Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn tới quá trình lên men kombucha từ trà shan tuyết hà giang (LV01192)

Cách tạo sản phẩm kombucha được nhiều người quen gọi là “cách nuôi nấm thủy sâm”, nhưng bản chất là quá trình các vi sinh vật truyển hóa đường trong dung dịch trà đường thành acid với mộ

HOÀNG ÁNH SÁNG

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN KOMBUCHA

TỪ TRÀ SHAN TUYẾT HÀ GIANG

CHUYÊN NGÀNH: SINH THÁI HỌC

MÃ SỐ: 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2014

LỜI CẢM ƠN ***

Trong quá trình học tập, nghiên cứu, hoàn thiện Luận văn, ngoài sự

nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của nhiều tập thể, cá nhân Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung - người đã tận tình hướng dẫn, cung cấp cho tôi nhiều kiến thức quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thiện đề tài

Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2, các thầy giáo, cô giáo Khoa Sinh Kỹ Thuật nông nghiệp, Phòng Sau đại học

đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài

Xin gửi lời cảm ơn sự giúp đỡ các anh chị trong phòng Vi sinh, các em sinh viên K37 đang làm đề tài tại phòng Vi sinh, Thư viện Trường ĐHSP

Hà Nội 2, bạn bè, người thân và đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện tốt nhất

để tôi hoàn thành đề tài này

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, 16 tháng 11 năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Hoàng Ánh Sáng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật Đây là kết quả của riêng tôi Tất cả các số liệu đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả bất kỳ của tác giả nào đã công bố Trong đề tài, tôi có

sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho luận văn của mình

Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Hoàng Ánh Sáng

TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

1 ADP: Adenozin diphotphat

2 ATP: Adenozin triphotphat

3 CFU: Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

4 FAD: Flavin adenine dinucleotide

5 GlcUA: Glucuronic acid

6 MT: Môi trường

7 NADP: Nicotiamide adenine

8 PABA: Para – amino benzoic acid

DANH MỤC HÌNH, BẢNG

* Danh mục hình

1.1 Kombucha bị nhiễm nấm mốc 6

1.2 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất trong trà kombucha 6

1.3 “Con nấm” (SCOBY) 7

1.4 Kombucha được lên men trong các bình chứa có kích thước và hình dạng khác nhau 8

1.5 Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men 12

1.6 Quá trình oxi hóa rượu thành acid acetic 13

1.7 Trà Shan tuyết Hà Giang 17

3.1 Sản phẩm kombucha sử dụng phân lập vi khuẩn 31

3.2 Ảnh mẫu vi khuẩn X4 nhuộm Gram 32

3.3 Chuyển hoá ethanol thành acid acetic của các mẫu vi khuẩn 32

3.4 Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter 35

3.5 Khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter X4 trên môi trường thạch đĩa 36

3.6 Mẫu vi khuẩn Acetobacter X4 trên môi trường thạch nghiêng 37

3.7 Hình thái của chủng vi khuẩn X4 và 4 chủng vi khuẩn X1, X2, X5, và X6 trên kính hiển vi điện tử có độ phóng đại 10.000 lần 37

3.8 Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter X4 42

3.9 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4 43

3.10 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của MgSO4.7H2O đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4 45

3.11 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của KH2PO4 đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4 46

3.12 Ảnh Kombucha lên men từ chủng Acetobacter X4 bổ sung hàm lượng

KH2PO4 1,0 và 1,5 (g/l) 46

3.13 Ảnh Kombucha lên men từ chủng Acetobacter X4 với thời gian lên

men 5, 7 và 9 ngày 49

3.14 Ảnh Kombucha lên men từ chủng Acetobacter X4 ở nhiệt độ 200C và 300C 52

3.15 Quy trình lên men Kombucha quy mô phòng thí nghiệm 54

* Danh mục bảng 1.1 Thành phần hóa học trà kombucha 15

2.1 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha 28

2.2 Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu 29

2.3 Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 29

3.1 Đặc điểm sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter 38

3.2 Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 5 chủng vi khuẩn Acetocbacter 39

3.3 Khả năng tạo độ trong, hương thơm và mùi vị đặc trưng của kombucha từ 5 chủng vi khuẩn Acetobacter 40

3.4 Quá trình sinh trưởng của chủng Acetobacter X4 42

3.5 Mẫu thử thay đổi tỉ lệ đường, trà trong 1000 ml nước 47

3.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4 49

3.7 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4 50

3.8 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4 51

3.9 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4 52

3.10 Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha bằng phương pháp cảm quan 57

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

LỜI CAM ĐOAN 3

TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT 4

DANH MỤC HÌNH, BẢNG 5

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 1

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

5 Những đóng góp mới của đề tài 2

6 Phương pháp nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về Kombucha 4

1.1.1 Sơ lược về kombucha 4

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo kombucha 7

1.1.3 Hệ vi sinh vật trong kombucha 8

1.1.4 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha 11

1.1.5 Thành phần hóa học và công dụng của kombucha 14

1.2 Một số đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang 16

1.2.1 Phương pháp sản xuất trà 17

1.2.2 Đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang 17

1.3 Tình hình nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam và trên thế giới 18

1.3.1 Trên thế giới 18

1.3.2 Ở Việt Nam 19

CHƯƠNG 2 21

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 21

2.1.1 Đối tượng 21

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 21

2.1.3 Môi trường 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp vi sinh 22

2.2.2 Phương pháp hóa sinh 25

2.2.3 Phương pháp cảm quan 27

2.2.4 Phương pháp toán học 29

CHƯƠNG 3 31

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang 31

3.1.1 Tạo sản phẩm kombucha 31

3.1.2 Phân lập vi khuẩn lên men kombucha 31

3.1.3 Nghiên cứu một số đặc tính của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 34 3.1.4 Phân loại các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn 37

