6. Phương pháp nghiên cứu
3.1.3. Nghiên cứu một số đặc tính của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
3.1.3.1. Đặc tính sinh hóa
a. Kiểm tra hoạt tính catalase (phương pháp 2.2.2.1)
Thu được kết quả là cả 5 mẫu vi khuẩn đều có phản ứng catalase dương tính. Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tượng sủi bọt khí (hình 3.3). Chứng tỏ oxy được giải phóng ra, hay nói cách khác dưới tác dụng của enzyme catalase phân giải H2O2 theo phương trình:
2 2 2 2
1 2
C a ta la se
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter
b. Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone (phương pháp 2.2.2.4)
Vi khuẩn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 300C trong vòng 48h. Nhỏ dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone. Kết quả cả 5 mẫu vi khuẩn đều thấy xuất hiện kết tủa Cu2O màu đỏ gạch.
c. Phát hiện khả năng sinh sắc tố nâu
Khi nuôi cấy 5 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn trên môi trường thạch và dịch thể, không thấy hình thành sắc tố nâu, điều đó chứng tỏ những chủng vi khuẩn Acetobacter không hình thành sản phẩm 2,5-dixeto gluconic acid và
- propyonic cho nên dịch nuôi cấy không màu. Kết quả: 5 mẫu vi khuẩn đều không thấy hình thành sắc tố nâu.
d. Khả năng tổng hợp cellulose
Khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28 - 300C (phương pháp 2.2.2.6) trong vòng 3 - 4 ngày, và thử bằng iot:
Các mẫu X1, X2 có màng mỏng, bắt màu vàng với iot;
Các mẫu X4, X5, X6 có màng khá dày và hơi nhăn, bắt màu xanh với iot (Trong đó mẫu X4, có màu xanh nhạt, mẫu X5, X6 có màu xanh đậm hơn)
e. Sinh trưởng trên môi trường Hoyer (phương pháp 2.2.2.5).
bằng cách lấy dịch nuôi cấy đếm số lượng tế bào vi khuẩn trên buồng đếm cho thấy số lượng 5 mẫu vi khuẩn không tăng. Môi trường Hoyer là môi trường chỉ bao gồm các nhân tố khoáng, 5 mẫu vi khuẩn Acetobacter sử dụng muối (NH4)2SO4 như là nguồn nitơ và rượu êtylic như là nguồn cacbon để duy trì sự tồn tại của tế bào, mà không tăng sinh khối tế bào.
Điều này có thể giải thích như sau: Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung [2] và Nguyễn Thành Đạt [10]5 mẫu Acetobacter này thuộc nhóm vi sinh vật khuyết dưỡng, điều kiện cho chúng sinh trưởng tăng sinh khối khi môi trường nuôi cấy được bổ sung các chất kích thích sinh trưởng (acid folic, các loại vitamin B5, B6, B12...). Kết quả thí nghiệm cho thấy 5 mẫu vi khuẩn không có khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer là: X1, X2, X4, X5, X6.
3.1.3.2. Đặc tính sinh học
a. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa
Vi khuẩn Acetobacter khi nuôi cấy trên môi trường đặc sau 3 ngày sẽ hình thành các khuẩn lạc đặc trưng, khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng tròn, màu trắng đục, đa số bề mặt khuẩn lạc trơn bóng, cấu trúc khuẩn lạc đồng nhất, kích thước trung bình của khuẩn lạc 1,5 – 2 mm.
Hình 3.5. Khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter X4 trên môi trường thạch đĩa
Hình 3.6. Mẫu vi khuẩn Acetobacter X4 trên môi trường thạch nghiêng
b. Hình thái và tế bào học
Từ các chủng vi khuẩn thu được, soi trên kính hiển điện tử quét SEM- S4800 với độ phóng đại 10000 lần. Kết quả như hình 3.7 (Quy trình làm tiêu bản và chụp ảnh do kỹ thuật viên Viện vệ sinh Dịch tễ trung ương thực hiện)
X1 X2
X5 X6 X4
Hình 3.7. Hình thái của chủng Vi khuẩn X4 và 4 chủng Vi khuẩn X1, X2, X5, và X6 trên kính hiển vi điện tử có độ phóng đại 10.000 lần
Kết quả cho thấy 5 chủng Acetobacter đã tuyển có hình dạng hình que ngắn đồng nhất. Trong đó Acetobacter X4 có hình que rõ ràng, đầu tròn đều với kích thước trung bình dài khoảng 650 – 750 nm.
3.1.4. Phân loại các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn
Trên cơ sở các nghiên cứu về đặc tính sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn
Bảng 3.1. Đặc điểm sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter
STT
Đặc điểm Hiện tượng
Kết quả X1, X2 X4, X5 X6
1 Oxy hoá ethanol thành acid acetic
Chuyển hoá môi trường chứa Brom phenol Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng
+ + +
2 Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí + + + 3 Sinh trưởng trên
môi trường Hoyer
Sinh khối không phát triển
– – –
4
Chuyển hoá glucose thành acid
Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường chứa CaCO3
+ + +
5 Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu
Không hình thành sắc tố
nâu – – –
6 Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose
Váng vi khuẩn xuất hiện
màu lam – + +
7
Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyacetone
Tạo kết tủa đỏ gạch trong
dịch sau lên men + + +
8 Nhuộm Gram Bắt màu hồng Gram
âm Gram âm Gram âm Chú thích: +: Kết quả dương tính. –: Kết quả âm tính.
Dựa theo các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn acetic của Bergeys (1914), Yamada và cs (2000) [51],Boesch và cs (1998) [17],Bergey (1992) [16], căn cứ vào các kết quả khảo sát các một số đặc điểm sinh học của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter có thể khẳng định đây là các mẫu vi khuẩn thuộc họ Acetobacteraceae.
Căn cứ vào đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa, theo Bergeys (1914), Nguyễn Lân Dũng (1976) [8]; Căn cứ kết quả của Balentine DA (1997) [15] phân lập được Acetobacter xylinum, Liu CH, Hsu WH, Lee FL, Liao CC (1996) [38] phân lập được Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus trong kombucha có thể xếp 5 chủng vi khuẩn đã tuyển chọn như sau: Acetobacter aceti: X1, X2; Acetobacter xylinum: X4; Acetobacter pasteurianus: X5, X6. Tuy nhiên, trong giới hạn đề tài này không tập trung vào nghiên cứu phân loại nên việc phân loại cần được nghiên cứu sâu hơn.
Như vậy, từ 20 mẫu vi khuẩn ban đầu phân lập được, đã tuyển chọn sơ bộ được 5 vi khuẩn Acetobacter