Do quá trình diệt men làm đình chỉ hoạt động của enzyme, nên các thành phần trong búp chè ít bị biến đổi, hàm lượng polyphenol trích ly trong
nước là 30 – 40%, các vitamin và khoáng chất vẫn được giữ lại (đặc biệt là vitamin C). Vì vậy, giá trị dinh dưỡng của trà thành phẩm tương đối cao.
1.3. Tình hình nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam và trên thế giới
1.3.1. Trên thế giới
Từ năm 1852, trà kombucha đã được chú trọng nghiên cứu, chủ yếu là ở Châu Âu, đã có một số ít công trình nghiên cứu về trà kombucha, phần lớn tập trung nghiên cứu liên quan đến việc xác định thành phần hệ vi sinh vật, thành phần hóa học và phương pháp lên men.
Kombucha – sự cộng sinh của vi khuẩn và nấm men đã được nuôi để có được sản phẩm đồ uống lành mạnh [45], nhiều bài báo đã được viết về kombucha, được đăng tải trên các tạp chí quốc tế như “Taking the Fungal-Tea plunge, Newsweek, January 9, 1995”. Cavusoglu K., Gluer P. (2010) đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên nhiễm sắc thể gây ra bởi bức xạ gamma trong tế bào bạch huyết ngoại vi của con người trong ống nghiệm [19]. Dutta D., Gachhui R. (2006) đã phân lập vi khuẩn Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov. cố định đạm từ trà kombucha [20]. Dutta D., Gachhui R. (2007) đã phân lập từ trà kombucha vi khuẩn cố định đạm và cellulose là
Gluconacetobacter kombucha sp.nov. [21]. J Reiss, (1994) đã tìm hiểu ảnh hưởng của các loại đường khác nhau lên quá trình trao đổi chất của nấm trà [27]. Jayabalan R., Malini K., Sathishkumar M., Swaminathan K.,Yun S.-E. (2010) tìm hiểu đặc điểm sinh hóa của nấm trà [28]. K.H. Steinkraus, K.B. Shapiro, J.H. Hotchkiss, R.P. Mortlock,(1996) viết về hoạt động kháng sinh của trà nấm kombucha [34]. Nguyen Vu Tuan; Flanagan, Bernadine; Gidley, Michael J.; Dykes, Gary A. (2008) tìm hiểu đặc tính của màng BC bởi chủng
Gluconacetobacter xylinus phân lập từ kombucha [40]. Petrushevska-Tozi L., Bauer-petrovska B. (2000) đã xác định được hàm lượng vitamin hòa tan và khoáng trong nước uống kombucha [42]. R.A. Ledford C.J. Greenwalt, and
K.H. Steinkraus đã xác định và mô tả đặc điểm của các hoạt động chống vi khuẩn của kombucha trà lên men [43]. Velicanski, Aleksandra; Cvetkovic, Dragoljub; Markov, Sinisa; Tumbas, Vesna; Savatovic, Sladjana (2007) viết về hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha [48]. Z. Kovacevic, G.Davidovic (2014) viết về viêm gan vàtác dụng gây độc của trà kombucha [55].
1.3.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, những công trình nghiên cứu về kombucha còn rất ít và chưa đầy đủ, hoàn chỉnh về khu hệ nấm men, vi khuẩn lên men kombucha. Tác dụng chữa bệnh và độ độc hại của loại trà này cần phải được nghiên cứu, kiểm tra và giám định chắc chắn.
Hà Văn Hùng, Phó Viện trưởng Viện Y dược học dân tộc Thành phố Hồ Chí Minh cũng cho rằng cho đến nay Viện cũng chưa có công trình nào nghiên cứu về thủy sâm nên không biết rõ thành phần và công dụng của nó [40]. Lê Kim Phụng, nguyên giảng viên Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, người đã có một số bài viết về thủy sâm, cho biết: "Hiện nay ở nước ta đang xuất hiện một loại thuốc bổ ở dạng lỏng như trà mà mọi người gọi là trà "thủy sâm", thực ra đây chính là một loại thức uống có từ rất lâu được gọi tên là "The Remedy for Immortality", nghĩa là "Phương thuốc Trường sinh". Thủy sâm thực sự chỉ là một loại cái giấm (nấm men) phát triển dưới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng. Loại giấm này sinh sôi nhanh trong môi trường nước chè (trà) pha đường. Thành phần trà kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ.
Lâm Thị Hồng Liên (2013), Đại sư phạm Hà Nội 2 đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang” đã tuyển chọn được 2 chủng nấm men Saccharomyces M1 và Saccharomyces M2 phù hợp cho quá trình lên men kombucha, khảo sát
được ảnh hưởng của hàm lượng men giống, pH ban đầu, nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của hai chủng nấm men M1, M2.