3.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha 39

3.2.1 Xác định hàm lượng acid tổng số được tạo ra của mỗi chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn 39

3.2.2 Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha 40

3.2.3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter X4 41

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha 43

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình lên men kombucha 43

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha 48

3.4 Thực hiện lên men kombucha 53

3.4.1 Sơ đồ lên men kombucha 53

3.4.2 Thuyết minh quy trình 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

1 Kết luận 58

2 Kiến nghị 58

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Kombucha là thức uống lên men có lợi cho sức khỏe, đã được nhiều người biết đến với các tên gọi khác nhau “trà nấm”, “thủy sâm”, “thủy hoài sâm”… nó có vị ngọt và hương thơm của rượu táo lên men

Trên thế giới, kombucha đã được sản xuất và tiêu thụ dưới nhiều tên gọi khác nhau như: Machurian, Mo-Gu, Kocha kinoko,… Ở Việt Nam, kombucha mới chỉ được lên men tại hộ gia đình từ các nguồn nguyên liệu như trà xanh, trà lipton… Cách tạo sản phẩm kombucha được nhiều người quen gọi là “cách nuôi nấm thủy sâm”, nhưng bản chất là quá trình các vi sinh vật truyển hóa đường (trong dung dịch trà đường) thành acid với một lượng nhỏ hàng trăm các sản phẩm phụ khác nhau Chất lượng thành phẩm kombucha phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nhiệt độ môi trường, thời gian lên men, độ pH của dung dịch, loại trà, thành phần các vi sinh vật,… Trong đó, vi khuẩn đóng vai trò rất quan trọng để tạo ra sản phẩm kombucha thơm, ngon, đặc trưng

Trong những năm gần đây, đã có một số công trình nghiên cứu

về nấm men, vi khuẩn, tác dụng của kombucha…Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào đánh giá đầy đủ về sự về sự ảnh hưởng của vi khuẩn, môi trường lên men, loại vi khuẩn lên men kombucha Chính vì vậy tôi quyết định lựa chọn đề tài "Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn tới quá trình

lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang"

2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn, đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn tới quá trình lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha

3.2 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên mem kombucha từ trà Shan tuyết

Hà Giang

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của của một số yếu tố tới động thái phát triển

của các chủng vi khuẩn tuyển chọn

3.4 Thực hiện quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Chủng vi khuẩn có khả năng lên men Kombucha từ trà Shan tuyết

Hà Giang

5 Những đóng góp mới của đề tài

Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về đối tượng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang Đặc biệt, đã phân lập, được 5 chủng vi khuẩn có khả năng tạo sản phẩm kombucha; xác định được động thái sinh trưởng, điều kiện môi trường phù hợp cho quá trình lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang

6 Phương pháp nghiên cứu

6.1 Phương pháp vi sinh

Phương pháp phân lập vi khuẩn và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram; phương pháp đếm số lượng tế bào vi sinh vật; phương pháp bảo quản chủng giống

6.2 Phương pháp hóa sinh

Phát hiện hoạt tính catalase; khả năng oxy hoá acid acetic; chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone; sinh trưởng trên môi trường Hoyer; phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N

có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị; phát hiện khả năng tổng hợp cellulose

6.3 Phương pháp cảm quan

Đánh giá sản phẩm theo TCVN 3217 – 79

6.4 Phương pháp toán học

NỘI DUNG

1 CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về Kombucha

1.1.1 Sơ lược về kombucha

Trong sách thuốc cổ Trung Quốc, vào thời Tần Thủy Hoàng, năm 221 trước Công nguyên, người ta đã ghi chép về một loại “Thiên Trà”, trà này được xem là một phương thuốc trường sinh “Trà” được đưa vào Nhật do một y sĩ người Triều Tiên tên là Kombu (và được gọi tên là “Trà Kombu”) Sau đó được lan truyền sang Ấn Độ, Nga và các nước Đông Âu [54] Tuy nhiên, theo GW Frank trong tập sách “Kombu” (1991) thì kombu là tiếng Nhật để gọi một loại rong biển và “cha” là trà và kombucha phát xuất từ một loại nuớc uống chế tạo từ rong biển kombucha đã có một thời kỳ nổi tiếng tại Châu Âu, nhiều bài báo đã được viết về kombucha, đăng tải trên các tạp chí quốc tế như "Taking the Fungal-Tea Plunge, Newsweek, January 9,1995’’…

Ngày nay, trà lên men kombucha là loại đồ uống thông dụng, phổ biến

ở các nước Đông Âu và các nước khác, nó được biết đến như một loại thực phẩm có lợi cho sức khỏe, được sản xuất và tiêu thụ dưới nhiều tên gọi khác nhau như: Machurian, Mo-Gu, Champignon de longue vie, Kargasok Tea, Kwassan, Kocha kinoko, Fungojapon… Ở nước ta, loại trà lên men này

