b. Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone (phương pháp 2.2.2.4)
Vi khuẩn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 300C trong vòng 48h. Nhỏ dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone. Kết quả cả 5 mẫu vi khuẩn đều thấy xuất hiện kết tủa Cu2O màu đỏ gạch.
c. Phát hiện khả năng sinh sắc tố nâu
Khi nuôi cấy 5 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn trên môi trường thạch và dịch thể, không thấy hình thành sắc tố nâu, điều đó chứng tỏ những chủng vi khuẩn Acetobacter không hình thành sản phẩm 2,5-dixeto gluconic acid và
- propyonic cho nên dịch nuôi cấy không màu. Kết quả: 5 mẫu vi khuẩn đều không thấy hình thành sắc tố nâu.
d. Khả năng tổng hợp cellulose
Khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28 - 300C (phương pháp 2.2.2.6) trong vòng 3 - 4 ngày, và thử bằng iot:
Các mẫu X1, X2 có màng mỏng, bắt màu vàng với iot;
Các mẫu X4, X5, X6 có màng khá dày và hơi nhăn, bắt màu xanh với iot (Trong đó mẫu X4, có màu xanh nhạt, mẫu X5, X6 có màu xanh đậm hơn)
e. Sinh trưởng trên môi trường Hoyer (phương pháp 2.2.2.5).
bằng cách lấy dịch nuôi cấy đếm số lượng tế bào vi khuẩn trên buồng đếm cho thấy số lượng 5 mẫu vi khuẩn không tăng. Môi trường Hoyer là môi trường chỉ bao gồm các nhân tố khoáng, 5 mẫu vi khuẩn Acetobacter sử dụng muối (NH4)2SO4 như là nguồn nitơ và rượu êtylic như là nguồn cacbon để duy trì sự tồn tại của tế bào, mà không tăng sinh khối tế bào.
Điều này có thể giải thích như sau: Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung [2] và Nguyễn Thành Đạt [10]5 mẫu Acetobacter này thuộc nhóm vi sinh vật khuyết dưỡng, điều kiện cho chúng sinh trưởng tăng sinh khối khi môi trường nuôi cấy được bổ sung các chất kích thích sinh trưởng (acid folic, các loại vitamin B5, B6, B12...). Kết quả thí nghiệm cho thấy 5 mẫu vi khuẩn không có khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer là: X1, X2, X4, X5, X6.
3.1.3.2. Đặc tính sinh học
a. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa
Vi khuẩn Acetobacter khi nuôi cấy trên môi trường đặc sau 3 ngày sẽ hình thành các khuẩn lạc đặc trưng, khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng tròn, màu trắng đục, đa số bề mặt khuẩn lạc trơn bóng, cấu trúc khuẩn lạc đồng nhất, kích thước trung bình của khuẩn lạc 1,5 – 2 mm.
Hình 3.5. Khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter X4 trên môi trường thạch đĩa
Hình 3.6. Mẫu vi khuẩn Acetobacter X4 trên môi trường thạch nghiêng
b. Hình thái và tế bào học
Từ các chủng vi khuẩn thu được, soi trên kính hiển điện tử quét SEM- S4800 với độ phóng đại 10000 lần. Kết quả như hình 3.7 (Quy trình làm tiêu bản và chụp ảnh do kỹ thuật viên Viện vệ sinh Dịch tễ trung ương thực hiện)
X1 X2
X5 X6 X4
Hình 3.7. Hình thái của chủng Vi khuẩn X4 và 4 chủng Vi khuẩn X1, X2, X5, và X6 trên kính hiển vi điện tử có độ phóng đại 10.000 lần
Kết quả cho thấy 5 chủng Acetobacter đã tuyển có hình dạng hình que ngắn đồng nhất. Trong đó Acetobacter X4 có hình que rõ ràng, đầu tròn đều với kích thước trung bình dài khoảng 650 – 750 nm.
