Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà thái nguyên (LV01023)

Khi các vi sinh vật được nuôi trong một môi trường trà dược, cung cấp đủ nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dưỡng căn bản khác, chúng phát triển và biến đổi đường thàn

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS TS Đinh Thị Kim Nhung - người đã hướng dẫn tận tình chỉ bảo, người đã cung cấp cho tôi nhiều kiến thức quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành nghiên cứu

Xin gửi lời cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, cô giáo trong tổ bộ môn Vi sinh khoa Sinh Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài

Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh, các anh chị trong phòng Vi sinh khoa Sinh, các em sinh viên K35, K36 đang làm đề tài tại phòng Vi sinh khoa Sinh

và Thư viện Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành đề tài này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, 12 tháng 7 năm 2013

Tác giả luận văn

Lê Thị Huệ

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật Đây là kết quả của riêng tôi Tất cả các số liệu đều đƣợc thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả bất kỳ của tác giả nào đã công bố Trong đề tài tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho luận văn của mình

Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tác giả luận văn

Lê Thị Huệ

2 ATP : Adenozin triphotphat

3 cs : cộng sự

4 CFU : Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

5 FAD : Flavin adenine dinucleotide

6 GlcUA : Glucuronic acid

7 MT : Môi trường

8 NADP : Nicotiamide adenine

9 PABA : para – amino benzoic acid

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

5 Phương pháp nghiên cứu 2

5.1 Phương pháp vi sinh 2

5.2 Phương pháp hóa sinh 2

5.3 Phương pháp cảm quan 3

5.4 Phương pháp toán học 3

6 Đóng góp của đề tài 3

NỘI DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về kombucha 4

1.1.1 Sơ lược về kombucha 4

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo 8

1.1.3 Hệ sinh vật trong kombucha 9

1.1.3.1 Vi khuẩn acetic 9

1.1.3.2 Nấm men 11

1.1.3.3 Vi khuẩn lactic 12

1.1.4 Cơ sở khoa học của quá trình lên men 12

1.1.5 Thành phần hóa học và công dụng của kombucha 16

1.1.5.1 Thành phần hóa học của kombucha 16

1.1.5.2 Công dụng của kombucha 17

1.1.5.3 Một số lưu ý khi sử dụng 19

1.2 Một số đặc điểm về trà Thái Nguyên 19

1.2.1 Phương pháp sản xuất trà xanh 20

1.2.3 Đặc điểm của trà xanh Thái Nguyên 20

1.3.2 Ở Việt Nam 22

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 25

2.1.1 Đối tượng 25

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 25

2.1.3.1 Hóa chất 25

2.1.3.2 Thiết bị 25

2.1.3 Môi trường 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phương pháp vi sinh 26

2.2.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram 26

2.2.1.2 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đếm 28

2.2.1.3 Bảo quản chủng giống 29

29

2.2.2 Phương pháp hoá sinh 29

2.2.2.1 Phát hiện hoạt tính catalase 29

2.2.2.2 Phát hiện khả năng oxy hoá rượu êtylic thành acid acetic 29

2.2.2.3 Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic 30

2.2.2.4 Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone 30

2.2.2.5 Sinh trưởng trên môi trường Hoyer 31

2.2.2.6 Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose 31

31

2.2.3 Phương pháp cảm quan 32

2.2.4 33

ăng lên men kombucha 39

3.2.1 Xác định hàm lượng của acid tổng số được tạo ra của mỗi chủng vi khuẩn Acetobacter 39

3.2.2 Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha 40

3.2.3 Phân loại các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn để lên men kombucha 42

3.2.3.1 Hình thái và tế bào học 42

3.2.3.2 Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa 42

3.2.3.3 Đặc tính sinh hóa 43

3.2.4 Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter A2 và A 15 46

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha 48

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình lên men kombucha 48

3.3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của (NH 2 ) 2 SO 4 48

3.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của MgSO4.7H2O 49

3.3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của KH 2 PO 4 50

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha 51

3.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men 51

3.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống bổ sung ban đầu 53 3.3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của độ pH ban đầu 55