đã được sản xuất nhỏ lẻ trong một số hộ gia đình, nhưng chưa có nghiên cứu nào sản xuất trên quy mô công nghiệp Sản phẩm trà lên men kombucha được

sử dụng ngay sau khi lên men, hoặc bảo quản lạnh trước khi dùng

Đến thời điểm hiện tại, hiểu biết hóa sinh về các thành phần chất, chuyển hóa kombucha vẫn còn nhiều bí ẩn, chưa được làm sáng tỏ [39]

Các nghiên cứu về vi sinh vật cộng sinh trong kombucha cho thấy: kombucha thực sự là một tập hợp cộng sinh của nấm men và vi khuẩn acid acetic [27], [33], [44] Các vi khuẩn acetic chính được tìm thấy trong các loại nấm trà:

Acetobacter xylinum [15], Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus [38], Gluconobacter oxydans [24], [35] Nhiều hợp chất quan trọng đối với việc

bảo vệ sức khỏe con người, được sản xuất trong quá trình lên men của kombucha cộng sinh: một loạt các axit hữu cơ như glucuronic, gluconic, lactic, acetic, axit succinic, butyric, axit malic và usnic; vitamin, đặc biệt là nhóm B và vitamin C, axit amin tự do và các enzyme hoạt động khác nhau GlcUA được coi là một trong những hợp chất quan trọng được tìm thấy trong kombucha giải khát do tác động giải độc của nó và ảnh hưởng tới sức khỏe [29], [37], nó ngăn ngừa bệnh tim mạch, các bệnh thoái hóa thần kinh mãn tính thoái hóa và ung thư [22], [44]

Quá trình lên men được bắt đầu bằng con nấm giống hay chính là sự lên men cộng sinh của vi khuẩn và nấm men, “con nấm” này được các nhà khoa học phân loại như là biofilm (màng sinh học – là một tổ hợp vi sinh vật trong đó các tế bào kết dính lại với nhau thành một cấu trúc trên bề mặt và sinh ra các ngoại cao phân tử EPS – Extracellular Polymeric substance) Con nấm có hình dạng giống bình chứa nó, bề dày thì phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy và độ pH của môi trường

Nồng độ acid và rượu trong kombucha giúp chống nhiễm các nấm mốc trong không khí và các bào tử vi khuẩn Kết quả là kombucha có thể tương đối dễ dàng lên men trong điều kiện thường Các vi khuẩn và nấm men trong kombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh [26]

Trong quá trình làm cẩn thận để tránh cho trà không bị nhiễm các loại nấm mốc gây độc cho cơ thể Các yếu tố để đảm bảo an toàn cho việc lên men: môi trường sạch sẽ, nhiệt độ thích hợp, pH thấp

Nếu quá trình lên men bị nhiễm nấm mốc, có thể nhận thấy bằng mắt thường như trên bề mặt “con nấm” có xuất hiện màu xanh lá cây, xanh dương hoặc màu đen, mốc trắng hình cầu thì đó có thể là các loài nấm

mốc Aspergillus parasiticus, Aspergillus flavus, Penicillium citricum…

Các loại nấm mốc trên sẽ sản sinh ra mycotocin, citrinin, aflatoxin… đều là các độc tố và gây mùi khó chịu

Hình 1.1 Kombucha bị nhiễm nấm mốc

Trà kombucha là một loại thức uống bổ dưỡng Quá trình lên men sản sinh ra nhiều chất có lợi cho sức khỏe như vitamin, khoáng chất, acid glucuronic, acid lactic, acid acetic và vitamin B (B1, B2, B3, B5, B6, B15…), các hợp chất hữu cơ khác như PABA, acetamidophenol, cafein… [24], [28]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất trong trà kombucha

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo kombucha

Hệ vi sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng

Acetobacter như: Acetobacter xylinum, Acetobacter ketogenum… và nấm men: Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe… Ngoài ra còn có thể có các chủng : Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium gluconicum…[33]

Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha Acetobacter xylinum có

khả năng tạo màng hemicellulose khá dày và chắc (tạo màu xanh với iot và

H2SO4) nên kombucha trông giống một cái bánh dẹp, thường được gọi là

“con nấm” hay SCOBY

Hình 1.3 “Con nấm” (SCOBY)

Kombucha sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đường Trong quá trình lên men, kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên bề mặt dịch trà

và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một lớp màng thứ hai (thường gọi là

“nấm con”), tách biệt với lớp màng ban đầu (“nấm mẹ”)

Hình dạng và kích thước của “con nấm” phụ thuộc vào hình dạng tiết diện của bình chứa

1.1.3 Hệ vi sinh vật trong kombucha

1.1.3.1 Vi khuẩn acetic

Vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae (hiếu khí bắt buộc)

Chúng phát triển tốt trên bề mặt môi trường, phân bố rộng rãi, đa dạng, phong phú trong tự nhiên: trong không khí, đất, gỗ, cây ăn trái, đặc biệt là các loại thực phẩm, hoa trái, nước trái cây và các sản phẩm lên men tự nhiên chứa ethanol như rượu, bia, giấm tự nhiên… Bên cạnh những mặt có lợi trong lên men như giấm, vi khuẩn acetic được xem là một trong những nguyên nhân quan trọng gây hư hỏng thực phẩm tươi và thực phẩm lên men giàu cồn

