6. Phương pháp nghiên cứu
3.1.1. Tạo sản phẩm kombucha
Nguyên liệu sử dụng là trà Shan tuyết Hà Giang, đường để sản xuất kombucha. Chúng tôi tiến hành đun sôi 1000ml nước sau đó bổ sung trà để trong thời gian 10 phút. Tiếp theo, lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh sạch và phối trộn với đường saccharose (được nấu syrup), để nguội. Sau thời gian khoảng 7 ngày ở 30 oC thu được kombucha (bao gồm dịch trà đường đã lên men và scoby). Sử dụng dịch lên men để phân lập vi khuẩn (scoby được bảo ôn để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo).
Hình 3.1. Sản phẩm kombucha sử dụng để phân lập vi khuẩn 3.1.2. Phân lập vi khuẩn lên men kombucha
3.1.2.1. Bước 1: Nuôi cấy trên MT1 (acide hóa).
Dùng vải sạch lọc lấy dịch lên men, tiến hành phân lập vi khuẩn trên môi trường 1 theo phương pháp của Vinogradski (phương pháp 2.2.1.1.1). Kết quả phân lập được 20 mẫu (ký hiệu là x) lần lượt là X1, X2,…X20.
Môi trường 1 dùng để phân lập vi khuẩn được acid hoá bằng acid acetic cũng góp phần ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật khác. Tuy nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn có thể sống trong môi trường acid.
3.1.2.2. Bước 2: Nhuộm Gram
Với 20 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn được tiến hành nhuộn Gram
(phương pháp 2.2.1.1.2), kết quả cho thấy khi quan sát trên kính hiển vi quang học có 16/20 mẫu vi khuẩn bắt màu hồng với thuốc nhuộm. Điều này chứng tỏ rằng 16 mẫu vi khuẩn đều là Acetobacter (vi khuẩn gram âm).
Hình 3.2. Ảnh mẫu vi khuẩn X4 nhuộm Gram
3.1.2.3. Bước 3: Chọn mẫu có khả năng chuyển hóa ethanol thành acid acetic. Từ 16 mẫu vi khuẩn đã chọn được ở bước 2, chúng tôi tiếp tục tiến hành tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter theo phương pháp của Carr (1968) [24] (phương pháp 2.2.2.2).
Theo Bergey (1992) 16, vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae
gồm 2 chi là Acetobacter và Gluconobacter. Cả hai chi đều có khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic. Acid acetic làm môi trường có chứa Blue Bromophenol 0.04% chuyển từ màu xanh lục sang màu vàng (hình 3.2). Các chủng thuộc chi Acetobacter có khả năng phân giải tiếp tục acid acetic thành CO2 và H2O phục hồi màu xanh của môi trường. Ngược lại, các chủng thuộc chi Gluconobacter không có khả năng phân giải acid acetic nên môi trường vẫn giữ màu vàng.
Hầu hết các mẫu vi khuẩn đã phân lập được đều có khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic (hình 3.3). Khả năng này mạnh yếu khác nhau tuỳ chủng. Hơn nữa các chủng đã phân lập được gồm 2 nhóm có tốc độ sinh trưởng khác nhau (nhóm sinh trưởng nhanh và nhóm sinh trưởng chậm) do đó việc theo dõi khả năng phục hồi màu xanh của môi trường để phân biệt 2 chi Acetobacter và Gluconobacter rất khó khăn, thiếu chính xác. Vì thế, sau bước 3, chúng tôi lựa chọn các chủng làm môi trường chuyển màu vàng và tiếp tục khảo sát khả năng oxy hoá acetate nhằm phân biệt các chủng thuộc 2 chi Acetobacter và Gluconobacter. Kết quả thu được 08 mẫu là: X1, X2, X4, X5, X6, X8. X11, X12.
3.1.2.4. Bước 4: Xác định khả năng tạo thành acid
Với 08 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn được chúng tôi tiếp tục xác định khả năng tạo thành acid bằng cách cấy trên môi trường thạch đĩa (môi trường 1) có bổ sung thêm CaCO3 7g/l (phương pháp 2.2.2.3). Các mẫu vi khuẩn có khả năng sinh acid, acid này phân giải CaCO3 trong môi trường do đó xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng sáng nhỏ trong suốt. Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường có chứa CaCO3 điều đó cho thấy acid đã được tạo thành. Chúng tham gia phản ứng với CaCO3 để chuyển môi trường từ màu trắng sang không màu theo phương trình:
H+ + CaCO3 → Ca2+ + H2O + CO2
Theo Bergey (1992) [16], cả 2 chi Acetobacter và Glucobacter đều có khả năng oxy hoá lactate nhưng chỉ có các vi khuẩn thuộc chi Acetobacter
mới có khả năng oxy hoá acetate. Vì thế, trong môi trường có chứa calcium acetate, các chủng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter có khả năng sử dụng muối acetate làm nguồn cacbon (khả năng oxy hoá acid acetic thành CO2 và H2O giải phóng ATP). Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Hai-Peng Cheng và cs (2002) [25] khi xác định sự có mặt của acid gluconic trong tổng hợp cellulose.
Kết quả thu được 05 mẫu là: X1, X2, X4, X5, X6 có năng tạo thành acid Từ các kết quả trên cho thấy, 5 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn được là các vi khuẩn thuộc giống Acetobacter.
Từ 20 mẫu vi khuẩn phân lập được, đã sơ tuyển và xác định được một số đặc tính sinh hóa được 5 mẫu vi khuẩn thuộc chi (giống) Acetobacter, họ Acetobacteriaceae là: X1, X2, X4, X5, X6 có khả năng lên men kombucha
3.1.3. Nghiên cứu một số đặc tính của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
3.1.3.1. Đặc tính sinh hóa
a. Kiểm tra hoạt tính catalase (phương pháp 2.2.2.1)
Thu được kết quả là cả 5 mẫu vi khuẩn đều có phản ứng catalase dương tính. Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tượng sủi bọt khí (hình 3.3). Chứng tỏ oxy được giải phóng ra, hay nói cách khác dưới tác dụng của enzyme catalase phân giải H2O2 theo phương trình:
2 2 2 2
1 2
C a ta la se
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter
b. Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone (phương pháp 2.2.2.4)
Vi khuẩn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 300C trong vòng 48h. Nhỏ dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone. Kết quả cả 5 mẫu vi khuẩn đều thấy xuất hiện kết tủa Cu2O màu đỏ gạch.
c. Phát hiện khả năng sinh sắc tố nâu
Khi nuôi cấy 5 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn trên môi trường thạch và dịch thể, không thấy hình thành sắc tố nâu, điều đó chứng tỏ những chủng vi khuẩn Acetobacter không hình thành sản phẩm 2,5-dixeto gluconic acid và
- propyonic cho nên dịch nuôi cấy không màu. Kết quả: 5 mẫu vi khuẩn đều không thấy hình thành sắc tố nâu.
d. Khả năng tổng hợp cellulose
Khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường dịch thể ở nhiệt độ 28 - 300C (phương pháp 2.2.2.6) trong vòng 3 - 4 ngày, và thử bằng iot:
Các mẫu X1, X2 có màng mỏng, bắt màu vàng với iot;
Các mẫu X4, X5, X6 có màng khá dày và hơi nhăn, bắt màu xanh với iot (Trong đó mẫu X4, có màu xanh nhạt, mẫu X5, X6 có màu xanh đậm hơn)
e. Sinh trưởng trên môi trường Hoyer (phương pháp 2.2.2.5).
bằng cách lấy dịch nuôi cấy đếm số lượng tế bào vi khuẩn trên buồng đếm cho thấy số lượng 5 mẫu vi khuẩn không tăng. Môi trường Hoyer là môi trường chỉ bao gồm các nhân tố khoáng, 5 mẫu vi khuẩn Acetobacter sử dụng muối (NH4)2SO4 như là nguồn nitơ và rượu êtylic như là nguồn cacbon để duy trì sự tồn tại của tế bào, mà không tăng sinh khối tế bào.
Điều này có thể giải thích như sau: Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung [2] và Nguyễn Thành Đạt [10]5 mẫu Acetobacter này thuộc nhóm vi sinh vật khuyết dưỡng, điều kiện cho chúng sinh trưởng tăng sinh khối khi môi trường nuôi cấy được bổ sung các chất kích thích sinh trưởng (acid folic, các loại vitamin B5, B6, B12...). Kết quả thí nghiệm cho thấy 5 mẫu vi khuẩn không có khả năng sinh trưởng trên môi trường Hoyer là: X1, X2, X4, X5, X6.
3.1.3.2. Đặc tính sinh học
a. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa
Vi khuẩn Acetobacter khi nuôi cấy trên môi trường đặc sau 3 ngày sẽ hình thành các khuẩn lạc đặc trưng, khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng tròn, màu trắng đục, đa số bề mặt khuẩn lạc trơn bóng, cấu trúc khuẩn lạc đồng nhất, kích thước trung bình của khuẩn lạc 1,5 – 2 mm.
Hình 3.5. Khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter X4 trên môi trường thạch đĩa
Hình 3.6. Mẫu vi khuẩn Acetobacter X4 trên môi trường thạch nghiêng
b. Hình thái và tế bào học
Từ các chủng vi khuẩn thu được, soi trên kính hiển điện tử quét SEM- S4800 với độ phóng đại 10000 lần. Kết quả như hình 3.7 (Quy trình làm tiêu bản và chụp ảnh do kỹ thuật viên Viện vệ sinh Dịch tễ trung ương thực hiện)
X1 X2
X5 X6 X4
Hình 3.7. Hình thái của chủng Vi khuẩn X4 và 4 chủng Vi khuẩn X1, X2, X5, và X6 trên kính hiển vi điện tử có độ phóng đại 10.000 lần
Kết quả cho thấy 5 chủng Acetobacter đã tuyển có hình dạng hình que ngắn đồng nhất. Trong đó Acetobacter X4 có hình que rõ ràng, đầu tròn đều với kích thước trung bình dài khoảng 650 – 750 nm.
3.1.4. Phân loại các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn
Trên cơ sở các nghiên cứu về đặc tính sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn
Bảng 3.1. Đặc điểm sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter
STT
Đặc điểm Hiện tượng
Kết quả X1, X2 X4, X5 X6
1 Oxy hoá ethanol thành acid acetic
Chuyển hoá môi trường chứa Brom phenol Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng
+ + +
2 Hoạt tính catalase Hiện tượng sủi bọt khí + + + 3 Sinh trưởng trên
môi trường Hoyer
Sinh khối không phát triển
– – –
4
Chuyển hoá glucose thành acid
Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trường chứa CaCO3
+ + +
5 Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu
Không hình thành sắc tố
nâu – – –
6 Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose
Váng vi khuẩn xuất hiện
màu lam – + +
7
Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyacetone
Tạo kết tủa đỏ gạch trong
dịch sau lên men + + +
8 Nhuộm Gram Bắt màu hồng Gram
âm Gram âm Gram âm Chú thích: +: Kết quả dương tính. –: Kết quả âm tính.
Dựa theo các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn acetic của Bergeys (1914), Yamada và cs (2000) [51],Boesch và cs (1998) [17],Bergey (1992) [16], căn cứ vào các kết quả khảo sát các một số đặc điểm sinh học của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter có thể khẳng định đây là các mẫu vi khuẩn thuộc họ Acetobacteraceae.
Căn cứ vào đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa, theo Bergeys (1914), Nguyễn Lân Dũng (1976) [8]; Căn cứ kết quả của Balentine DA (1997) [15] phân lập được Acetobacter xylinum, Liu CH, Hsu WH, Lee FL, Liao CC (1996) [38] phân lập được Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus trong kombucha có thể xếp 5 chủng vi khuẩn đã tuyển chọn như sau: Acetobacter aceti: X1, X2; Acetobacter xylinum: X4; Acetobacter pasteurianus: X5, X6. Tuy nhiên, trong giới hạn đề tài này không tập trung vào nghiên cứu phân loại nên việc phân loại cần được nghiên cứu sâu hơn.
Như vậy, từ 20 mẫu vi khuẩn ban đầu phân lập được, đã tuyển chọn sơ bộ được 5 vi khuẩn Acetobacter
3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha
3.2.1. Xác định hàm lượng acid tổng số được tạo ra của mỗi chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn
Trong quá trình lên men kombucha không chỉ có sản phẩm acid acetic do vi khuẩn Acetobacter tạo ra mà còn có nhiều sản phẩm acid khác. Vì vậy khi nghiên cứu quá trình lên men kombucha tôi cần xác định hàm lượng acid tổng số tạo ra bằng phương pháp nuôi cấy 5 chủng vi khuẩn đã tuyển chọn trên môi trường 3, ở nhiệt độ 300C sau 7 ngày lên men (lặp lại 3 lần một mẫu). Kết quả được thống kê theo bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 5 chủng vi khuẩn Acetocbacter
STT Chủng M±m δ(%) Cv(%) 1 X1 25,01±0,027 0,046 0,128 2 X2 29,12±0,012 0,021 0,072 3 X4 33,00±0,040 0,069 0,209 4 X5 32,97±0,036 0,063 0,191 5 X6 30,01±0,021 0,037 0,123
Qua bảng 3.2 nhận thấy 5 mẫu vi khuẩn Acetobacter thí nghiệm đều có khả năng oxy hóa ethanol tạo thành acid acetic. Hàm lượng acid tổng số có trong dịch lên men từ 25,01 đến 33,00 (mg/l). Các mẫu vi khuẩn khác nhau tạo ra hàm lượng acid acetic khác nhau, trong đó thấp nhất là mẫu vi khuẩn X1, cao nhất là mẫu X4. Với mục đích tuyển chọn được chủng vi khuẩn lên men kombucha có chất lượng tốt nhất, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy, nhân giống 5 mẫu vi khuẩn để bổ sung vào môi trường lên men tạo sản phẩm kombucha và tiến hành đánh giá chất lượng sản phẩm thu bằng phương pháp cảm quan.
3.2.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha
Sau 7 ngày lên men chúng tôi tiến hành đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha tạo ra từ 5 chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn được bằng phương pháp cảm quan dựa trên các tiêu chí đưa ra ở bảng 2.1, 2.2, 2.3
(phương pháp 2.2.3) kết quả thu được như sau:
Bảng 3.3. Khả năng tạo độ trong, hương thơm và mùi vị đặc trưng của kombucha từ 5 chủng vi khuẩn Acetobacter
STT Chỉ tiêu đánh giá Chủng X1 X2 X4 X5 X6 1 Độ trong và màu sắc 2,8 3,4 3,6 3,2 3,4 2 Mùi 4,2 3,6 5,6 4,9 3,6 3 Vị 6,0 6,8 9,4 6,2 6,8 4 Tổng điểm 13,0 13,8 18,6 14,3 13,8
Kết quả cho thấy 5 mẫu vi khuẩn Acetobacter đều tạo ra sản phẩm kombucha có màu vàng tươi, mùi vị đặc trưng tùy theo các mức độ khác nhau. Có thể phân chia các mẫu thành 3 loại sau:
Loại 1: Sản phẩm có chất lượng tốt là sản phẩm có mùi vị đặc trưng, màu vàng tươi, hương thơm mát dịu gồm chủng X4.
Loại 2: Sản phẩm có chất lượng khá là sản phẩm thiếu một trong các đặc điểm về mùi vị hoặc màu sắc hoặc hương thơm đặc trưng: gồm chủng X5.
Loại 3: Sản phẩm có chất lượng trung bình và kém là sản phẩm không có hoặc thiếu từ lớn hơn 1 các đặc điểm về mùi vị hoặc màu sắc hoặc hương thơm đặc trưng: gồm các chủng: X1, X2, X6.
Từ kết quả ở bảng 3.2 kết hợp với bảng 3.3 nhận thấy chủng vi khuẩn
Acetobacter X4 và X5 có khả năng sinh acid cao. Trong đó Acetobacter X4 tạo ra sản phẩm kombucha tạo ra thơm, ngon, đặc trưng nên tôi quyết định tuyển chọn chủng này làm đối tượng nghiên cứu tiếp theo.
Kết qủa các chủng Acetobacter đã tuyển chọn để lên men kombucha tạo ra hàm lượng acid và tạo ra sản phẩm có chất lượng khác nhau. Trong đó, chủng Acetobacter X4 tạo ra hàm lượng acid cao nhất, lên men tạo sản phẩm kombucha thơm, ngon, đặc trưng.
3.2.3. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter X4
Động thái sinh trưởng của một chủng vi khuẩn phản ánh khả năng sinh trưởng và sinh sản của chúng trong thời gian nhất định. Để nghiên cứu động thái sinh trưởng của Acetobacter X4 chúng tôi tiến hành nuôi cấy
Acetobacter X4 trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau những khoảng thời gian định sẵn ở các thời điểm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ dịch nuôi cấy được lấy ra 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa. Sau sau 3 ngày nuôi ở 300C đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.8.
Bảng 3.4. Quá trình sinh trưởng của chủng Acetobacter X4
Thời gian ( h) Số lượng tế bào (x106) δ
0 2,0±0,006 0,10 12 16,9±1,295 0,92 24 48,6±0,682 1,18 36 73,5±0,578 1,00 48 115,1±2,514 4,35 60 125,7±2,405 4,16 72 127,3±0,017 0,03 84 103,1±0,035 0,06 96 90,5±0,099 0,17
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter X4
Từ kết quả nghiên cứu ở bảng 3.4 và hình 3.8 ta thấy:
Trong 12 giờ đầu pha lag, số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng đều