3.3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 56

3.4 Xây dựng quy trình lên men kombucha 57

3.4.1 Khảo sát về thiết bị lên men 57

3.4.2 Quy trình sản lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm 59

3.4.3 Kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm 64

1 Kết luận 66

2 Kiến nghị 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

1.2 Kombucha bị nhiễm nấm mốc 6

1.3 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất trong trà kombucha 6

1.4 “ Con nấm” (SCOBY) 8

1.5 Kombucha được lên men trong các bình chứa có kích thước và hình dạng khác nhau 9

1.6 Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men 13

1.7 Quá trình oxi hóa rượu thành acid acetic 15

1.8 Trà Thái Nguyên 20

3.1 Ảnh mẫu vi khuẩn A15 nhuộm Gram 35

3.2 Chuyển hoá ethanol thành acid acetic 35

3.3 Khả năng oxy hoá acetate 37

3.4 Hoạt tính catalase của Acetobacter 37

3.5 Kết quả thử hoạt tính cellulose của vi khuẩn Acetobacter nhóm 2 39 3.6 Hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên kính hiển vi quang học (x1000 lần) 42

3.7 Khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên môi trường thạch đĩa 43

3.8 Mẫu vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên môi trường thạch nghiêng 43

3.9 Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter A2 và A15 47

3.10 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15 48

3.11 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của MgSO4 7H2O đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15 49

3.12 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của KH2PO4 đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15 50 3.13 Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A2 bổ sung hàm lượng

3.15 Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A15 với giá trị pH ban đầu

là 4 và 5 55

3.16 Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A2 ở nhiệt độ 200C và 300C 57

3.17 Lên men kombucha trong cốc inox thường 150ml, sau quá trình lên men phần đáy cốc chứa môi trường bị ăn mòn bởi acid acetic 58

3.18 Lên men kombucha trong cốc thủy tinh 250ml 58

3.19 Lên men kombucha trong hộp nhựa 500ml 58

3.27 Quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm 61

3.28 Kết quả thử nghiệm đánh giá sản phẩm kombucha 65

BẢNG 1.1 Thành phần hóa học trà kombucha 17

2.1 Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha 32

2.2 Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu 33

2.3 Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 33

3.1 Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 9 chủng vi khuẩn Acetocbacter 40

3.2 Khả năng tạo độ trong, hương thơm và mùi vị đặc trưng của kombucha từ 9 chủng vi khuẩn Acetobacter 41

3.3 Đặc điểm sinh hóa của 9 chủng vi khuẩn Acetobacter……….…43

3.4 Quá trình sinh trưởng của chủng Acetobacter A15 và A2 (x106 tế bào) 46

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15 52

3.6 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15 54

3.7 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15 55

vật liệu inox, thủy tinh, nhựa 59 3.10 Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha bằng phương pháp cảm quan 64

", người Pháp gọi là Champignon De Longuc Vie

thủy hoài sâm, Nga gọi là nấm trà

Kombucha là một cấu trúc có dạng như thạch màu xám, thật ra là một hỗn hợp phức tạp cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn

Khi các vi sinh vật được nuôi trong một môi trường trà dược, cung cấp

đủ nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dưỡng căn bản khác, chúng phát triển và biến đổi đường thành acid lactic, acid gluconic đồng thời sản xuất ra một lượng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi thành acid acetic (tối đa khoảng 3%) tạo cho trà một vị ngọt và có mùi chua của rượu táo lên men Thành phẩm „trà” sau cùng chứa trung bình từ 0.5 đến 1% alcohol, một lượng nhỏ lactic acid, malic acid, malonic acid, citric acid và oxalic acid Lượng các vitamin B trong thành phẩm khá cao, ngoài ra còn có một lượng nhỏ vitamin C

nhập khẩu được bán tại các cửa hàng nhưng chưa có công trình nghiên cứu hoàn chỉnh và đầy đủ về sản phẩm này, đặc biệt chưa có nghiên cứu nào về các chủng vi khuẩn lên men kombucha Chính vì vậy tôi quyết

Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng của một số chủng vi khuẩn lên men kombucha Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men và xây dựng quy trình lên men kombucha

