ • Nội dung nghiên cứu: Khảo sát sơ nguyên liệu hàm lượng polyphenol toàn phần, flavonoit tổng số độ ẩm Nghiên cứu tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng tới trình tách, tinh chế polyphenol - Nồng độ dịch chè - Tỉ lệ dung môi clorofooc/dịch chè thực giai đoạn tách clorofyl, cafein chất khác - Tỉ lệ dung môi etyl axetat/dịch chè thực giai đoạn chiết polyphenol với mục tiêu hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa cao hàm lượng cafein thấp Nghiên cứu đánh giá hàm lượng, độ tinh khiết chế phẩm polyphenol - Phân tích số thành phần catechin polyphenol tổng số - Phân tích hàm lượng cafein Nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học chế phẩm thông qua: - Khả kháng khuẩn - Khả chống ôxy hóa (khả quét gốc tự DPPH) CHƯƠNG 1.1 TỔNG QUAN Vài nét giới thiệu chè [11], [15] 1.1.1 Tên gọi nguồn gốc chè Cây chè có tên khoa học Camellia sinensis Lind O.Kuntze, tên gọi sinensis tiếng Latinh có nghĩa Trung Quốc Chè thuộc: Ngành :Bí tử (Angiospermae) Lớp :Song diệp tử (Dicotylednae) Bộ :Sơn trà (Theals) Họ :Trà (Theacea) Chi :Trà (Camenllia) Loài :Camellia sinensis Hình 1.1 - Lá chè (Camellia sinensis) Năm 1976, Viện sĩ thông Viện Hàn Lâm khoa học Liên Xô, sau nghiên cứu tiến hóa chè, phân tích chất catechin chè mọc hoang dại, vùng chè Tứ Xuyên, Vân Nam Trung Quốc vùng chè cổ Việt Nam (Suối Giàng, Nghĩa Lộ, Lạng Sơn, Nghệ An …) kết luận: Cây chè cổ Việt nam, tổng hợp catechin đơn giản nhiều chè Vân Nam Từ có sơ đồ tiến hóa chè giới sau đây: Chè Việt Nam Æ chè Vân Nam to (chè Trung Quốc) Æ chè Assam (Ấn Độ) 1.1.2 Đặc điểm hình thái chè Chè loại sống xanh tươi quanh năm, chủ yếu vùng nhiệt đới, ôn đới Căn vào đặc tính sinh trưởng hình thái, người ta phân thành loại: - Cây bụi: nhỏ, phân bố nhiều cành, gọn, cành mọc từ cổ rễ, sau cành phát triển theo tuổi Loại thân mặt đất, cao từ 23m, chịu lạnh, trồng chủ yếu ở: Nga, Trung Quốc, Nhật Bản - Cây trung bình: thân nhỏ, phân cành từ thấp, cành mọc xiên với thân góc định, cành mọc phân tán cao tới 6m; loại sống chủ yếu vùng nhiệt đới - Cây to: thân to, lên cao bắt đầu phân cành, để mọc tự nhiên cao tới 17m 1.1.3 Các giống chè trồng chủ yếu Việt Nam Dựa theo đặc điểm thực vật học, sinh hóa, nguồn gốc phát sinh chè, người ta chia Camellia sinensis (L) O.Kuntze thành loại: chè Trung Quốc to, chè Trung Quốc nhỏ, chè Shan, chè Ấn Độ Ở Việt Nam có giống chủ yếu sau: - Chè Trung Du: chiếm 62.72% - Chè lai: LDP1 - Chè Shan: chiếm 31.1% - Chè PH1 1.1.4 Các vùng chè Việt Nam Việt Nam nằm vùng gió mùa Đông Nam Á, khí hậu đất đai thích hợp với sinh trưởng chè Hầu hết tỉnh trồng chè với tổng diện tích đạt 100000 ha, vị trí quan trọng vùng chè tập trung • Vùng chè Tây Bắc Giống chè trồng chủ yếu là: Giống chè Shan giống