Họ vi khuẩn Acetobacteraceae (Gillis và de ley, 1980) bao gồm:

Chi Acetobacter (Beijerinck, 1898);

Chi Gluconobacter (Asai, 1935);

Chi Acidomonas (Urakami et al., 1989);

Chi Gluconacetobacter (Yamada et al., 1998);

Chi Asaia (Yamada et ai., 2000);

Chi Kozakia (Lisdiyanti et al., 2002);

Chi Swacharibacter (Jojima et al., 2004);

Chi Neoasaia (Yukphan et al.,2006);

Chi Granulibacter ( Greenberg et al., 2006)

* Các phương pháp truyền thống trong phân loại và định danh

họ Acetobacteriaceae:

Việc phân loại và định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống chủ yếu dựa vào các đặc điểm kiểu hình bao gồm các đặc điểm hình thái, sinh lý, dinh dưỡng và đặc điểm sinh thái

b Đặc điểm sinh thái

Đặc điểm phân bố của vi khuẩn acetic thường gắn liền với các nguồn dinh dưỡng chứa đường hay alcohol như các loại hoa, quả, bia, rượu và các nơi sản xuất giấm Tuy nhiên, trong một số trường hợp, đặc điểm sinh thái được đánh giá là đặc điểm điển hình của giống hay loài Cụ thể như

Acidomonas chỉ có thể phân lập được trong bùn hoạt tính có methanol; Granulibacter được tìm thấy trong cơ thể người bị u hạch; một số loài có khả năng cố định đạm thuộc hai giống Acetobacter và Gluconacetobacter

sống cộng sinh trong rễ cây họ đậu

c Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid được phân biệt bởi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa sau: Oxy hóa acetate tạo CO2

và H2O; phát triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau; phát triển sinh khối trong các môi trường chứa D- glucose 30%; acetic acid

0,35%; KNO3 1%; methanol; glutamate và malnitol; sinh acetic acid

từ ethanol; tạo sắc tố hòa tan trong nước; đồng hóa ammonia trong môi trường chứa D- glucose, D-malnitol hay ethanol; tạo dyhidroxyaceton

từ glcerol; phát triển trong môi trường không có nicotinic acid; phát triển sinh khối và tạo acid trong các môi trường có nguồn carbon duy nhất là: D-glucose, D-mamnose, D-galactose, D-fructose, L-sorbose, D-xylose, arabinose, L-arabinose, D-malnitol, D-sorbitol, glycerol, maltose, lactose, melibiose, sucrose, raffinose và ethanol [31], [49]

1.1.3.2 Nấm men

Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ…, thường có kích thước rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình: chiều dài: 9 – 10m, chiều rộng: 2 – 7m Hình dạng và kích thước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau Nấm men là sinh vật đơn bào nhân chuẩn, tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản như sau: thành tế bào, màng sinh chất, chất nguyên sinh, nhân tế bào và những thành phần khác: không bào, ty thể, riboxom,…[4]

Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: Sinh sản bằng cách nảy chồi, phân đôi, sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử

Phân loại: nấm men chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces)

và nấm men giả (Fungi imperfecti) Lớp nấm men thật phần lớn dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces Lớp nấm men giả bao gồm giống Crytococus, Mycoderma, Eandida, Geotrichum, Rhodotorula

1.1.3.3 Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium Đây là những

trực khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột

Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin

và khoáng chất Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 500C Tuy nhiên, mỗi loài

có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 800C vi khuẩn

lactic bị tiêu diệt hoàn toàn

1.1.4 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha

Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá trình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau:

* Lên men ethanol

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2 Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối và thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2 Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa theo chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic Tiếp theo acid pyruvic

sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chất này có thể chuyển hoá thành glyxerol Trong môi trường pH acid, glycerol chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ Ngược lại, trong môi trường pH kiềm lượng glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men

Hình 1.5 Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men

Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:

C6H12O6 + 2ADP +2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP

Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong

tế bào chất của nấm men Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men trong điều kiện kỵ khí Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men thải vào môi trường lên men Ngoài ra, tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác,

những hợp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este Trong quá trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990) Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trình lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic

* Lên men acetic:

Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dưới tác dụng của vi khuẩn [31]

* Lên men lactic:

Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng Các phân tử ATP được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi hóa lý khác Bản chất là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật

Phương trình phản ứng:

C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + 94kcal

Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men đồng hình), acid acetic, ethanol, CO2 (lên men dị hình) Trong dịch lên men còn xuất hiện cả trăm hợp chất hóa học mới khác Một số hợp chất trong nhóm trên rất dễ bay hơi Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic

Phương trình tổng quát:

C 6 H 12 O 6  CH 3 CHOHCOOH + CH 3 COOH + C 2 H 5 OH + COOH(CH 2 ) 2 COOH + CO 2

Glucose acid lactic(40%) acid acetic ethanol acid succinic

Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, nói chung thì acid lactic thường chiếm 40% lượng đường đã được phân hủy, acid succinic 20%, ethanol chiếm 10%, acid axetic 10% và các loại khí gần 20%