3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha 3.2 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha 3.3 Xây dựng quy trình lên men kombucha

Chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1

Phương pháp phân lập vi khuẩn và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram; phương pháp đếm số lượng tế bào vi sinh vật; phương pháp bảo quản chủng giống

5

Phát hiện hoạt tính catalase; phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic; phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone; sinh trưởng trên môi trường Hoyer;

kombucha từ trà Thái Nguyên; xây dựng quy trình lên men kombucha quy mô

phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về kombucha

1.1.1 Sơ lược về kombucha

Cùng với xu hướng tiêu dùng mới, khi vấn đề sức khỏe người tiêu dùng được đặt lên hàng đầu, thì các loại thực phẩm gần gũi với thiên nhiên ngày càng được ưa chuộng Thị trường đồ uống không ngừng gia tăng sản lượng và được đa dạng hóa sản phẩm, trong đó dòng sản phẩm lên men đang dần chiếm

ưu thế Đối với người Việt Nam, trà đã trở nên khá quen thuộc và gần gũi Uống trà không những là thói quen trong đời sống, mà đã trở thành một nhã thú hưởng thụ tinh thần Uống trà không chỉ để giải khát mà còn có khả năng phòng trị bệnh tật, nâng cao sức khoẻ, kéo dài tuổi thọ cho con người Trên thị trường đã có nhiều loại thức uống được chế biến từ trà nhưng sản phẩm trà lên men thì hầu như còn rất mới mẻ đối với thị trường tiêu dùng Việt Nam Trà lên men kombucha là loại đồ uống thông dụng và phổ biến ở các nước Đông Âu và các nước khác, nó được biết đến như một loại thực phẩm có lợi cho sức khỏe Ở nước ta, loại trà lên men này đã được sản xuất nhỏ lẻ trong một số hộ gia đình Sản phẩm trà lên men kombucha được sử dụng ngay sau khi lên men, hoặc bảo quản lạnh trước khi dùng Điều này gây hạn chế thời gian, điều kiện bảo quản và khả năng tiêu thụ sản phẩm

Hiểu biết hóa sinh đầy đủ của các thành phần chất chuyển hóa kombucha vẫn còn bí ẩn và chưa được làm sáng tỏ[39] Các nghiên cứu về vi sinh vật cộng sinh trong kombucha cho thấy: kombucha thực sự là một tập hợp cộng sinh của nấm men và vi khuẩn acid acetic [27], [33], [44] Các vi

khuẩn acetic chính được tìm thấy trong các loại nấm trà: Acetobacter xylinum [15], Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus [38], Gluconobacter

oxydans [24], [35] Nhiều hợp chất quan trọng đối với việc bảo vệ sức khỏe

con người, được sản xuất trong quá trình lên men của kombucha cộng sinh: một loạt các axit hữu cơ như glucuronic, gluconic, lactic, acetic, axit succinic, butyric, axit malic và usnic; vitamin, đặc biệt là nhóm B và vitamin C, axit amin tự do và các enzyme hoạt động khác nhau GlcUA được coi là một trong những hợp chất quan trọng được tìm thấy trong kombucha giải khát do tác động giải độc của nó và ảnh hưởng tới sức khỏe [29], [37], nó ngăn ngừa bệnh tim mạch, các bệnh thoái hóa thần kinh mãn tính thoái hóa và ung thư [22], [44]

Quá trình lên men được bắt đầu bằng con nấm giống hay chính là sự lên men cộng sinh của vi khuẩn và nấm men, “con nấm” này được các nhà khoa học phân loại như là biofilm (màng sinh học – là một tổ hợp vi sinh vật trong đó các tế bào kết dính lại với nhau thành một cấu trúc trên bề mặt và sinh ra các ngoại cao phân tử EPS – Extracellular Polymeric substance) Con nấm có hình dạng giống bình chứa nó, bề dày thì phụ thuộc vào thời gian nuôi cấy và độ pH của môi trường

Nồng độ acid và rượu trong kombucha giúp chống nhiễm các nấm mốc trong không khí và các bào tử vi khuẩn Kết quả là kombucha có thể tương đối dễ dàng lên men trong điều kiện thường Các vi khuẩn và nấm men trong kombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh [26]

Trong quá trình làm cẩn thận để tránh cho trà không bị nhiễm các loại nấm mốc gây độc cho cơ thể Các yếu tố để đảm bảo an toàn cho việc lên men: môi trường sạch sẽ, nhiệt độ thích hợp, pH thấp

Hình 1.1 Độ pH của kombucha

Nếu quá trình lên men bị nhiễm, có thể nhận thấy bằng mắt thường như trên bề mặt con nấm có xuất hiện màu xanh lá cây, xanh dương hoặc màu

đen, mốc trắng hình cầu thì đó có thể là các loài nấm mốc Aspergillus

parasiticus, Aspergillus flavus, Penicillium citricum… Các loại nấm mốc trên

sẽ sản sinh ra mycotocin, citrinin, aflatoxin… đều là các độc tố có khả năng gây ung thư, khi xuất hiện sẽ làm sản phẩm mất giá trị dinh dưỡng và gây mùi khó chịu

Hình 1.2 Kombucha bị nhiễm nấm mốc

Trà kombucha là một loại thức uống bổ dưỡng xa xưa của người dân Trung Quốc được là trà nấm Quá trình lên men sản sinh ra nhiều chất có lợi cho sức khỏe như vitamin, khoáng chất, acid glucuronic, acid lactic, acid acetic và vitamin B ( B1, B2, B3, B5, B6, B15…), các hợp chất hữu cơ khác như PABA, acetamidophenol, cafein…

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất trong trà kombucha

Trà kombucha được sử dụng rộng rãi ở một số nước trên thế giới từ cách đây khá lâu Ở các nước như Nhật, Nga và Pháp trà kombucha được xem như một bí quyết để có một cuộc sống khỏe mạnh và được sử dụng trong những bữa ăn hàng ngày Riêng ở Việt Nam, việc sử dụng trà kombucha vẫn còn khá mới mẻ nhưng số lượng người dùng ngày càng gia tăng Đối với lợi ích của trà kombucha đã có nhiều báo cáo dựa trên quan sát cá nhân sử dụng sản phẩm, tuy nhiên những nghiên cứu về đặc tính của trà kombucha vẫn còn rất ít và khá mới mẻ với các nhà khoa học Từ năm 1852, trà kombucha đã được chú trọng nghiên cứu, chủ yếu là ở Châu Âu Khoảng thời gian từ năm

1925 đến 1950, một số nghiên cứu y khoa đã xác nhận những tuyên bố truyền thông về kombucha và báo cáo một số lợi ích của trà kombucha [22]

Trên thế giới đã có một số ít công trình nghiên cứu về trà kombucha, phần lớn tập trung nghiên cứu liên quan đến việc xác định thành phần hệ vi sinh vật, thành phần hóa học và phương pháp lên men… nhưng việc nghiên cứu tác dụng, dược tính của trà kombucha đối với sức khỏe con người vẫn còn rất hạn chế Bên cạnh đó, ở Việt Nam vẫn chưa có một công trình nghiên cứu cụ thể đầy đủ về thành phần và tác dụng của trà kombucha

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo

Hệ vi sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng

Acetobacter như: Acetobacter xylinum, Acetobacter ketogenum… và nấm

Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe… Ngoài ra còn có

thể có các chủng : Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium

gluconicum…

Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter

xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha Acetobacter xylinum có

khả năng tạo màng hemicellulose khá dày và chắc, tạo màu xanh với thuốc

được gọi là “con nấm” hay SCOBY

Hình 1.4 “ Con nấm” (SCOBY)

Kombucha sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đường, thường được sử dụng để lên men dung dịch trà đường Trong quá trình lên men,

kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên bề mặt dịch trà và dần dần tăng

bề dày, hình thành nên một lớp màng thứ hai (thường gọi là “nấm con”), tách biệt với lớp màng ban đầu ( “nấm mẹ”)

Hình dạng và kích thước của “con nấm” phụ thuộc vào hình dạng tiết diện của bình chứa

Hình 1.5 Kombucha được lên men trong các bình chứa có kích thước và

hình dạng khác nhau

Người ta có thể dùng trà xanh, trà đen, trà ô long, trà kukicha hoặc trà lipton để làm môi trường lên men kombucha Cả trà xanh và trà đen đều có thể được sử dụng để lên men, tạo ra mùi vị khác nhau, tuy nhiên, trong môi trường nước trà xanh, kombucha tạo thành mỏng hơn, nhưng tốc độ tăng trưởng nhanh hơn trong dịch trà đen

1.1.3 Hệ vi sinh vật trong kombucha

1.1.3.1 Vi khuẩn acetic

Vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae (hiếu khí bắt buộc) Chúng

phát triển tốt trên bề mặt môi trường, phân bố rộng rãi, đa dạng, phong phú trong tự nhiên: trong không khí, đất, gỗ, cây ăn trái, đặc biệt là các loại thực phẩm, hoa trái, nước trái cây và các sản phẩm lên men tự nhiên chứa ethanol như rượu, bia, giấm tự nhiên… Bên cạnh những mặt có lợi trong lên men như giấm, vi khuẩn acetic được xem là một trong những nguyên nhân quan trọng gây hư hỏng thực phẩm tươi và thực phẩm lên men giàu cồn

Họ vi khuẩn Acetobacteraceae ( Gillis và de ley, 1980) bao gồm:

Chi Acetobacter ( Beijerinck, 1898)

Chi Gluconobacter ( Asai, 1935)

Chi Acidomonas ( Urakami et al., 1989)

Chi Gluconacetobacter ( Yamada et al., 1998)

Chi Asaia ( Yamada et ai., 2000)

Chi Kozakia ( Lisdiyanti et al., 2002)

Chi Swacharibacter ( Jojima et al., 2004)

Chi Neoasaia ( Yukphan et al.,2006)

Chi Granulibacter ( Greenberg et al., 2006)

* Các phương pháp truyền thống trong phân loại và định danh họ

b Đặc điểm sinh thái

Đặc điểm phân bố của vi khuẩn acetic thường gắn liền với các nguồn dinh dưỡng chứa đường hay alcohol như các loại hoa, quả, bia, rượu và các nơi sản xuất giấm Tuy nhiên trong một số trường hợp, đặc điểm sinh thái được đánh giá là đặc điểm điển hình của giống hay loài Cụ thể như

Acidomonas chỉ có thể phân lập được trong bùn hoạt tính có methanol; Granulibacter được tìm thấy trong cơ thể người bị u hạch; một số loài có khả

năng cố định đạm thuộc hai giống Acetobacter và Gluconacetobacter sống

cộng sinh trong rễ cây họ đậu

c Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid được phân biệt bởi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa sau: Oxy hóa acetate tạo CO2 và H2O; phát triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau; phát triển sinh khối trong các môi trường chứa D- glucose 30%; acetic acid 0,35%; KNO3 1%; methanol; glutamate và malnitol; sinh acetic acid từ ethanol; tạo sắc tố hòa tan trong nước; đồng hóa ammonia trong môi trường chứa D- glucose, D-malnitol hay ethanol; tạo dyhidroxyaceton từ glcerol; phát triển trong môi trường không có nicotinic acid; phát triển sinh khối và tạo acid trong các môi trường có nguồn carbon duy nhất là: D- glucose, D- mamnose, D-galactose, D- fructose, L- sorbose, D- xylose, arabinose, L- arabinose, D- malnitol, D- sorbitol, glycerol, maltose, lactose, melibiose, sucrose, raffinose

Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: Sinh sản bằng cách nảy chồi, phân đôi, sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử

Phân loại: nấm men chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungi imperfecti) Lớp nấm men thật phần lớn dùng trong công

nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces Lớp nấm men giả bao gồm giống Crytococus, Mycoderma, Eandida, Geotrichum,

Rhodotorula

1.1.3.3 Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium Đây là những trực

khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không

có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5,5 † 6 Nhiệt độ

tiêu diệt hoàn toàn

1.1.4 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha

Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá trình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau:

