Số thứ tự Mẫu thử Lượng đường (g) Lượng trà (g)
1. T1 90 15 2. T2 90 20 3. T3 90 25 4. T4 100 15 5. T5 100 20 6. T6 100 25
Trong các mẫu thử, mẫu thử T4 có đủ các tiêu chí đánh giá mùi vị đặc trưng, màu vàng tươi, hương thơm mát dịu. Vì vậy, chúng tôi chọn sử dụng tỉ lệ này cho các nghiên cứu và thực nghiệm của đề tài.
Như vậy, hàm lượng (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4 bổ sung cho quá trình lên men kombucha lần lượt là 1,5; 2; 1,5 (g/l). Tỉ lệ dung dịch trà đường sử dụng để lên men kombucha là: 15 g trà, 100 g đường saccharose cho 1000 ml nước.
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha kombucha
3.3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men
Khi nuôi cấy Acetobacter X4 trong MT3 đã được thanh trùng ở 1100C trong vòng 20 phút, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh ở 300C, nhận thấy:
Trong ngày đầu, số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng nhưng ở mức độ chậm. Vì ở giai đoạn này vi khuẩn làm quen với môi trường, tích lũy chất dinh dưỡng và năng lượng cho các giai đoạn tiếp theo. Đồng thời với quá trình tăng trưởng tế bào thì lượng acid cũng bắt đầu hình thành, pH môi trường giảm nhẹ.
5 ngày 7 ngày 9 ngày
Hình 3.13. Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter X4 với thời gian lên men 5, 7 và 9 ngày
Từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 7 lượng acid tăng nhanh, giai đoạn này các tế bào sinh trưởng mạnh và biến đổi êtylic thành acid acetic. Từ ngày thứ 7 trở đi lượng acid vẫn tiếp tục tăng nhưng với tốc độ chậm. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men được thể hiện qua bảng 3.6.
Bảng 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4
Ngày M±m (mg/l) δ (%) Cv (%) 0 0,000±0,000 0,000 0,000 1 5,120±0,017 0,030 5,859 2 9,380±0,023 0,040 4,264 3 16,720±0,023 0,040 2,392 4 23,250±0,035 0,061 2,624 5 29,810±0,004 0,007 0,235 6 31,320±0,017 0,030 0,958 7 32,450±0,053 0,092 2,835 8 32,890±0,099 0,171 5,199 9 33,150±0,035 0,061 1,840
Thời gian lên men càng lâu thì lượng acid sinh ra càng tăng, độ pH càng ngày càng giảm làm cho sản phẩm trở nên chua hơn. Để thu được sản phẩm kombucha thơm, ngon, có vị chua dịu mát chúng ta nên thu sản phẩm ở ngày lên men thứ 7 của quá trình lên men.
3.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống bổ sung ban đầu
Hàm lượng giống là một trong những yếu tố quyết định đến quá trình lên men, cần có tỷ lệ giống phù hợp với quá trình lên men nhằm đạt hiệu suất lên men cao và cho ra chất lượng sản phẩm kombucha thơm, ngon. Hàm lượng giống bổ sung trước khi lên men là rất quan trọng. Nếu bổ sung không đủ giống thì quá trình lên men diễn ra chậm, hơn nữa dịch lên men sẽ dễ nhiễm tạp. Ngược lại, nếu bổ sung nhiều giống quá thì hàm lượng dinh dưỡng trong dịch lên men có thể không đáp ứng đủ cho vi khuẩn sinh trưởng và tăng sinh khối, xét về mặt kinh tế sẽ làm tăng giá thành sản phẩm. Chúng tôi tiến hành cấy chủng Acetobacter X4 vào môi trường dịch lên men với tỷ lệ giống ban đầu là: 2, 4, 6, 8, 10,12%V. Sau 7 ngày lên men chúng tôi tiến hành đo hàm lượng acid sinh ra, kết quả thu được như bảng 3.7.
Bảng 3.7. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4
Tỷ lệ giống(%) M±m (mg/l) δ (%) Cv (%) 2 28,090±0,023 0,040 1,424 4 29,570±0,035 0,061 2,063 6 30,040±0,035 0,061 2,031 8 32,110±0,004 0,007 0,218 10 32,340±0,017 0,030 0,928 12 33,060±0,053 0,092 2,783
Từ kết quả dẫn ra ở bảng 3.6, nhận thấy: Tỷ lệ giống bổ sung từ 2% - 6% là không phù hợp, thời gian lên men diễn ra dài hơn, tốc độ lên men diễn ra chậm, dịch lên men dễ bị nhiễm tạp. Tỷ lệ giống bổ sung là 8% quá trình
lên men tương đối tốt, tuy nhiên chưa thực sự tạo ra được mùi vị đặc trưng của kombucha. Ở tỷ lệ giống bổ sung là 10% và 12%, nhận thấy quá trình lên men diễn ra nhanh, sản phẩm tạo ra có vị thơm ngon đặc trưng. Khi tăng tỷ lệ giống thì thời gian lên men được rút ngắn (tuỳ thuộc vào hàm lượng dinh dưỡng có trong dịch lên men). Tuy nhiên, tỷ lệ giống càng nhiều dẫn đến quá trình lên men diễn ra càng nhanh, lượng acid tạo ra càng nhiều làm cho sản phẩm nhanh chua sẽ ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm.