1.1.5 Thành phần hóa học và công dụng của kombucha

Kombucha có thể sử dụng một số loại trà để lên men, nhưng không

sử dụng được trà thảo mộc vì kombucha dễ bị hỏng khi lên men trà có nhiều tinh dầu Loại trà như Earl Grey có chứa dầu thơm Bergamot, có thể làm cho

kombucha bị chết hoặc bị ảnh hưởng xấu Sử dụng các loại trà khác nhau

sẽ cho ra những loại thức uống với những hương vị khác nhau

1.1.5.1 Thành phần hóa học của kombucha

Theo nghiên cứu của tổ chức The American FDA and CDC [46], [47],

tỷ lệ các chất hóa học có trong trà kombucha như sau:

1.1.5.2 Công dụng của kombucha

Kombucha đã được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm của Mỹ (FDA) chứng nhận là an toàn đối với con người [47] Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới thì trà kombucha có nhiều lợi ích đối với con người [22], [32], thường được tìm mua ở các cửa hàng thực phẩm chức năng Tác dụng của trà kombucha dựa trên các thành phần sau: Acid Lactic: cần thiết cho hệ thống tiêu hóa, giúp cho việc lưu thông máu, cân bằng độ acid và kiềm trong cơ thể Trong kombucha, acid này tồn tại ở dạng có lợi nhất (lactic – L); Acid Acetic:

là 1 chất bảo quản chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn có hại; Acid Usnic: là

1 loại chất kháng sinh tự nhiên, giúp chống lại nhiều loại virus Acid Oxalic là một chất bảo quản hiệu quả và cung cấp năng lượng; Acid malic giúp giải độc gan; Acid butyric tạo ra bởi nấm men, bảo vệ màng tế bào …

1.1.5.3 Một số lưu ý khi sử dụng

Do trà chứa nhiều acid lactic, uống quá nhiều, trong một thời gian dài không có lợi cho sức khỏe, có thể dẫn đến đau khớp, chóng mặt, viêm xoang; trẻ em có thể dùng nhưng liều lượng thay đổi theo tuổi, cân nặng và cần phải được pha loãng với nhiều nước, không nên cho trẻ dưới 2 tuổi uống; phụ nữ

có thai không nên dùng vì có đến 1% lượng cồn trong nước trà, không nên uống trong thời gian cho con bú vì gây đau bụng cho trẻ sơ sinh; người tiểu đường không nên uống nhiều vì hàm lường sót kombucha vẫn còn khá cao (5-8 mg/l); Trà kombucha gây loãng máu, cần giảm liều và chú ý ngưng một tuần trước khi phẫu thuật; phụ nữ bị rong kinh cũng cần thận trọng và nên ngưng sử dụng trước kinh kỳ tối thiểu một tuần Men trà kombucha có thể bị hỏng và mất hết tác dụng nếu ủ không đúng quy cách [34], [36], [50]

1.2 Một số đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang

Trà Shan tuyết là từ dùng để gọi các loại trà được sản xuất từ búp cây chè cổ thụ, mọc trên các vùng núi cao (trên 1.000m so với mặt nước biển) Chúng thuộc giống chè cổ thụ 200-300 năm tuổi, búp chè phủ một lớp lông tơ mịn như nhung, trắng như tuyết, bởi thế người ta gọi là chè Shan tuyết (có người cho rằng chữ “Shan” là chữ gọi chệch của “Sơn”) Ở nước ta có nhiều vùng chè Shan tuyết như: Thái Nguyên, Hà Giang, Tuyên Quang, trong đó,

Hà Giang là vùng sản xuất trà Shan tuyết nổi tiếng và lâu đời nhất nước ta Ngay từ những năm đầu thế kỷ 20, người Pháp đã tiến hành điều tra cây chè

ở Hà Giang và đặc biệt chú ý những cây chè cổ thụ vùng cao

Về giống chè Shan Hà Giang có thể chia thành 2 dạng chính đó là chè shan lá nhỏ, tiêu biểu chè Lũng Phìn (Đồng Văn), Phìn Hồ (Hoàng Su Phì) với đặc điểm dạng tán hình mâm xôi hoặc dạng nến Dạng chè shan thứ 2 với tiêu biểu vùng chè cổ Bó Đướt, Thượng Sơ (Vị Xuyên) Loại chè này đặc biệt nhiều về mức độ lông tuyết ở cả búp lá 1 và một phần lá 2 Cây chè càng già

càng quý, tuyết trắng cuả trà càng nhiều thì trà chất lượng càng cao, cây chè mọc ở độ cao càng cao so với mặt nước biển thì càng nhiều tuyết trắng Loại trà chúng tôi sử dụng cho đề tài là trà Shan tuyết Phìn Hồ

1.2.1 Phương pháp sản xuất trà

Trà Shan tuyết được chế biến từ búp chè tươi, qua các quá trình sau: Chè búp sau khi thu hái tiến hành diệt men triệt bằng thùng quay (khoảng 8-10 phút, nhiệt độ trong khối nguyên liệu 800 C, nhiệt độ của chảo sao 3500 C.) đến khi chè chín đều thì đổ ra rải mỏng cho nguội Sau đó tiến hành vò chè, vò làm 2 công đoạn: Cho chè đã diệt men vào túi vải rồi vò bằng tay trong thời gian 2-5 phút; sau đó cho chè vào cối vò để vò, thời gian vò

