Theo Bergey (1992) 16, vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae
gồm 2 chi là Acetobacter và Gluconobacter. Cả hai chi đều có khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic. Acid acetic làm môi trường có chứa Blue Bromophenol 0.04% chuyển từ màu xanh lục sang màu vàng (hình 3.2). Các chủng thuộc chi Acetobacter có khả năng phân giải tiếp tục acid acetic thành CO2 và H2O phục hồi màu xanh của môi trường. Ngược lại, các chủng thuộc chi Gluconobacter không có khả năng phân giải acid acetic nên môi trường vẫn giữ màu vàng.
Hầu hết các mẫu vi khuẩn đã phân lập được đều có khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic (hình 3.3). Khả năng này mạnh yếu khác nhau tuỳ chủng. Hơn nữa các chủng đã phân lập được gồm 2 nhóm có tốc độ sinh trưởng khác nhau (nhóm sinh trưởng nhanh và nhóm sinh trưởng chậm) do đó việc theo dõi khả năng phục hồi màu xanh của môi trường để phân biệt 2 chi Acetobacter và Gluconobacter rất khó khăn, thiếu chính xác. Vì thế, sau bước 3, chúng tôi lựa chọn các chủng làm môi trường chuyển màu vàng và tiếp tục khảo sát khả năng oxy hoá acetate nhằm phân biệt các chủng thuộc 2 chi Acetobacter và Gluconobacter. Kết quả thu được 08 mẫu là: X1, X2, X4, X5, X6, X8. X11, X12.
3.1.2.4. Bước 4: Xác định khả năng tạo thành acid
Với 08 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn được chúng tôi tiếp tục xác định khả năng tạo thành acid bằng cách cấy trên môi trường thạch đĩa (môi trường 1) có bổ sung thêm CaCO3 7g/l (phương pháp 2.2.2.3). Các mẫu vi khuẩn có khả năng sinh acid, acid này phân giải CaCO3 trong môi trường do đó xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng sáng nhỏ trong suốt. Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường có chứa CaCO3 điều đó cho thấy acid đã được tạo thành. Chúng tham gia phản ứng với CaCO3 để chuyển môi trường từ màu trắng sang không màu theo phương trình:
H+ + CaCO3 → Ca2+ + H2O + CO2
Theo Bergey (1992) [16], cả 2 chi Acetobacter và Glucobacter đều có khả năng oxy hoá lactate nhưng chỉ có các vi khuẩn thuộc chi Acetobacter
mới có khả năng oxy hoá acetate. Vì thế, trong môi trường có chứa calcium acetate, các chủng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter có khả năng sử dụng muối acetate làm nguồn cacbon (khả năng oxy hoá acid acetic thành CO2 và H2O giải phóng ATP). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Hai-Peng Cheng và cs (2002) [25] khi xác định sự có mặt của acid gluconic trong tổng hợp cellulose.
Kết quả thu được 05 mẫu là: X1, X2, X4, X5, X6 có năng tạo thành acid Từ các kết quả trên cho thấy, 5 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn được là các vi khuẩn thuộc giống Acetobacter.
Từ 20 mẫu vi khuẩn phân lập được, đã sơ tuyển và xác định được một số đặc tính sinh hóa được 5 mẫu vi khuẩn thuộc chi (giống) Acetobacter, họ Acetobacteriaceae là: X1, X2, X4, X5, X6 có khả năng lên men kombucha
3.1.3. Nghiên cứu một số đặc tính của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
3.1.3.1. Đặc tính sinh hóa
a. Kiểm tra hoạt tính catalase (phương pháp 2.2.2.1)
Thu được kết quả là cả 5 mẫu vi khuẩn đều có phản ứng catalase dương tính. Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tượng sủi bọt khí (hình 3.3). Chứng tỏ oxy được giải phóng ra, hay nói cách khác dưới tác dụng của enzyme catalase phân giải H2O2 theo phương trình:
2 2 2 2
1 2
C a ta la se