6. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Phương pháp hóa sinh
2.2.2.1. Xác định đường khử
* Nguyên tắc
Với một lượng nhất định ferrycyanure K3Fe(CN)6 phản ứng với đường khử, có mặt dung dịch NaOH, sản phẩm thu được là ferrycyanure của đường khử. Dựa vào lượng ferrycyanure đã dùng, có thể suy ra lượng đường khử có
mặt trong dung dịch cần xác định. Việc chuẩn độ được tiến hành trong môi trường kiềm NaOH, khi đun nóng với chỉ thị methylen blue.
Phương trình phản ứng:
CH2OH – (CHOH)4– CHO + K3Fe(CN)6 + 2NaOH CH2OH – (CHOH)4 – COONa + NaK3Fe(CN)6 + H2O.
Phương pháp này đơn giản hơn phương pháp dùng dung dịch kiềm của sulfat đồng do không tạo kết tủa và phản ứng kết thúc rõ ràng. Kết quả tính toán không phụ thuộc vào phương trình lý thuyết, mà chỉ dựa vào công thức thực nghiệm.
* Dụng cụ – hóa chất
Dụng cụ: Bếp điện, kẹp, lưới amiang, nồi cách thủy, phễu lọc, ống đong, bình định mức 100ml, becher, erlen, burette, pipette.
Hóa chất: K3Fe(CN)6 1%; đường glucose 0,5%; NaOH 5%; 2,5N; HCl 5%; methylen blue; methyl red, phenolphtalein.
* Cách tiến hành
Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm: Lấy 50ml dung dịch cần xác định cho vào bình định mức, đun cách thủy ở 75 – 800C trong 35 – 40 phút. Để yên trong 10 phút, thêm nước cất tới vạch định mức 100ml, lọc qua giấy lọc vào cốc hoặc bình khô. Nước đã được lọc được dùng làm đường khử. Để xác định đường tổng, lấy vào bình định mức 100ml chính xác 50ml dung dịch xác định đường khử. Thêm 20ml dung dịch HCl 5%, đun cách thủy hỗn hợp trong 30 – 45phút. Làm nguội nhanh, trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch NaOH 2,5N hoặc dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 6,5 – 7 với chỉ thị phenolphtalein (không màu – hồng) hay với chỉ thị methyl red (đỏ – vàng). Định mức tới vạch định mức 100ml.
Chú ý: đối với nguyên liệu giàu acid hữu cơ, trong quá trình đun khi chiết đường, saccharose có thể bị thủy phân một phần do sự có mặt của lượng
acid hữu cơ. Do đó, khi cần xác định riêng đường tổng và đường saccharose, trước khi đun cách thuỷ hỗn hợp phải trung hòa acid hữu cơ bằng dung dịch NaOH 5% hay Na2CO3 bão hòa tới pH 6,5 – 7.
* Tiến hành chuẩn độ
Cho vào bình nón 10ml dung dịch K3Fe(CN)6 1% và 2,5ml dung dịch NaOH 2,5N, thêm vào 1giọt methylen blue. Đun sôi và chuẩn độ ngay trên bếp bằng dung dịch đường khử hoặc đường tổng từ burette, cho từng giọt một, lắc mạnh. Dung dịch ban đầu có màu vàng chanh của ferrycyanure. Điểm dừng chuẩn độ khi xác định màu vàng chanh biến mất, dung dịch trong suốt không màu trong khoảng 30 giây rồi chuyển sang màu vàng rơm rất nhạt của ferrocyanure. Trong trường hợp khó nhận biết điểm chuyển màu, có thể kiểm tra điểm kết thúc bằng cách nhỏ một giọt chỉ thị methylen blue và một giọt đường thừa đầu tiên sẽ làm mất màu xanh cho biết phản ứng đã kết thúc. Kết quả chuẩn độ lần đầu tiên chỉ có giá trị tham khảo cho lần chuẩn độ thứ hai. Lần này, sau khi đun sôi dung dịch ferrycyanure, xả nhanh lượng đường (theo kết quả lần chuẩn độ trước), chỉ để lại khoảng dưới 1ml để chuẩn độ tiếp tìm chính xác điểm cuối. Kết quả tính toán chỉ sử dụng từ lần chuẩn độ thứ hai trở đi. Thí nghiệm tương tự đối với dung dịch đường chuẩn là dung dịch glucose 0,5%.
* Tính kết quả
Trong thí nghiệm, Vk ml dung dịch mẫu và Vg ml dung dịch glucose 0,5% cùng phản ứng với một dung dịch ferrycyanure ở một nồng độ xác định. Như vậy, Vk ml dung dịch mẫu tương ứng với Vg ml dung dịch glucose 0,5% có (0,5xVg)/100g glucose.
Lượng đường khử: được tính bằng công thức:
Trong đó: Xk: lượng đường khử (g/100g hay g/100ml).
Vg: thể tích dung dịch glucose 0,5% cho chuẩn độ (ml). Vk: thể tích dung dịch đường khử cho chuẩn độ (ml). V: thể tích bình định mức (ml).
m: lượng mẫu thí nghiệm (g hoặc ml).
Hàm lượng đường tổng: được tính bằng công thức: Xt=(0,5*Vg*V1*V2*100): (100*Vt*m)
Trong đó: Xt: hàm lượng đưởng tổng (%).
Vg: thể tích dung dịch glucose 0,5% cho chuẩn độ (ml). Vt: thể tích dung dịch đường tổng cho chuẩn độ (ml).
V: thể tích bình định mức của dung dịch xác định đường khử (ml). V2: thể tích bình định mức của dung dịch xác định đường tổng (ml). m: lượng mẫu cân thí nghiệm (g hoặc ml).
2.2.2.2. Xác định độ cồn
* Nguyên tắc
Độ cồn là số ml rượu etylic nguyên chất trong 100ml rượu thử, ở nhiệt độ đúng 150C. Nếu rượu có tinh cặn ít hơn 0,5g/lít độ cồn có thể đo thẳng độ rượu bằng rượu kế. Nếu rượu có tinh cặn lớn hơn 0,5g/lít, phải cất lấy dung dịch cồn và đo độ cồn trên dịch cất. Độ cồn được quy định ở nhiệt độ 150C, nếu đo ở nhiệt độ khác, tra bảng quy về độ cồn ở 150C
* Dụng cụ
Bộ chưng cất rượu: bếp điện, bình cầu chưng cất rượu, ống sinh hàn bóng, bình định mức 250ml và nhiệt kế. Ống đong hình trụ thủy tinh. Rượu kế có vạch đo rượu và nhiệt độ.
* Cách tiến hành
Lấy chính xác 250ml rượu cần thử, tốt nhất là ở 150C, nếu không, phải đo nhiệt độ và ghi chép để sau này các thao tác đều làm ở cùng một nhiệt độ. Cho vào bình cầu của dụng cụ chưng cất và cất lấy ít nhất là khoảng 200ml. chú ý đừng để cho cồn bay hơi ra bị mất, bằng cách cho đầu ống sinh hàn
cắm vào trong 10ml nước cất và ống sinh hàn dài được làm lạnh bằng nước lạnh không quá 200 C. Để cho dịch cất trở lại nhiệt độ bằng nhiệt độ của rượu lúc đầu. Cho thêm nước cất cùng ở nhiệt độ ấy vào đủ 250ml. Cho dịch cất vào một ống đong không có mỏ, đường kính to gấp 2 đường kính chỗ to nhất của rượu kế. Thả rượu kế vào, đọc độ cồn và nhiệt độ. Chú ý đừng để rượu kế sát vào thành ống đong. Tra bảng để đưa độ cồn thật về độ cồn chính xác ở 150C [2], [12], [57].
2.2.2.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng khoáng đến quá trình lên men kombucha dưỡng khoáng đến quá trình lên men kombucha
* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường
Tiến hành thí nghiệm với các hàm lượng đường khác nhau ở môi trường lên men (MT3), các chỉ tiêu khác vẫn giữ nguyên [9] [38]. Theo dõi quá trình lên men và phân tích chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng CO2 thoát ra (g/1000 ml ), hàm lượng cồn và hàm lượng đường sót trong dịch lên men sau 168h, sau đó chọn ra môi trường lên men có hàm lượng đường tốt nhất để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ
Tiến hành thí nghiệm với các hàm lượng nitơ khác nhau ở môi trường lên men (MT3), các chỉ tiêu khác vẫn giữ nguyên. Nguồn nitơ sử dụng (NH4)2SO4 , nguồn nitơ này được chọn ở mức 0.4-1% [9] [18]. Theo dõi quá trình lên men và phân tích chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng cồn và hàm lượng đường sót trong dịch lên men sau 168h. Sau đó lựa chọn môi trường có hàm lượng (NH4)2SO4 cho lên men kombucha tốt nhất và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn magie
Nguồn magie tôi sử dụng là MgSO4.7H2O, giống như ở môi trường cơ bản (MT3) nhưng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hàm
lượng của MgSO4.7H2O đến quá trình lên men kombucha. Tôi tiến hành thay đổi hàm lượng MgSO4.7H2O từ 0,03 - 0,09 % [9]. Các yếu tố còn lại của môi trường giữ nguyên. Theo dõi quá trình lên men và phân tích chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng cồn và hàm lượng đường sót trong dịch lên men sau 168h. Sau đó lựa chọn môi trường có hàm lượng MgSO4.7H2O cho lên men kombucha tốt nhất và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2.4. Phương pháp xác định khả năng lên men các loại đường
Khả năng lên men các loại đường là một trong những chỉ tiêu quan trọng được sử dụng để phân loại nấm men. Để xác định khả năng lên men các loại đường, chúng tôi sử dụng môi trường nước chiết giá đậu. Cách làm môi trường nước chiết giá đậu: cân 200g giá đậu thêm 1000ml nước. Đun sôi 30 phút. Lọc lấy dịch trong rồi thêm nước cho đủ 1000ml.