13 - 15 phút Sau khi vò, cho chè ra nia, rũ tơi và sao lăn đến khô ta được sản phẩm trà Shan tuyết

1.2.2 Đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang

- Ngọn chè Shan Tuyết tươi phủ một lớp phấn trắng như tuyết

- Thành phẩm trà xoăn chặt, màu xanh đen, cánh trà có tuyết

- Nước trà sau khi pha có màu vàng sậm có hương thơm, uống lúc đầu chát gắt, có vị đắng, sau có vị ngọt kéo dài, pha nhiều lần vẫn đậm

Hình 1.7 Trà Shan tuyết Hà Giang

Do quá trình diệt men làm đình chỉ hoạt động của enzyme, nên các thành phần trong búp chè ít bị biến đổi, hàm lượng polyphenol trích ly trong

nước là 30 – 40%, các vitamin và khoáng chất vẫn được giữ lại (đặc biệt là vitamin C) Vì vậy, giá trị dinh dưỡng của trà thành phẩm tương đối cao

1.3 Tình hình nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam và trên thế giới

1.3.1 Trên thế giới

Từ năm 1852, trà kombucha đã được chú trọng nghiên cứu, chủ yếu là

ở Châu Âu, đã có một số ít công trình nghiên cứu về trà kombucha, phần lớn tập trung nghiên cứu liên quan đến việc xác định thành phần hệ vi sinh vật, thành phần hóa học và phương pháp lên men

Kombucha – sự cộng sinh của vi khuẩn và nấm men đã được nuôi để có được sản phẩm đồ uống lành mạnh [45], nhiều bài báo đã được viết về kombucha, được đăng tải trên các tạp chí quốc tế như “Taking the Fungal-Tea plunge, Newsweek, January 9, 1995” Cavusoglu K., Gluer P (2010) đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên nhiễm sắc thể gây ra bởi bức

xạ gamma trong tế bào bạch huyết ngoại vi của con người trong ống nghiệm

[19] Dutta D., Gachhui R (2006) đã phân lập vi khuẩn Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov cố định đạm từ trà kombucha [20] Dutta D., Gachhui R

(2007) đã phân lập từ trà kombucha vi khuẩn cố định đạm và cellulose là

Gluconacetobacter kombucha sp.nov [21] J Reiss, (1994) đã tìm hiểu ảnh

hưởng của các loại đường khác nhau lên quá trình trao đổi chất của nấm trà [27] Jayabalan R., Malini K., Sathishkumar M., Swaminathan K.,Yun S.-E (2010) tìm hiểu đặc điểm sinh hóa của nấm trà [28] K.H Steinkraus, K.B Shapiro, J.H Hotchkiss, R.P Mortlock,(1996) viết về hoạt động kháng sinh của trà nấm kombucha [34] Nguyen Vu Tuan; Flanagan, Bernadine; Gidley, Michael J.; Dykes, Gary A (2008) tìm hiểu đặc tính của màng BC bởi chủng

Gluconacetobacter xylinus phân lập từ kombucha [40] Petrushevska-Tozi L.,

Bauer-petrovska B (2000) đã xác định được hàm lượng vitamin hòa tan và khoáng trong nước uống kombucha [42] R.A Ledford C.J Greenwalt, and

K.H Steinkraus đã xác định và mô tả đặc điểm của các hoạt động chống vi khuẩn của kombucha trà lên men [43] Velicanski, Aleksandra; Cvetkovic, Dragoljub; Markov, Sinisa; Tumbas, Vesna; Savatovic, Sladjana (2007) viết

về hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha [48]

Z Kovacevic, G.Davidovic (2014) viết về viêm gan vàtác dụng gây độc của trà kombucha [55]

1.3.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, những công trình nghiên cứu về kombucha còn rất ít và chưa đầy đủ, hoàn chỉnh về khu hệ nấm men, vi khuẩn lên men kombucha Tác dụng chữa bệnh và độ độc hại của loại trà này cần phải được nghiên cứu, kiểm tra và giám định chắc chắn

Hà Văn Hùng, Phó Viện trưởng Viện Y dược học dân tộc Thành phố

Hồ Chí Minh cũng cho rằng cho đến nay Viện cũng chưa có công trình nào nghiên cứu về thủy sâm nên không biết rõ thành phần và công dụng của nó [40] Lê Kim Phụng, nguyên giảng viên Trường Đại học Y dược Thành phố

Hồ Chí Minh, người đã có một số bài viết về thủy sâm, cho biết: "Hiện nay ở nước ta đang xuất hiện một loại thuốc bổ ở dạng lỏng như trà mà mọi người gọi là trà "thủy sâm", thực ra đây chính là một loại thức uống có từ rất lâu được gọi tên là "The Remedy for Immortality", nghĩa là "Phương thuốc Trường sinh" Thủy sâm thực sự chỉ là một loại cái giấm (nấm men) phát triển dưới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng Loại giấm này sinh sôi nhanh trong môi trường nước chè (trà) pha đường Thành phần trà kombucha

có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ

Lâm Thị Hồng Liên (2013), Đại sư phạm Hà Nội 2 đã thực hiện đề tài

“Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết

Hà Giang” đã tuyển chọn được 2 chủng nấm men Saccharomyces M1

và Saccharomyces M2 phù hợp cho quá trình lên men kombucha, khảo sát

được ảnh hưởng của hàm lượng men giống, pH ban đầu, nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của hai chủng nấm men M1, M2