3.1.4. Phân loại các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn
Trên cơ sở các nghiên cứu về đặc tính sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn
Bảng 3.1. Đặc điểm sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter
STT
Đặc điểm Hiện tượng
Kết quả X1, X2 X4, X5 X6
1 Oxy hoá ethanol thành acid acetic
Chuyển hoá môi trường chứa Brom phenol Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng
+ + +
2 Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí + + + 3 Sinh trưởng trên
môi trường Hoyer
Sinh khối không phát triển
– – –
4
Chuyển hoá glucose thành acid
Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường chứa CaCO3
+ + +
5 Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu
Không hình thành sắc tố
nâu – – –
6 Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose
Váng vi khuẩn xuất hiện
màu lam – + +
7
Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyacetone
Tạo kết tủa đỏ gạch trong
dịch sau lên men + + +
8 Nhuộm Gram Bắt màu hồng Gram
âm Gram âm Gram âm Chú thích: +: Kết quả dương tính. –: Kết quả âm tính.
Dựa theo các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn acetic của Bergeys (1914), Yamada và cs (2000) [51],Boesch và cs (1998) [17],Bergey (1992) [16], căn cứ vào các kết quả khảo sát các một số đặc điểm sinh học của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter có thể khẳng định đây là các mẫu vi khuẩn thuộc họ Acetobacteraceae.
Căn cứ vào đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa, theo Bergeys (1914), Nguyễn Lân Dũng (1976) [8]; Căn cứ kết quả của Balentine DA (1997) [15] phân lập được Acetobacter xylinum, Liu CH, Hsu WH, Lee FL, Liao CC (1996) [38] phân lập được Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus trong kombucha có thể xếp 5 chủng vi khuẩn đã tuyển chọn như sau: Acetobacter aceti: X1, X2; Acetobacter xylinum: X4; Acetobacter pasteurianus: X5, X6. Tuy nhiên, trong giới hạn đề tài này không tập trung vào nghiên cứu phân loại nên việc phân loại cần được nghiên cứu sâu hơn.
Như vậy, từ 20 mẫu vi khuẩn ban đầu phân lập được, đã tuyển chọn sơ bộ được 5 vi khuẩn Acetobacter
3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha
3.2.1. Xác định hàm lượng acid tổng số được tạo ra của mỗi chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn
Trong quá trình lên men kombucha không chỉ có sản phẩm acid acetic do vi khuẩn Acetobacter tạo ra mà còn có nhiều sản phẩm acid khác. Vì vậy khi nghiên cứu quá trình lên men kombucha tôi cần xác định hàm lượng acid tổng số tạo ra bằng phương pháp nuôi cấy 5 chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên môi trường 3, ở nhiệt độ 300C sau 7 ngày lên men (lặp lại 3 lần một mẫu). Kết quả được thống kê theo bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 5 chủng vi khuẩn Acetocbacter
STT Chủng M±m δ(%) Cv(%) 1 X1 25,01±0,027 0,046 0,128 2 X2 29,12±0,012 0,021 0,072 3 X4 33,00±0,040 0,069 0,209 4 X5 32,97±0,036 0,063 0,191 5 X6 30,01±0,021 0,037 0,123
Qua bảng 3.2 nhận thấy 5 mẫu vi khuẩn Acetobacter thí nghiệm đều có khả năng oxy hóa ethanol tạo thành acid acetic. Hàm lượng acid tổng số có trong dịch lên men từ 25,01 đến 33,00 (mg/l). Các mẫu vi khuẩn khác nhau tạo ra hàm lượng acid acetic khác nhau, trong đó thấp nhất là mẫu vi khuẩn X1, cao nhất là mẫu X4. Với mục đích tuyển chọn được chủng vi khuẩn lên men kombucha có chất lượng tốt nhất, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy, nhân giống 5 mẫu vi khuẩn để bổ sung vào môi trường lên men tạo sản phẩm kombucha và tiến hành đánh giá chất lượng sản phẩm thu bằng phương pháp cảm quan.