Như vậy, để quá trình lên men kombucha được tốt, chúng tôi quyết định chọn tỷ lệ giống bổ sung ban đầu là 10%.
3.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của độ pH ban đầu
Giá trị pH được đo bằng nồng độ các ion H+ và OH- có trong môi trường, độ pH ban đầu của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến tính chất sinh lý của tế bào nên ảnh hưởng đến khả năng lên men kombucha. Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của độ pH đối với quá trình lên men kombucha trên môi trường dịch lên men có độ pH khác nhau: 3; 3,5; 4; 4,5; 5. Sau thời gian 7 ngày ở 300C kết quả thu được như bảng 3.8.
4. Bảng 3.8. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4
pH M±m (mg/l) δ (%) Cv (%) 3 31,230±0,035 0,061 1,953 3,5 31,910±0,023 0,040 1,254 4 32,960±0,039 0,069 2,093 4,5 32,750±0,034 0,059 1,802 5 31,300±0,027 0,046 1,470
Từ kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, pH từ 4 – 4,5 cho ra lượng acid cao nhất. Với pH: 5, lượng acid sinh ra ít hơn, cùng với đó là nguy cơ bị nhiễm nấm mốc và các vi sinh vật khác làm sản phẩm dễ bị hỏng.
Còn mức pH từ 3 – 3,5 lượng acid sinh ra thấp hơn vì trong thời gian đầu vi khuẩn Acetobacter khó chịu đựng được mà phải làm quen dần với môi trường.
Như vậy, với lên men kombucha, pH ban đầu thích hợp là 4 – 4,5. 3.3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ.
Nhiệt độ cũng là một yếu tố quan trọng quyết định đến quá trình lên men kombucha. Nhiệt độ thấp làm cho vi khuẩn sinh trưởng chậm, thời gian lên men kéo dài. Nhiệt độ cao làm tăng quá trình hô hấp trong tế bào vi khuẩn ảnh hưởng tới quá trình lên men. Để xác định được nhiệt độ thích hợp nhất cho lên men, chúng tôi tiến lên men ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau, xác định hàm lượng acid tạo thành. Kết quả được mô tả trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X4
Nhiệt độ(0C) M±m (mg/l) δ (%) Cv (%) 15 13,210±0,035 0,061 3,544 20 28,100±0,017 0,030 1,068 25 32,390±0,017 0,030 0,926 30 33,010±0,053 0,092 2,787 35 31,970±0,099 0,171 5,349 40 22,100±0,035 0,061 5,041 Nhiệt độ 200C Nhiệt độ 300C
Hình 3.13. Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter X4 ở nhiệt độ 200C và 300C
Từ kết quả bảng 3.9 cho thấy vi khuẩn Acetobacter là chủng vi khuẩn ưa ấm có thể sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 25 – 350C. Nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men là 300C. Nhiệt độ 15 – 200C, tốc độ quá trình lên men diễn ra chậm, thời gian lên men kéo dài. Ở nhiệt độ trên 350C ức chế quá trình sinh trưởng và lên men vì ở nhiệt độ cao sẽ làm bay hơi acid acetic tạo thành trong môi trường làm tăng pH dịch nuôi cấy ảnh hưởng tới quá trình lên men. Điều này giải thích tại sao lên men kombucha ở nhiệt độ phòng vào mùa hè sản phẩm thường bị chua. Như vậy, nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men kombucha là 300C.
Như vậy, điều kiện môi trường thích hợp nhất cho quá trình lên men kombucha gồm: Hàm lượng giống: 10%; pH ban đầu: 4 - 4,5 ; Nhiệt độ thích hợp: 300C; Hàm lượng (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4 bổ sung cho quá trình lên men kombucha lần lượt là 1,5; 2; 1,5 (g/l). Tỉ lệ trà, đường cho 1000 ml dung dịch trà đường là: 15 g trà, 100 g đườngsaccharose.