Nữ Liên Hương thuộc khoa Khoa học Tự nhiên – Đại học Cần Thơ đã

có bản báo cáo khoa học với tên đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chế biến tới một số tính chất và hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha”,

tháng 3 năm 2013 Nội dung của bản báo cáo khoa học: giới thiệu trà giấm kombucha, định hướng nghiên cứu thực nghiệm, tóm tắt các kết quả nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học của trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt kết quả khảo sát hàm lượng của các hợp chất hữu cơ có hoạt tính trong trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt về một số hoạt tính sinh học của trà giấm Kombucha: tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, độc tính trên tế bào ung thư, theo thời gian lưu mẫu, trên từng loại trà giấm Như vậy, có thể thấy các nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam còn rất ít, các nghiên cứu về chủng vi khuẩn, ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình sinh trưởng của vi khuẩn trong lên mem kombucha hầu như không có

2 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

Nguồn cacbon: glucose (C6H12O6 ), acid acetic ;

Nguồn nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4 ;

Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4 ;

Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol, …;

H2SO4 , CaCO3 , thạch agar…

2.1.2.2 Thiết bị

- Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức);

- Nồi hấp Tommy (nhật);

- Box vô trùng (Haraeus);

- Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl – 10ml;

- Máy đo pH (MP 200R - Thuỵ Sĩ);

- Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ);

- Máy cất nước 2 lần (Hamilton – Anh);

- Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức);

- Buồng đếm Petroff – Housser

- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác

Pepton : 4g Nước máy : 1000ml

Acid acetic: 2% ( bổ sung sau khi khử trùng )

Rượu etylic : 2% ( bổ sung sau khi khử trùng )

* Môi trường nhân giống cơ bản (MT2)

Glucose : 20g MgSO4.7H2O : 2g

(NH4)2SO4: 3g KH2PO4 : 2g

Pepton : 4g Nước máy : 1000ml

Acid acetic: 2% ( bổ sung sau khi khử trùng )

Rượu etylic : 2% ( bổ sung sau khi khử trùng )

* Môi trường lên men kombucha (MT3)

Saccharose : 100g Trà Shan Tuyết: 15g

Nước máy : 1000ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn và quan sát hình thái tế bào trên

tiêu bản nhuộm Gram

a Phân lập vi khuẩn theo phương pháp Vinogradski

Để có được chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành phân lập từ nguồn nguyên liệu là kombucha Trước hết cần thực hiện quá trình lên men kombucha

từ trà Shan tuyết Hà Giang thu được mẫu màng lên men với giống tự nhiên

Cách làm: lấy dịch lên men kombucha lắc đều bằng máy vôntex trong 10 phút thu được huyền phù vi sinh vật Pha loãng dịch huyền phù ở các

nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-8 Dùng pipet hút 50μl mẫu ở các độ pha loãng 10-3 đến 10-8 nhỏ lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp petri, dùng que trang trang đều Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong

2 - 3 ngày Dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trưng ra khỏi môi trường phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 40C [7], [8], [10]

b Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram

Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi khuẩn dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protein đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt

Để tiến hành phương pháp nhuộm Gram cần lấy mẫu từ các chủng

đã qua sơ tuyển làm tiêu bản Khi đó tùy vào màu của tiêu bản thu được giúp ta phân biệt được vi khuẩn Gr- hay Gr+ Nếu sau khi nhuộm kép tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr-, bắt màu tím là vi khuẩn Gr+ Vi khuẩn

Gr- không có khả năng giữ màu này nên dễ bị rửa trôi bởi cồn Chỉ khi nhỏ Fucshin vi khuẩn Gr- mới bắt màu hồng của Fucshin [5], [8], [10], [11]

Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đại 1000 lần)

c Quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi điện tử

Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi ở 300C sau 3 ngày, trên bề mặt môi trường khuẩn lạc Nạo nhẹ khuẩn lạc làm tiêu bản và soi trên kính hiển vi điện tử quét (SEM-S4800)

2.2.1.2 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương

pháp đếm

a Phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch đĩa

Số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri được đếm để xác định

số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức

1 0 0 0 1

1 0 0 1 0 n

Trong đó: + N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu

+ A- Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri

+ 10 -n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy [6], [8], [11]

b Phương pháp đếm số lượng tế bào bằng phòng đếm

Đây là phương pháp đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật có trong mẫu phân tích Pha loãng dịch huyền phú VSV đến 10-n, nhỏ một giọt dịch huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa khung đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ khung đếm cho dịch chiếm đầy khoang Đếm số lượng tế bào theo các ô theo đường chéo hoặc theo các góc ở trung tâm khung đếm Thường đếm 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm của khung đếm để tính số lượng tế bào trung bình của ô lớn Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1ml lúc đầu:

N=A x 25 : V : n Trong đó: + N – số lượng tế bào trong 1ml dịch huyền phù lúc đầu

+ A – số lượng tế bào trung bình trong 1 ô lớn + V – thể tích của 1 ô lớn

+ n – độ pha loãng của mẫu ( 10-n) + 25 là số ô lớn của toàn khung đếm [5]