Cách tiến hành: Sử dụng ống nghiệm có kích thước 180x16mm. Đặt ngược một ống Durham (50x6mm) (miệng của ống Durham chạm đáy ống nghiệm). Phân 10-15ml môi trường cơ sở và chứa từng nguồn đường khác nhau, ở nồng độ 50mM (tương đương 1%) riêng với rafinoza 100mM (tương đương 2%). Riêng ống kiểm tra là không có một nguồn đường nào, ống đối chứng là D-glucoza. Các ống nghiệm chứa môi trường được khử trùng sau đó cấy vào 100μl (khoảng 2 giọt) dung dịch huyền phù nấm men có mật độ 107 tế bào/ml, để 250C sau một tuần. Quan sát việc tạo CO2 ở đáy ống Durham để biết nấm men có hay không có khả năng lên men từng nguồn đường.
2.2.2.5. Phương pháp xác định khả năng hình thành hợp chất loại tinh bột
Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 1100C (trong 15 phút) sau đó phân phối vào các hộp Petri. Trong mỗi hộp Petri đã cho sẵn một giọt hỗn dịch vitamin hoặc dịch tự phân nấm men vô trùng. Cấy nấm men và nuôi cấy 250C trong 1-2
tuần. Sau đó dùng thuốc thử Lugol để kiểm tra xem có hình thành hợp chất loại tinh bột hay không. Nếu có thì vết cấy sẽ xuất hiện màu xanh [3].
2.2.2.6. Phương pháp nghiên cứu sự sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường cao đường cao
Một số nấm men có khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ đường cao so với các chủng khác. Thí nghiệm được tiến hành như sau: ống thạch nghiêng được chuẩn bị với cao nấm men và thạch có lượng đường glucose đạt 20%. Sau đó giống nấm men được cấy vào và kiểm tra sự sinh trưởng ở 250C trong 4 tuần. Chú ý tránh cho môi trường bị khô bằng cách bọc bằng giấy nến [3].
2.2.3. Phương pháp cảm quan
Sử dụng cơ quan cảm giác của con người để tìm hiểu mô tả và định lượng các tính chất cảm quan vốn có của thực phẩm. Cảm quan của kombucha được đánh giá trên một số chỉ tiêu theo TCVN 3215 – 79 [14], [53].
Bảng 2.1. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha
Tên chỉ tiêu
Điểm chưa có
trọng lượng Yêu cầu
1 2 3
Độ trong và màu
sắc
5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, mầu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm
4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, mầu đặc trưng cho sản phẩm.
3 Chất lỏng trong, có tương đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm.
2 Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô trầm trọng, màu khác nhiều so với màu đặc trưng của sản phẩm.
1 Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm trọng, thô, màu không đặc trưng cho sản phẩm.
0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng
Mùi
5 Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm.
4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trưng cho sản phẩm nhưng hơi khó nhận thấy.
3 Hơi nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trưng cho sản phẩm 2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm 1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho sản phẩm 0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng.
Vị
5 Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm 4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, hậu vừa phải, đặc trưng cho sản phẩm
bình thường.
3 Chưa hòa hợp, hơi gắt và xốc, hậu yếu, ít đặc trưng cho sản phẩm. 2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm
Bảng 2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu Số thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng 1 2 3 Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2,0 Tổng cộng 4,0
Bảng 2.3 . Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm
Số thứ tự Mức chất lượng Số điểm chung
Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chưa có trọng lượng của hội đồng cảm quan 1 Loại tốt 18,6 – 20,0 Mùi : 4,8 Vị : 4,8 2 Loại khá 15,2 – 18,5 Mùi : 3,8 Vị : 3,8 3 Loại trung bình 11,2 – 15,1 Mỗi chỉ tiêu : 2,8 4 Loại kém 7,2 – 11,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,8 5 Loại rất
kém 4,0 – 7,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,0 6 Loại hỏng 0 – 3,9 Mỗi chỉ tiêu nhỏ hơn 1,0
2.2.4. Xử lí số liệu bằng thống kê toán học
Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phương pháp như:
Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: 1 1 n i i X X n
Trong đó: X: trung bình tổng thể
Xi : giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n n: số lần thí nghiệm
Trung bình bình phương các sai lệch:
1 ) ( 1 2 n X X n i i Trong đó: δ: độ lệch chuẩn
Xi : giá trị của mỗi kết quả thí nghiệm từ lần 1 đến lần thứ n X: trung bình tổng thể
Sai số đại diện của trung bình cộng: m n Hệ số biến thiên (Cv%): Cv%= X .100%
Trong đó: Cv: hệ số biến thiên của trung bình tổng thể δ: độ lệch chuẩn
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập và sơ bộ định loại chủng nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang
3.1.1. Phân lập chủng nấm men có khả năng lên men kombucha
Nguyên liệu sử dụng là trà Shan tuyết Hà Giang và đường để sản xuất kombucha. Trước hết cần đun sôi 1000ml nước, bổ sung 20g trà để trong thời gian 5 phút. Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh sạch, thêm 125g đường khuấy đều, để nguội. Sử dụng acid acetic điều chỉnh pH: 4,5. Sau 7 ngày ở 300C [43] ta thu được kombucha, bao gồm dịch trà đường lên men và miếng thạch nổi lên trên bề mặt. Dùng vải sạch lọc lấy dịch, tiến hành phân lập nấm men.
Môi trường phân lập là môi trường HanXen được thanh trùng theo phương pháp Pasteur sau đó được phân vào các đĩa petri đã vô trùng. Dịch kombucha được pha loãng từ 10-1 – 10-10, dùng pipet lấy 1 ml dịch huyền phù ở các nồng độ pha loãng khác nhau, mở hé đĩa petri nhỏ vào đó từ 1 – 2 giọt, dùng bàn trang vô trùng nhẹ nhàng dàn đều thể tích đó khắp bề mặt môi trường. Nuôi trong tủ ấm 280C trong thời gian khoảng thời gian 2 - 3 ngày. */ Kết quả phân lập cho thấy tỉ lệ nấm men có trong kombucha khá phong phú:
Ở nồng độ pha loãng 10-3 phân lập được 6 chủng (kí hiệu NM3n) Ở nồng độ pha loãng 10-4 phân lập được 7 chủng (kí hiệu NM4n) Ở nồng độ pha loãng 10-5 phân lập được 7 chủng (kí hiệu NM5n) Ở nồng độ pha loãng 10-6 phân lập được 5 chủng (kí hiệu NM6n)
Ở các nồng độ 10-7;10-8; 10-9 số lượng khuẩn lạc ít nên lựa chọn không đảm bảo tính khách quan. Ở nồng độ cao 10-1; 10-2 số lượng khuẩn lạc quá lớn không chọn được chủng.
Từ các mẫu trên, chúng tôi tiến hành tuyển chọn được 5 mẫu khuẩn lạc có đường kính lớn nhất, trơn, nhẵn, bóng được kí hiệu M1, M2, M3, M4, M5 làm đối tượng nghiên cứu.
3.1.2. Định loại sơ bộ chủng nấm men có khả năng lên men kombucha
Do điều kiện kinh phí hạn chế, nên chúng tôi chỉ định tên các chủng nấm men dựa vào một số chỉ tiêu trong phần phương pháp nghiên cứu 2.2.1.1:
3.1.2.1. Hình thái tế bào học và hình thức sinh sản của các chủng nấm men
Để quan sát hình dạng tế bào và hình thức sinh sản của 5 chủng nấm men chúng tôi tiến hành làm tiêu bản sau đó soi trên kính hiển vi Olympus CX31 với độ phóng đại 1000 lần. Kết quả cho thấy tế bào nấm men của 5 chủng có hình ovan, hình elip. Các chủng M1, M2, M4: có hình thức sinh sản nảy chồi. M3, M5 có hình thức sinh sản phân cắt (Hình 3.1 và 3.2.)