Nữ Liên Hương thuộc khoa Khoa học Tự nhiên – Đại học Cần Thơ đã có bản báo cáo khoa học với tên đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chế biến tới một số tính chất và hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha”, tháng 3 năm 2013. Nội dung của bản báo cáo khoa học: giới thiệu trà giấm kombucha, định hướng nghiên cứu thực nghiệm, tóm tắt các kết quả nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học của trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt kết quả khảo sát hàm lượng của các hợp chất hữu cơ có hoạt tính trong trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt về một số hoạt tính sinh học của trà giấm Kombucha: tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, độc tính trên tế bào ung thư, theo thời gian lưu mẫu, trên từng loại trà giấm. Như vậy, có thể thấy các nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam còn rất ít, các nghiên cứu về chủng vi khuẩn, ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình sinh trưởng của vi khuẩn trong lên mem kombucha hầu như không có.
2. CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng
Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn thuần khiết phân lập từ kombucha được lên men từ trà Shan tuyết Hà Giang trong phòng thí nghiệm vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Nguồn cacbon: glucose (C6H12O6 ), acid acetic...; Nguồn nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4 ...; Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4 ...; Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol, …;
H2SO4 , CaCO3 , thạch agar…
2.1.2.2. Thiết bị
- Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức); - Nồi hấp Tommy (nhật); - Box vô trùng (Haraeus);
- Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl – 10ml; - Máy đo pH (MP 200R - Thuỵ Sĩ);
- Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ); - Máy cất nước 2 lần (Hamilton – Anh); - Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức); - Buồng đếm Petroff – Housser.
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn...và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác.
2.1.3. Môi trường
* Môi trường phân lập giống (MT1) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Glucose : 20g MgSO4.7H2O : 2g (NH4)2SO4 : 3g CaCO3 : 10g KH2PO4 : 2g Agar: 20g
Pepton : 4g Nước máy : 1000ml Acid acetic: 2% ( bổ sung sau khi khử trùng ) Rượu etylic : 2% ( bổ sung sau khi khử trùng ) * Môi trường nhân giống cơ bản (MT2)
Glucose : 20g MgSO4.7H2O : 2g (NH4)2SO4: 3g KH2PO4 : 2g
Pepton : 4g Nước máy : 1000ml Acid acetic: 2% ( bổ sung sau khi khử trùng ) Rượu etylic : 2% ( bổ sung sau khi khử trùng ) * Môi trường lên men kombucha (MT3)
Saccharose : 100g Trà Shan Tuyết: 15g Nước máy : 1000ml
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram
a. Phân lập vi khuẩn theo phương pháp Vinogradski
Để có được chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành phân lập từ nguồn nguyên liệu là kombucha. Trước hết cần thực hiện quá trình lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang thu được mẫu màng lên men với giống tự nhiên.
Cách làm: lấy dịch lên men kombucha lắc đều bằng máy vôntex trong 10 phút thu được huyền phù vi sinh vật. Pha loãng dịch huyền phù ở các
nồng độ khác nhau từ 10-1 đến 10-8. Dùng pipet hút 50μl mẫu ở các độ pha loãng 10-3 đến 10-8 nhỏ lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp petri, dùng que trang trang đều. Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong 2 - 3 ngày. Dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trưng ra khỏi môi trường phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 40C [7], [8], [10].
b. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram
Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi khuẩn dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protein đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt.
Để tiến hành phương pháp nhuộm Gram cần lấy mẫu từ các chủng đã qua sơ tuyển làm tiêu bản. Khi đó tùy vào màu của tiêu bản thu được giúp ta phân biệt được vi khuẩn Gr- hay Gr+. Nếu sau khi nhuộm kép tế bào bắt màu hồng thì đó là vi khuẩn Gr-, bắt màu tím là vi khuẩn Gr+. Vi khuẩn Gr- không có khả năng giữ màu này nên dễ bị rửa trôi bởi cồn. Chỉ khi nhỏ Fucshin vi khuẩn Gr- mới bắt màu hồng của Fucshin [5], [8], [10], [11].
Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đại 1000 lần).
c. Quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi điện tử.
Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Nuôi ở 300C sau 3 ngày, trên bề mặt môi trường khuẩn lạc. Nạo nhẹ khuẩn lạc làm tiêu bản và soi trên kính hiển vi điện tử quét (SEM-S4800).
2.2.1.2. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đếm
a. Phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch đĩa
Số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri được đếm để xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức.
1 0 0 0 1
. .
1 0 0 1 0 n
N A
Trong đó: + N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu.
+ A- Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri.