2.2.1.3 Bảo quản chủng giống

a Bảo quản trên thạch nghiêng

Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 300C Sau đó giữ trong

tủ lạnh 40C dùng cho nghiên cứu tiếp theo Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [10], [12]

b Bảo quản trong dung dịch glycerin 15%

Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng ở 300C sau 48 giờ đem li tâm dịch nuôi cấy trong 20 phút ở 3000 vòng/ phút, tách lấy phần sinh khối Hoà đều sinh khối trong 1ml dung dịch glycerin 15% vô trùng giữ ở -800C trong các ống eppendof vô trùng Bảo quản theo phương pháp này cho phép giữ giống trong vòng 1 đến 3 năm [9]

2.2.1.4 Phương pháp hoạt hóa giống

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 20 phút Sau

đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [12], [13]

2.2.2 Phương pháp hóa sinh

2.2.2.1 Phát hiện hoạt tính catalase

Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +) Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase) [2], [5]

2.2.2.2 Phát hiện khả năng oxy hoá rượu etylic thành acid acetic

Nuôi cấy chủng vi khuẩn trên môi trường có thành phần (g/l):

Cao nấm men: 10g Rượu êtylic: 10%-15% (vol/vol) Nước máy : 1000ml pH: 6,8-7.0

Xanh Bromophenol (BPB) 0,04%: 20ml

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5ml), khử trùng ở 1210C trong 20 phút, để nguội khoảng 300C cấy vi khuẩn nghiên cứu mới hoạt hoá,

nuôi 7 ngày trong điều kiện thích hợp Quan sát thấy môi trường chuyển sang màu vàng là dương tính, không đổi màu là âm tính

Pha dung dịch BPB 0,04%: cân 0,1g BPB nghiền nhỏ trong cốc sứ, sau đó bổ sung 14,9 ml NaOH 0,001N hoà tan cho đều Đổ tất cả vào bình định mức thêm nước cho đến khi thể tích đạt 250ml [2]

2.2.2.3 Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic

Sử dụng môi trường sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của

vi khuẩn tuyển chọn

Thành phần (g/l): Cao nấm men : 10g Canxi acetat: 10g

Thạch : 20g Nước máy: 1000ml

pH : 7,0-7,2 Quan sát hiện tượng nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi

là phản ứng dương tính, ngược lại là âm tính [2], [6], [9]

2.2.2.4 Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone

Để phát hiện khả năng hình thành dihydroxyacetone từ glycerol Chúng tôi tiến hành trên môi trường bao gồm thành phần sau:

Glycerol: 4% (g/l)

Cao nấm men: 0,3 % (g/l)

Cao ngô: 3% (g/l)

CaCO3 : 0,3% (g/l) (NH4)2SO4: 0,1% (g/l)

H2O: 1000ml pH = 5,3 Hấp thanh trùng 1210C trong 10 phút Để môi trường nguội cấy giống

vi khuẩn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 300C trong vòng 48h Nhỏ dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone (có sự xuất hiện kết tủa Cu2O màu đỏ gạch)

2.2.2.5 Sinh trưởng trên môi trường Hoyer

Hấp thanh trùng 1210C trong 15 phút Để môi trường nguội bổ sung giống nghiên cứu nuôi ở nhiệt độ khoảng 300C trong 0, 12, 24, 48 giờ sau đó đếm số lượng tế bào trên buồng đếm

2.2.2.6 Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose

Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28 - 300C trong vòng 3 - 4 ngày, quan sát sự hình thành màng Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60%

nó chuyển hoá thành màu xanh lam

2.2.2.7 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với

NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị

Cho vào cốc thủy tinh (loại 100 ml hoặc 200 ml) dịch lên men thêm vào đó 1 – 2 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N Chú ý chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt Sau đó tính số gam acid tổng số trong 100 ml dung dịch lên men theo công thức:

= 100

10 ( / ) Trong đó: X : Số gam acid tổng số trong 100 ml dung dịch lên men

V : Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 10 ml dung dịch lên men

K : Lượng acid tổng số tương ứng với 1 ml NaOH 0,1N (K = 0,006)

10 : Số ml dịch lên men đem chuẩn độ [6], [9]

2.2.3 Phương pháp cảm quan

Phân tích cảm quan thực phẩm là kỹ thuật sử dụng cơ quan cảm giác của con người để tìm hiểu mô tả và định lượng các tính chất cảm quan vốn có của thực phẩm như: màu sắc, mùi vị Cảm quan của kombucha được đánh giá trên một số chỉ tiêu theo TCVN 3215 – 79 [14]:Số điểm chưa có trọng lượng

là số điểm cho tương ứng với từng bậc đánh giá đối với mỗi chỉ tiêu chất lượng và được quy định trong bảng 2.1, hệ số quan trọng của từng

chỉ tiêu được quy định trong bảng 2.2, đánh giá mức chất lượng sản phẩm

5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ,

mầu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm

4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ,

mầu đặc trưng cho sản phẩm

3 Chất lỏng trong, có tương đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu

hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm

2

Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô trầm trọng, màu khác nhiều so với màu đặc trưng của sản phẩm

1 Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ

trầm trọng, thô, màu không đặc trưng cho sản phẩm

0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng

Mùi

5 Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm

4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trưng cho sản phẩm

nhưng hơi khó nhận thấy

3 Hơi nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trưng cho sản phẩm

2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm

1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho sản phẩm

0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng