Thời gian ( h) Số lượng tế bào (x106) δ
0 2,0±0,006 0,10 12 16,9±1,295 0,92 24 48,6±0,682 1,18 36 73,5±0,578 1,00 48 115,1±2,514 4,35 60 125,7±2,405 4,16 72 127,3±0,017 0,03 84 103,1±0,035 0,06 96 90,5±0,099 0,17
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter X4
Từ kết quả nghiên cứu ở bảng 3.4 và hình 3.8 ta thấy:
Trong 12 giờ đầu pha lag, số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng đều nhưng mức tăng chậm. Giai đoạn này vi khuẩn làm quen với môi trường, tích luỹ chất dinh dưỡng và năng lượng cho các giai đoạn sinh trưởng tiếp theo.
Từ 12 - 48 giờ: Pha cấp số mũ (pha log), ở pha này số lượng tế bào tăng nhanh và đạt giá trị cực đại ở 48 giờ. Từ 24 giờ trở đi trong dịch nuôi cấy bắt đầu xuất hiện những sợi cellulose lơ lửng.
Từ 48 - 72 giờ: Pha cân bằng động, ở pha này số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy ổn định; số lượng tế bào chết đi và số lượng tế bào sinh ra
0 50 100 150 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Acetobacter X4 Acetobacter X4 Giờ
tương đối bằng nhau. Các sợi cellulose liên kết với nhau tạo thành lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường dịch thể dần dần dày dần lên theo thời gian.
Từ 72 giờ trở đi: Pha suy vong, ở pha này số lượng tế bào chết đi nhiều số lượng tế bào sinh ra làm cho tổng tế bào trong dịch nuôi cấy giảm nhanh hơn do nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, sản phẩm độc sản sinh trong quá trình trao đổi chất tăng. Trong quá trình sinh trưởng, Acetobacter X4 có thể tích luỹ được lượng acid acetic nhất định trong dịch lên men làm cho giá trị pH môi trường giảm dần theo thời gian 3]. Kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của Bergey 16, Đinh Thị Kim Nhung (1996) 2 với số lượng tế bào vi khuẩn đạt cực đại tại 48 giờ.
Như vậy, đã tuyển chọn được 5 chủng vi khuẩn Acetobacter có khả năng lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang, gồm các chủng X1, X2, X4, X5, X6. Trong quá trình lên men kombucha, trên cơ sở đánh giá cảm quan các sản phẩm đã chọn ra chủng Acetobacter X4 có khả năng tạo sản phẩm kombucha thơm, ngon, đặc trưng phù hợp với mục đích nghiên cứu.
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha kombucha
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình lên men kombucha men kombucha
3.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của (NH2)2SO4
Nguồn nitơ cung cấp cho cơ thể vi sinh vật nguyên liệu để hình thành các nhóm amin trong các phân tử aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên sinh chất giúp cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Do đó tôi quyết định chọn nguồn nitơ là (NH4)2SO4 và thay đổi nồng độ từ 1 đến 3 g/l. Kết quả thu được thể hiện qua biểu hình 3.9
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4
Từ biểu đồ ta nhận thấy hàm lượng acid tạo thành từ Acetobacter X4
đạt cực đại khi hàm lượng (NH4)2SO4 bổ sung ở mức 1.5g/l. Hàm lượng (NH4)2SO4 bổ sung cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hưởng đến hàm lượng acid tạo thành. Nguyên nhân này được giải thích như sau: mỗi loài vi sinh vật đều có khả năng hấp thụ nhất định các chất dinh dưỡng khác nhau là khác nhau. (NH4)2SO4 cung cấp nguồn nitơ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào vi khuẩn Acetobacter . Khi hàm lượng (NH4)2SO4
bổ sung quá cao vi khuẩn sẽ không thể hấp thụ hết, lượng (NH4)2SO4 dư trong môi trường sẽ ức chế sự phát triển của tế bào vi khuẩn cũng như đối với nấm men cùng sống cộng sinh trong kombucha. Nếu hàm lượng (NH4)2SO4 bổ sung quá thấp sẽ không đủ cung cấp cho nhu cầu của vi khuẩn, do vậy lượng acid tạo ra thấp. Mặt khác nitơ còn có mặt trong thành phần cấu tạo của nhiều hợp chất quan trọng như: acid nucleic, photphoslipid, một số coenzyme quan trọng như ATP, ADP, NADP, FAD và một số vitamin tham gia vào quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic.
Như vậy, hàm lượng (NH4)2SO4 thích hợp bổ sung cho quá trình lên men kombucha là 1.5 g/l. 28000 29000 30000 31000 32000 33000 34000 0.5 1 1.5 2 2.5 Acetobacter X4 Acetobacte… Hàm lượng acid tổng số (mg/l) Hàm lượng(NH4)2SO4 (g/l)
3.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của MgSO4.7H2O
Magie mang tính chất của một cofactor, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Ngoài ra magie giữ vai trò quan trọng trong việc làm liên kết các tiểu phần ribosome với nhau [6]. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của MgSO4.7H2Ođến quá trình lên men kombucha ở các nồng độ khác nhau, kết quả được thể hiện qua biểu đồ hình 3.10.
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của MgSO4.7H2O đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4
Qua biểu đồ ta thấy hàm lượng MgSO4.7H2O bổ sung cho quá trình lên men ảnh hưởng tới hàm lượng acid tổng số sinh ra. Mg là một nhân tố tham gia tạo thành enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Hàm lượng MgSO4. 7H2O quá thấp sẽ không đủ cung cấp cho hoạt động của tế bào vi khuẩn, nếu hàm lượng quá cao sẽ ức chế quá trình tạo ra acid.
Như vậy, hàm lượng MgSO4.7H2O cần bổ sung cho quá trình lên men kombucha là: 2g/l.
3.3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4.
Phospho (P) và các hợp chất chứa phospho cũng như nồng độ của chúng trong môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đổi chất của
28000 29000 30000 31000 32000 33000 34000 0.5 1 1.5 2 2.5 Acetobacter X4 Acetobacter … Hàm lượng acid tổng số (mg/l)
tế bào vi sinh vật. Khi thay đổi nồng độ các hợp chất phospho trong môi trường sẽ dẫn đến thay đổi hàng loạt các quá trình tổng hợp các chất hợp phần của tế bào có chứa phospho, tế bào chất và nhân. Ngoài ra, phospho trong môi trường có tác dụng điều chỉnh hoạt tính enzyme đồng hóa thức ăn cacbon. Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4 đến quá trình lên men kombucha ở các nồng độ khác nhau, kết quả được mô tả như hình 3.11.
Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của KH2PO4 đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4
KH2PO4 1,0 (g/l) KH2PO4 1,5 (g/l) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.12. Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter X4 bổ sung hàm lượng KH2PO4 1,0 và 1,5 (g/l)
Qua biểu đồ 3.11 cho thấy, ở hàm lượng 1,5 g/l môi trường cho hiệu suất lên men cao nhất.
32480 32500 32520 32540 32560 32580 32600 32620 0.5 1 1.5 2 2.5 Acetobacter X4 Acetobacter X4 Hàm lượng acid tổng số (mg/l) Hàm lượng(NH2)2SO4 (g/l)
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ảnh hưởng của hàm lượng acid sinh ra nhưng chủ yếu là do phospho và kali có nhiều trong thành phần cấu tạo quan trọng của tế bào vi khuẩn như: acid nucleic, protein, phospholipid và nhiều coenzyme quan trọng như ADP, ATP, NADP,... tham gia vào quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic đến CO2 và H2O. Khi hàm lượng KH2PO4 từ 2,5 g/l trở lên sẽ dẫn tới dư thừa nó làm thay đổi đặc tính lý hóa của môi trường, ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn dẫn tới ảnh hưởng đến hàm lượng acid acetic sinh ra. Ngược lại nếu lượng phospho kali quá thấp (dưới 0,5 g/l) sẽ ảnh hưởng tới việc cấu thành coezyme xúc tác cho phản ứng trong quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. Hàm lượng KH2PO4 bổ sung cho quá trình lên men kombucha là 1,5 g/l.
3.3.1.4. Khảo sát tỉ lệ dung dịch trà đường
Tỉ lệ trà, đường trong dung dịch trà đường sử dụng trong lên men kombucha là một yếu tố quan trọng để tao ra sản phẩm kombucha thơm, ngon, đặc trưng. Hàm lượng đường hoặc trà quá cao đều ảnh hưởng đến chất lượng thành phẩm kombucha bởi các vi sinh vật được nuôi trong môi trường trà đường được cung cấp đủ đường, nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dưỡng khác. Chúng phát triển và biến đổi đường thành gluconic acid, đồng thời sản xuất ra một lượng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi thành acetic acid (cho trà có vị ngọt và có mùi chua của rượu táo lên men). Với nguyên liệu là đường saccharose, trà đen, qua việc nghiên cứu các chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang và tham khảo thêm các tài liệu về lên mem kombucha [21], [22], chúng tôi sử dụng nhiều lần các phép thử bằng cách thay đổi tỉ lệ đường và trà khác nhau. Sử dụng phương pháp cảm quan để đánh giá sản phẩm.