3.2.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha
Sau 7 ngày lên men chúng tôi tiến hành đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha tạo ra từ 5 chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn được bằng phương pháp cảm quan dựa trên các tiêu chí đưa ra ở bảng 2.1, 2.2, 2.3
(phương pháp 2.2.3) kết quả thu được như sau:
Bảng 3.3. Khả năng tạo độ trong, hương thơm và mùi vị đặc trưng của kombucha từ 5 chủng vi khuẩn Acetobacter
STT Chỉ tiêu đánh giá Chủng X1 X2 X4 X5 X6 1 Độ trong và màu sắc 2,8 3,4 3,6 3,2 3,4 2 Mùi 4,2 3,6 5,6 4,9 3,6 3 Vị 6,0 6,8 9,4 6,2 6,8 4 Tổng điểm 13,0 13,8 18,6 14,3 13,8
Kết quả cho thấy 5 mẫu vi khuẩn Acetobacter đều tạo ra sản phẩm kombucha có màu vàng tươi, mùi vị đặc trưng tùy theo các mức độ khác nhau. Có thể phân chia các mẫu thành 3 loại sau:
Loại 1: Sản phẩm có chất lượng tốt là sản phẩm có mùi vị đặc trưng, màu vàng tươi, hương thơm mát dịu gồm chủng X4.
Loại 2: Sản phẩm có chất lượng khá là sản phẩm thiếu một trong các đặc điểm về mùi vị hoặc màu sắc hoặc hương thơm đặc trưng: gồm chủng X5.
Loại 3: Sản phẩm có chất lượng trung bình và kém là sản phẩm không có hoặc thiếu từ lớn hơn 1 các đặc điểm về mùi vị hoặc màu sắc hoặc hương thơm đặc trưng: gồm các chủng: X1, X2, X6.
Từ kết quả ở bảng 3.2 kết hợp với bảng 3.3 nhận thấy chủng vi khuẩn
Acetobacter X4 và X5 có khả năng sinh acid cao. Trong đó Acetobacter X4 tạo ra sản phẩm kombucha tạo ra thơm, ngon, đặc trưng nên tôi quyết định tuyển chọn chủng này làm đối tượng nghiên cứu tiếp theo.
Kết qủa các chủng Acetobacter đã tuyển chọn để lên men kombucha tạo ra hàm lượng acid và tạo ra sản phẩm có chất lượng khác nhau. Trong đó, chủng Acetobacter X4 tạo ra hàm lượng acid cao nhất, lên men tạo sản phẩm kombucha thơm, ngon, đặc trưng.
3.2.3. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter X4
Động thái sinh trưởng của một chủng vi khuẩn phản ánh khả năng sinh trưởng và sinh sản của chúng trong thời gian nhất định. Để nghiên cứu động thái sinh trưởng của Acetobacter X4 chúng tôi tiến hành nuôi cấy
Acetobacter X4 trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau những khoảng thời gian định sẵn ở các thời điểm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ dịch nuôi cấy được lấy ra 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Sau sau 3 ngày nuôi ở 300C đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.8.
Bảng 3.4. Quá trình sinh trưởng của chủng Acetobacter X4
Thời gian ( h) Số lượng tế bào (x106) δ
0 2,0±0,006 0,10 12 16,9±1,295 0,92 24 48,6±0,682 1,18 36 73,5±0,578 1,00 48 115,1±2,514 4,35 60 125,7±2,405 4,16 72 127,3±0,017 0,03 84 103,1±0,035 0,06 96 90,5±0,099 0,17
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter X4
Từ kết quả nghiên cứu ở bảng 3.4 và hình 3.8 ta thấy:
Trong 12 giờ đầu pha lag, số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng đều nhưng mức tăng chậm. Giai đoạn này vi khuẩn làm quen với môi trường, tích luỹ chất dinh dưỡng và năng lượng cho các giai đoạn sinh trưởng tiếp theo.
Từ 12 - 48 giờ: Pha cấp số mũ (pha log), ở pha này số lượng tế bào tăng nhanh và đạt giá trị cực đại ở 48 giờ. Từ 24 giờ trở đi trong dịch nuôi cấy bắt đầu xuất hiện những sợi cellulose lơ lửng.
Từ 48 - 72 giờ: Pha cân bằng động, ở pha này số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy ổn định; số lượng tế bào chết đi và số lượng tế bào sinh ra
0 50 100 150 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Acetobacter X4 Acetobacter X4 Giờ
tương đối bằng nhau. Các sợi cellulose liên kết với nhau tạo thành lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường dịch thể dần dần dày dần lên theo thời gian.
Từ 72 giờ trở đi: Pha suy vong, ở pha này số lượng tế bào chết đi nhiều số lượng tế bào sinh ra làm cho tổng tế bào trong dịch nuôi cấy giảm nhanh hơn do nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, sản phẩm độc sản sinh trong quá trình trao đổi chất tăng. Trong quá trình sinh trưởng, Acetobacter X4 có thể tích luỹ được lượng acid acetic nhất định trong dịch lên men làm cho giá trị pH môi trường giảm dần theo thời gian 3]. Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Bergey 16, Đinh Thị Kim Nhung (1996) 2 với số lượng tế bào vi khuẩn đạt cực đại tại 48 giờ.
Như vậy, đã tuyển chọn được 5 chủng vi khuẩn Acetobacter có khả năng lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang, gồm các chủng X1, X2, X4, X5, X6. Trong quá trình lên men kombucha, trên cơ sở đánh giá cảm quan các sản phẩm đã chọn ra chủng Acetobacter X4 có khả năng tạo sản phẩm kombucha thơm, ngon, đặc trưng phù hợp với mục đích nghiên cứu.
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha kombucha
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình lên men kombucha men kombucha
3.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của (NH2)2SO4
Nguồn nitơ cung cấp cho cơ thể vi sinh vật nguyên liệu để hình thành các nhóm amin trong các phân tử aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên sinh chất giúp cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Do đó tôi quyết định chọn nguồn nitơ là (NH4)2SO4 và thay đổi nồng độ từ 1 đến 3 g/l. Kết quả thu được thể hiện qua biểu hình 3.9
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4
Từ biểu đồ ta nhận thấy hàm lượng acid tạo thành từ Acetobacter X4
đạt cực đại khi hàm lượng (NH4)2SO4 bổ sung ở mức 1.5g/l. Hàm lượng (NH4)2SO4 bổ sung cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hưởng đến hàm lượng acid tạo thành. Nguyên nhân này được giải thích như sau: mỗi loài vi sinh vật đều có khả năng hấp thụ nhất định các chất dinh dưỡng khác nhau là khác nhau. (NH4)2SO4 cung cấp nguồn nitơ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào vi khuẩn Acetobacter . Khi hàm lượng (NH4)2SO4
bổ sung quá cao vi khuẩn sẽ không thể hấp thụ hết, lượng (NH4)2SO4 dư trong môi trường sẽ ức chế sự phát triển của tế bào vi khuẩn cũng như đối với nấm men cùng sống cộng sinh trong kombucha. Nếu hàm lượng (NH4)2SO4 bổ sung quá thấp sẽ không đủ cung cấp cho nhu cầu của vi khuẩn, do vậy lượng acid tạo ra thấp. Mặt khác nitơ còn có mặt trong thành phần cấu tạo của nhiều hợp chất quan trọng như: acid nucleic, photphoslipid, một số coenzyme quan trọng như ATP, ADP, NADP, FAD và một số vitamin tham gia vào quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic.
Như vậy, hàm lượng (NH4)2SO4 thích hợp bổ sung cho quá trình lên men kombucha là 1.5 g/l. 28000 29000 30000 31000 32000 33000 34000 0.5 1 1.5 2 2.5 Acetobacter X4 Acetobacte… Hàm lượng acid tổng số (mg/l) Hàm lượng(NH4)2SO4 (g/l)
3.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của MgSO4.7H2O
Magie mang tính chất của một cofactor, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Ngoài ra magie giữ vai trò quan trọng trong việc làm liên kết các tiểu phần ribosome với nhau [6]. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của MgSO4.7H2Ođến quá trình lên men kombucha ở các nồng độ khác nhau, kết quả được thể hiện qua biểu đồ hình 3.10.
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của MgSO4.7H2O đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4
Qua biểu đồ ta thấy hàm lượng MgSO4.7H2O bổ sung cho quá trình lên men ảnh hưởng tới hàm lượng acid tổng số sinh ra. Mg là một nhân tố tham gia tạo thành enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Hàm lượng MgSO4. 7H2O quá thấp sẽ không đủ cung cấp cho hoạt động của tế bào vi khuẩn, nếu hàm lượng quá cao sẽ ức chế quá trình tạo ra acid.
Như vậy, hàm lượng MgSO4.7H2O cần bổ sung cho quá trình lên men kombucha là: 2g/l.
3.3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4.