6. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram
a. Phân lập vi khuẩn theo phương pháp Vinogradski
Để có được chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành phân lập từ nguồn nguyên liệu là kombucha. Trước hết cần thực hiện quá trình lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang thu được mẫu màng lên men với giống tự nhiên.
Cách làm: lấy dịch lên men kombucha lắc đều bằng máy vôntex trong 10 phút thu được huyền phù vi sinh vật. Pha loãng dịch huyền phù ở các
nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-8. Dùng pipet hút 50μl mẫu ở các độ pha loãng 10-3 đến 10-8 nhỏ lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp petri, dùng que trang trang đều. Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong 2 - 3 ngày. Dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trưng ra khỏi môi trường phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 40C [7], [8], [10].
b. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram
Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi khuẩn dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protein đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt.
Để tiến hành phương pháp nhuộm Gram cần lấy mẫu từ các chủng đã qua sơ tuyển làm tiêu bản. Khi đó tùy vào màu của tiêu bản thu được giúp ta phân biệt được vi khuẩn Gr- hay Gr+. Nếu sau khi nhuộm kép tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr-, bắt màu tím là vi khuẩn Gr+. Vi khuẩn Gr- không có khả năng giữ màu này nên dễ bị rửa trôi bởi cồn. Chỉ khi nhỏ Fucshin vi khuẩn Gr- mới bắt màu hồng của Fucshin [5], [8], [10], [11].
Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đại 1000 lần).
c. Quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi điện tử.
Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi ở 300C sau 3 ngày, trên bề mặt môi trường khuẩn lạc. Nạo nhẹ khuẩn lạc làm tiêu bản và soi trên kính hiển vi điện tử quét (SEM-S4800).
2.2.1.2. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đếm
a. Phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch đĩa
Số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri được đếm để xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức.
1 0 0 0 1
. .
1 0 0 1 0 n
N A
Trong đó: + N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu.
+ A- Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri.
+ 10-n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy [6], [8], [11].
b. Phương pháp đếm số lượng tế bào bằng phòng đếm
Đây là phương pháp đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật có trong mẫu phân tích. Pha loãng dịch huyền phú VSV đến 10-n, nhỏ một giọt dịch huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa khung đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ khung đếm cho dịch chiếm đầy khoang. Đếm số lượng tế bào theo các ô theo đường chéo hoặc theo các góc ở trung tâm khung đếm. Thường đếm 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm của khung đếm để tính số lượng tế bào trung bình của ô lớn. Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1ml lúc đầu:
N=A x 25 : V : n
Trong đó: + N – số lượng tế bào trong 1ml dịch huyền phù lúc đầu + A – số lượng tế bào trung bình trong 1 ô lớn
+ V – thể tích của 1 ô lớn
+ n – độ pha loãng của mẫu ( 10-n) + 25 là số ô lớn của toàn khung đếm [5]
2.2.1.3. Bảo quản chủng giống a. Bảo quản trên thạch nghiêng
Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 300C. Sau đó giữ trong
tủ lạnh 40C dùng cho nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [10], [12].
b. Bảo quản trong dung dịch glycerin 15% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng ở 300C sau 48 giờ đem li tâm dịch nuôi cấy trong 20 phút ở 3000 vòng/ phút, tách lấy phần sinh khối. Hoà đều sinh khối trong 1ml dung dịch glycerin 15% vô trùng giữ ở -800C trong các ống eppendof vô trùng. Bảo quản theo phương pháp này cho phép giữ giống trong vòng 1 đến 3 năm [9].
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hóa giống
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [12], [13].