chè Trung du, giống chè Shan phù hợp phát triển tốt cho chất lượng cao Hiện trồng thêm số giống chè LDP1, LDP2, TR777, Đại bạch trà… Vùng có đơn vị trồng chế biến chè lớn là: Công ty chè Mộc Châu công ty chè Tam Đường, sản phẩm chủ yếu chè đen (OTD CTC) chè xanh có chất lượng tương đối tốt • Vùng chè Việt Bắc – Hoàng Liên Sơn Đây vùng chè quan trọng Việt Nam, có hai trình độ sản xuất quảng canh thâm canh khác rõ rệt Đó tiểu vùng chè rừng dân tộc tiểu vùng chè đồi công nghiệp với trình độ thâm canh cao Sản lượng búp chè tươi chiếm 31.15% tổng sản lượng chè búp tươi nước Giống chè chủ yếu chè Shan Trung du, có số giống như: Bát Tiên, Đại Bạch trà, TR777, LDP1, … trồng khảo nghiệm • Vùng chè Trung du Bắc Bộ Vùng chè Trung du Bắc Bộ nằm ranh giới miền núi miền đồng Bắc Bộ Sản lượng chè búp tươi chiếm khoảng 26.22% tổng sản lượng chè búp tươi nước Giống chè chủ yếu chè Trung du số giống PH1, LDP1, … Hình 3.7 - Mức độ đáp ứng mong đợi – tinh chế polyphenol 3.2.4 Hoàn thiện quy trình trích ly – tinh chế polyphenol từ vụn chè xanh Như trình trích ly – tinh chế polyphenol chè xanh thực điều kiện tối ưu sau: chiết dịch chè 42 phút, pH 2,9, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 10/1 nhiệt độ 77oC; cô đặc dịch chè đến 15oBx, tẩy màu clorofooc với tỷ lệ clorofooc/dịch chè 1/1; chiết polyphenol etyl axetat với tỷ lệ 2,5/1 Cuối chế phẩm PP sấy chân không 60oC đến loại hoàn toàn dung môi Chế phẩm PP chứa 84,11% polyphenol (tương đương axit gallic) Lượng chế phẩm đạt 6,42% (theo nguyên liệu khô, tương đương flavonoid theo khối lượng) nghĩa 100 g chè xanh vụn nguyên liệu (quy khô) thu 6,42 g chế phẩm Như hiệu suất thu hồi polyphenol từ chè xanh vụn đạt 51% so với hàm lượng flavonoit tổng số chè xanh vụn 12,58% (nguyên liệu khô) 42 3.3 Đánh giá hàm lượng, độ tinh khiết chế phẩm PP Phân tích catechin máy sắc ký lỏng hiệu cao Agilent 1100 kết hợp với Detector điốt phổ rộng có hình ảnh sắc ký đồ hình 3.8 đường chuẩn chất catechin hình 3.9 0 10 - C 4 250 1 500 - G C - G A 750 - E C 1000 15 20 25 1250 2 1500 1750 - G C G 7 - E G C G 2 - E C G DAD1 B, Sig=280,8 Ref=560,100 (CATECHIN\65PP2000.D) mAU 30 35 Hình 3.8 - Sắc ký đồ phân tích catechin chế phẩm PP HPLC/DAD Area 40000 Phương trình đường chuẩn GA: y = 49,10 x - 2280,2 30000 r = 0,99222 20000 10000 0 500 Amount[ppm] 43 Area 17500 15000 12500 10000 7500 5000 2500 Phương trình đường chuẩn GC: y = 18,53 x - 188 r = 0,99976 500 Amount[ppm] Area Phương trình đường chuẩn C: 12000 y = 14,75 x – 1043,16 10000 r = 0,97974 8000 6000 4000 2000 500 Amount[ppm] Area 25000 Phương trình đường chuẩn EGCG: 20000 y = 29,62 x – 2108,58 15000 r = 0,98592 10000 5000 0 500 Amount[ppm] 44 Area Phương trình đường chuẩn EC: 10000 y = 12,32 x – 750,41 8000 r = 0,98690 6000 4000 2000 0 500 Amount[ppm] Area 25000 Phương trình đường chuẩn GCG: 20000 15000 y = 26,74 x – 718,22 10000 r = 0,99821 5000 500 Amount[ppm] Area 25000 20000 Phương trình đường chuẩn ECG: y = 30,38 x – 1791,39 15000 r = 0,98762 10000 5000 0 500 Amount[ppm] Hình 3.9 – Đồ thị đường chuẩn catechin 45 Phân tích cafein máy sắc ký khí Agilent 6890N kết nối detector khối phổ Agilent 5973i có hình ảnh phổ hình 3.10 đồ thị đường chuẩn cafein hình 3.11 Hình 3.10 – Phổ phân tích cafein chế phẩm PP GC/MS 46 2.50E+07 y = 99766x + 403001 R2 = 0.9999 Cường độ tín hiệu 2.00E+07 1.50E+07 1.00E+07 5.00E+06 0.00E+00 50 100 150 200 250 Nồng độ ( µ g/m l) Hình 3.11 – Đồ thị đường chuẩn cafein Bảng 3.8 bao gồm kết phân tích mẫu chế phẩm PP thành phần, hàm lượng catechin sắc ký lỏng hiệu cao HPLC/DAD, polyphenol tổng số theo phương pháp Folin – Denis hàm lượng cafein sắc ký khí khối phổ GC/MS Bảng 3.8- Kết phân tích thành phần chế phẩm PP STT Chỉ tiêu Đơn vị Hàm lượng GA µg/mg 6,686 GC µg/mg 3,243 C µg/mg 101,164 EGCG µg/mg 546,204 EC µg/mg 64,288 GCG µg/mg 21,298 ECG µg/mg 114,690 Tổng catechin µg/mg 857,573 PP tổng số(1) % 84,11 ± 0.401 Cafein µg/mg 81,028 (1) – GTTB ± Độ lệch chuẩn, n = 47 Dễ nhận thấy polyphenol tổng số, hàm lượng tổng catechin chế phẩm tương đối cao, đạt khoảng 85%, cấu tử EGCG chiếm 63.69% tổng lượng catechin Điều cho thấy chế phẩm đạt độ tinh khiết cao (trên 80%) có chứa chủ yếu hàm lượng chất có hoạt tính sinh học mạnh Bên cạnh đó, bảng kết cho thấy lượng cafein lại chế phẩm 8,1% (dưới 10%), phương pháp trích ly tinh chế đảm bảo loại bỏ phần lớn cafein từ mẫu nguyên liệu (Xem thêm phụ lục B) 3.4 Nghiên cứu đánh giá tác dụng sinh học chế phẩm PP 3.4.1 Phân tích khả kháng khuẩn Khả kháng vi sinh vật chế phẩm PP xác định theo phương pháp khuếch tán thạch kết thể bảng 3.9 hình 3.12 Bảng 3.9 - Đường kính vòng kháng khuẩn Chủng VSV Đường kính vòng kháng khuẩn (cm) Staphylococcus aureus 2.9 Escherichia coli 3.3 Salmonella typhi 2.8 Bacillus cereus 3.3 Kết đo đường kính vòng kháng khuẩn cho thấy chế phẩm PP có tác dụng kháng khuẩn rõ rệt chủng: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi Bacillus cereus 48 Hình 3.12 - Hình ảnh vòng kháng khuẩn Trong - PP2: chế phẩm PP chiết xuất từ chè xanh vụn (đối tượng nghiên cứu đề tài) 3.4.2 Phân tích hoạt tính chống oxy hóa thông qua khả quét gốc tự DPPH Chế phẩm chuẩn bị nồng độ 100, 200, 300 ppm nhằm xác định khả quét gốc tự DPPH, kết phân tích thể Bảng 3.10 49 Bảng 3.10 - Khả quét gốc tự DPPH chế phẩm Nồng độ chế phẩm (ppm) Khả quét DPPH (%)(1) 100 43,48a ± 0,37 200 56,86b ± 0,19 300 67,94c ± 0,52 (1) – Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, n = Giá trị trung bình cột khác có nghĩa chữ khác (p