+ 10-n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy [6], [8], [11].
b. Phương pháp đếm số lượng tế bào bằng phòng đếm
Đây là phương pháp đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật có trong mẫu phân tích. Pha loãng dịch huyền phú VSV đến 10-n, nhỏ một giọt dịch huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa khung đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ khung đếm cho dịch chiếm đầy khoang. Đếm số lượng tế bào theo các ô theo đường chéo hoặc theo các góc ở trung tâm khung đếm. Thường đếm 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm của khung đếm để tính số lượng tế bào trung bình của ô lớn. Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1ml lúc đầu: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
N=A x 25 : V : n
Trong đó: + N – số lượng tế bào trong 1ml dịch huyền phù lúc đầu + A – số lượng tế bào trung bình trong 1 ô lớn
+ V – thể tích của 1 ô lớn
+ n – độ pha loãng của mẫu ( 10-n) + 25 là số ô lớn của toàn khung đếm [5]
2.2.1.3. Bảo quản chủng giống a. Bảo quản trên thạch nghiêng
Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 300C. Sau đó giữ trong
tủ lạnh 40C dùng cho nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [10], [12].
b. Bảo quản trong dung dịch glycerin 15%
Chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường dịch lỏng ở 300C sau 48 giờ đem li tâm dịch nuôi cấy trong 20 phút ở 3000 vòng/ phút, tách lấy phần sinh khối. Hoà đều sinh khối trong 1ml dung dịch glycerin 15% vô trùng giữ ở -800C trong các ống eppendof vô trùng. Bảo quản theo phương pháp này cho phép giữ giống trong vòng 1 đến 3 năm [9].
2.2.1.4. Phương pháp hoạt hóa giống
Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210C trong 20 phút. Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [12], [13].
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
2.2.2.1. Phát hiện hoạt tính catalase
Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +). Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase) [2], [5].
2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá rượu etylic thành acid acetic
Nuôi cấy chủng vi khuẩn trên môi trường có thành phần (g/l):
Cao nấm men: 10g Rượu êtylic: 10%-15% (vol/vol) Nước máy : 1000ml pH: 6,8-7.0
Xanh Bromophenol (BPB) 0,04%: 20ml
Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5ml), khử trùng ở 1210C trong 20 phút, để nguội khoảng 300C cấy vi khuẩn nghiên cứu mới hoạt hoá,
nuôi 7 ngày trong điều kiện thích hợp. Quan sát thấy môi trường chuyển sang màu vàng là dương tính, không đổi màu là âm tính.
Pha dung dịch BPB 0,04%: cân 0,1g BPB nghiền nhỏ trong cốc sứ, sau đó bổ sung 14,9 ml NaOH 0,001N hoà tan cho đều. Đổ tất cả vào bình định mức thêm nước cho đến khi thể tích đạt 250ml [2].
2.2.2.3. Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic
Sử dụng môi trường sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn.
Thành phần (g/l): Cao nấm men : 10g Canxi acetat: 10g
Thạch : 20g Nước máy: 1000ml
pH : 7,0-7,2
Quan sát hiện tượng nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dương tính, ngược lại là âm tính [2], [6], [9].
2.2.2.4. Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone
Để phát hiện khả năng hình thành dihydroxyacetone từ glycerol. Chúng tôi tiến hành trên môi trường bao gồm thành phần sau:
Glycerol: 4% (g/l) Cao nấm men: 0,3 % (g/l) Cao ngô: 3% (g/l) CaCO3 : 0,3% (g/l) (NH4)2SO4: 0,1% (g/l) H2O: 1000ml pH = 5,3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hấp thanh trùng 1210C trong 10 phút. Để môi trường nguội cấy giống vi khuẩn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 300C trong vòng 48h. Nhỏ dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone (có sự xuất hiện kết tủa Cu2O màu đỏ gạch).
2.2.2.5. Sinh trưởng trên môi trường Hoyer
Thành phần môi trường: (g/l)
(NH4)2SO4: 1g KH2PO4 : 0,9g
FeCl3.6H2O: 0,02g MgSO4.7H2O: 0,25g K2HPO4 : 0,1g Rượu êtylic 99,5%: 20ml
Hấp thanh trùng 1210C trong 15 phút. Để môi trường nguội bổ sung giống nghiên cứu nuôi ở nhiệt độ khoảng 300C trong 0, 12, 24, 48 giờ sau đó đếm số lượng tế bào trên buồng đếm.
2.2.2.6. Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28 - 300C trong vòng 3 - 4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% nó chuyển hoá thành màu xanh lam.
2.2.2.7. Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị
Cho vào cốc thủy tinh (loại 100 ml hoặc 200 ml) dịch lên men thêm vào đó 1 – 2 giọt phenolphtalein 0,1%, chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N. Chú ý chuẩn độ cần phải lắc nhẹ đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt. Sau đó tính số gam acid tổng số trong 100 ml dung dịch lên men theo công thức:
= . .100
10 ( / )
Trong đó: X : Số gam acid tổng số trong 100 ml dung dịch lên men
V : Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 10 ml dung dịch lên men