3.4. Thực hiện lên men kombucha
3.4.1. Sơ đồ lên men kombucha
Tương tự như lên men rau quả, lên men tạo sản phẩm kombucha là công việc khá đơn giản. Tuy nhiên, để tạo sản phẩm kombucha với chất lượng tốt, có mùi vị đặc trưng, màu vàng tươi, hương thơm mát, an toàn... cần phải sử dụng các loại nguyên liệu, hàm lượng các chất bổ sung loại giống (vi khuẩn, nấm men) đúng loại và tỉ lệ; đảm bảo yêu cầu vệ sinh. Về nguyên liệu trà, có thể tự lên men ở gia đình với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau (lá chè xanh, trà đen, trà lipton …). Trong các thí nghiệm của đề tài, chúng tôi sử dụng nguyên liệu là trà đen. Trên cơ sở kết quả nghiên cứu, cùng với tham khảo các tài liệu về cách làm kombucha, chúng tôi đã thực lên men kombucha từ các chủng vi khuẩn tuyển chọn theo sơ đồ hình 3.14.
Hình 3.14. Sơ đồ quy trình lên men Kombucha
Nước Gia nhiệt Trà
Nước Lọc; làm nguội Bã Trích ly Lọc Đường Dịch trà đường Nấu syrup Phối trộn Thanh trùng Dịch lên men Nấm men Vi khuẩn Lên men (7 ngày; 30 oC; ph 4.2) Dịch đã lên men Kombucha Thanh trùng; Đóng gói (Sản phẩm thương mại) Kombucha Bảo ôn (sử dụng tại gia đình)
3.4.2. Thuyết minh quy trình
* Giai đoạn 1: Chế biến dịch trà đường
Bước 1:Chế biến dịch trà
Tuyển chọn trà, tiến hành gia nhiệt nước, trích ly các chất hòa tan trong trà khô để thu được dịch trà và tiêu diệt vi sinh vật. Nhiệt độ gia nhiệt nước phải thích hợp để hiệu suất trích ly tối ưu nhưng vẫn giữ được chất lượng cảm quan trà tốt nhất. Tỉ lệ nước/trà = 1000ml/15g, nhiệt độ 1000C trong 5 phút.
Bước 2: Lọc
Mục đích: nhằm tách bã chè ra khỏi dịch trà, làm cho dịch trà trong không bị vẩn đục do đó làm tăng giá trị cảm quan của sản phẩm và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men.
Bước 3: Làm nguội
Mục đích: là hạ thấp nhiệt độ của dịch trà, hạn chế sự xâm nhập của vi sinh vật và thuận tiện cho quá trình phối trộn, tránh làm mất hương vị đặc trưng của sản phẩm.
Bước 4: Nấu nước đường và làm nguội
Nấu đường trước khi đưa vào phối trộn với dịch trà phải nấu thành dạng syrup có nồng độ 60 – 70%. Sirô nhất thiết phải được đun sôi, lọc và làm nguội. Mục đích của quá trình đun sôi sirô là khi đun sôi sẽ tiêu diệt được các vi sinh vật có trong đường và trong nước, mặt khác tạo điều kiện tốt để biến saccharose thành glucose và fructose và làm giảm độ nhớt của dung dịch đường giúp cho việc lọc dễ dàng. Yêu cầu sirô: màu sắc trong suốt, không màu hoặc có màu vàng nhạt. Có mùi đặc trưng của sirô, không có mùi vị lạ.
Lọc – làm nguội sirô: Lọc sirô trước hết phải lọc ở trạng thái nóng để giảm độ nhớt. Lọc nhằm mục đích tách hết các hợp chất cơ học như rác, đất cát lẫn vào đường trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Sau khi lọc, cần làm lạnh nguội để sirô không bị sẫm màu.
Bước 5: Phối trộn
Dịch sirô sau khi làm nguội được phối trộn cùng với dịch trà để tạo thành một dung dịch đồng nhất có nồng độ theo yêu cầu. Sau khi phối trộn, dịch trà cần được thanh trùng và để nguội về nhiệt độ phòng (28 – 320C) để chuẩn bị cho quá trình lên men.
* Giai đoạn 2: Lên men
Bổ sung nấm men (10%V), vi khuẩn (10%V) vào dịch lên men
Đây là quá trình lên men hiếu khí nên rất dễ nhiễm vi sinh vật lạ và đặc biệt là nấm mốc. Do đó cần điều chỉnh pH của dịch trà ≤ 4,2. Khoảng pH này tạo điều kiện bất lợi cho sự xâm nhiễm của đa số các loài vi sinh vật và nấm mốc. Thời gian lên men khoảng 7 ngày. Lên men đến khi đạt pH cuối = 2,5.
* Giai đoạn 3: Hoàn thiện và thu sản phẩm
Bước 1: Thu dịch đã lên men
Sau khi quá trình lên men kết thúc, vớt nấm kombucha, để thu lấy dịch lên men đem lọc. Thao tác vớt nấm kombucha phải đảm bảo điều kiện vệ sinh nghiêm ngặt, hạn chế nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài môi trường vào.
Bước 2: Lọc dịch lên men
Mục đích: loại bỏ cặn, xác vi sinh vật sau quá trình lên men, làm trong dịch lên men, tăng chất lượng cảm quan của sản phẩm, sau khi lọc, dịch lên men phải trong, không vẩn đục, vẫn giữ được mùi vị, màu sắc đặc trưng.
Bước 3: Thanh trùng
Mục đích: tiêu diệt nấm men, vi khuẩn, đình chỉ hoàn toàn quá trình lên men, tiêu diệt các vi sinh gây hại, tăng thời gian bảo quản sản phẩm.
Bước 4: Thu sản phẩm
Sau khi được thanh trùng, kombucha sẽ được đóng chai. Trong khâu đóng chai rất có thể bị nhiễm, vì vậy ở khâu này cần tuân thủ nghiêm ngặt các yêu cầu về vệ sinh. Bảo quản sản phẩm trong tủ lạnh, thời gian 1 tháng.
* Đánh giá chất lượng sản phẩm
Hội đồng gồm 7 người (A, B, C, D, E, G, H) đánh giá chất lượng một mẫu kombucha bằng phương pháp cảm quan cho điểm. [14]
Bảng 3.10 . Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha bằngphương pháp cảm quan
Chỉ tiêu chất lượng
Điểm chưa có trọng lượng
của Tổng số điểm chưa có trọng lượng Điểm trung bình chưa có trọng lượng Hệ số quan trọng Điểm đã được hiệu chỉnh A B C D E G H Độ trong và màu sắc 5 5 5 5 5 4 5 34 4,85 0,8 3,85 Mùi 5 5 5 4 5 4 5 33 4,71 1,2 5,65 Vị 5 5 5 5 5 5 4 34 4,85 2,0 9,7 Số điểm chung: 19,2.
Như vậy, theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3215-79 sản phẩm kombucha đánh giá được xếp loại tốt.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
1.1. Phân lập được 20 mẫu vi khuẩn, tuyển chọn được 5 mẫu vi khuẩn
Acetobacter có khả năng lên mem kombucha;
1.2. Đã tuyển chọn, chủng Acetobacter X4 có khả năng tạo sản phẩm kombucha thơm, ngon, đặc trưng phù hợp với mục đích nghiên cứu;
1.3. Đã khảo sát ảnh hưởng của của một số yếu tố tới động thái phát triển của chủng vi khuẩn Acetobacter X4: Điều kiện môi trường thích hợp nhất cho quá trình lên men kombucha gồm: Hàm lượng giống: 10%; pH ban đầu: 4 - 4,5 ; Nhiệt độ thích hợp: 300C; Hàm lượng (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4
bổ sung cho quá trình lên men kombucha lần lượt là 1,5; 2; 1,5 (g/l). Tỉ lệ trà, đường cho 1000 ml dung dịch trà đường là: 15 g trà, 100 g đường saccharose. 1.4. Đã thực hiện lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm.
2. Kiến nghị
2.1. Với kết quả thu được, chúng tôi rất mong muốn chủng vi khuẩn X4
được nhanh chóng áp dụng vào sản xuất kombucha làm phong phú nguồn nước giải khát.
2.2. Nghiên cứu tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, nâng cao các chỉ tiêu cảm quan, hàm lượng dinh dưỡng, loại trừ các yếu tố gây hại, tạo cơ sở cho sản xuất kombucha ở quy mô công nghiệp.
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
Đinh Thị Kim Nhung, Trần Thị Tâm, Hoàng Ánh Sáng. 2014. Tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha từ trà Thái Nguyên. Hội thảo khoa học các trường Đại học Cao Đẳng cụm Sư phạm Trung Bắc. 11/2014.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Đặng Hùng Thắng (1999), Thống kê và ứng dụng, Nxb Giáo dục, tr. 214- 267. [2]. Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi
khuẩn Acetobacter và ứng dụng chúng trong lên men acid acetic theo phương pháp chìm, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội.
[3]. Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nxb Nông nghiệp.
[4]. Lương Đức Phẩm (2006), Nấm men công nghiệp , Nxb Khoa học và Kĩ thuật.
[5]. Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào (2011), Thực hành vi sinh vật học, Nxb Đại học Sư Phạm Hà Nội.