* Lên men ethanol

Hình 1.6 Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm

lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối (với sự

có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối), thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2 (giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2) Sau

khi được vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa theo chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic Tiếp theo acid pyruvic

sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chất này có thể chuyển hoá thành glyxerol Trong môi trường pH acid, glycerol chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ Ngược lại, trong môi trường pH kiềm lượng glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men

Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:

C6H12O6 + 2ADP +2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP

bào chất của nấm men Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men trong điều kiện kỵ khí Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men thải vào môi trường lên men Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những hợp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este Trong quá trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990) Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trình lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic

* Lên men acetic:

Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dưới tác dụng của vi khuẩn

C2H5OH + O2 → CH3CHO (Acetaldehyde) + H2O

CH3CHO + H2O → CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyde)

CH3CH(OH)2 + O2 → CH3COOH + H2O

Hình 1.7 Quá trình oxi hóa rượu thành acid acetic

* Lên men lactic:

Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng Các phân tử ATP được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO

2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những

biến đổi hóa lý khác Bản chất là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật

Phương trình tổng quát:

C6H12O6  CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH + COOH(CH2)2COOH + CO2

Glucose acid lactic(40%) acid acetic ethanol acid succinic

Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, nói chung thì acid lactic thường chiếm 40% lượng đường đã được phân hủy, acid succinic 20%, ethanol chiếm 10%, acid axetic 10% và các loại khí gần 20%

1.1.5 Thành phần hóa học và công dụng của kombucha

Đây là một loại thức uống được lên men trong dung dịch trà đường bởi kombucha Kombucha có thể sử dụng một số loại trà để lên men, nhưng không sử dụng được trà thảo mộc vì kombucha dễ bị hỏng khi lên men trà có nhiều tinh dầu Loại trà như Earl Grey có chứa dầu thơm Bergamot, có thể làm cho kombucha bị chết hoặc bị ảnh hưởng xấu Sử dụng các loại trà khác nhau sẽ cho ra những loại thức uống với những hương vị khác nhau

1.1.5.1 Thành phần hóa học của kombucha

Theo nghiên cứu của tổ chức The American FDA and CDC [46], [47],

tỷ lệ các chất hóa học có trong trà kombucha như sau:

1.1.5.2 Công dụng của kombucha

Kombucha đã được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm của Mỹ (FDA) chứng nhận là an toàn đối với con người [56], [57] Việc sử dụng rộng rãi thức uống từ kombucha đã được nghiên cứu qua nhiều tài liệu trong suốt thế kỷ qua Dạng trà kombucha lỏng (trà kvass) và dạng đặc (zoogloea) cũng được nghiên cứu và kết quả ban đầu cho thấy trong dịch trà này có chứa chất kháng sinh (diệt khuẩn và kìm hãm vi khuẩn) có tác dụng chống lại một số vi sinh vật gây bệnh và đã được sử dụng cho mục đích điều trị trong thuốc thú y

và thuốc cho người Đầu thế kỷ XX, chủ yếu là những nghiên cứu y học của người Đức, chứng minh kombucha có tác dụng điều tiết đường ruột và có ảnh hưởng tốt đến chức năng nói chung của cơ thể, nhưng cũng dần có hiệu quả

cụ thể trong những trường hợp như rối loạn tiêu hóa, táo bón, trĩ, sỏi thận, các vấn đề về túi mật, tiểu đường, cholesterol, cao huyết áp, xơ cứng động mạch, đau đầu, mệt mỏi …

Vào gần giữa thập kỷ, giám đốc “Học viện hóa học” (“Academy of Chemists”) tại Braunschweig ghi nhận rằng kombucha cung cấp năng lượng

cho toàn bộ hệ thống các tuyến, dùng cho bệnh gút, thấp khớp, nhọt, xơ cứng động mạch, huyết áp cao và vấn đề về lão hóa, bằng cách làm hài hòa và cân bằng sự trao đổi chất, và chuyển các dạng có hại của acid uric và cholesterol thành dạng hòa tan dễ dàng được bài tiết qua thận và ruột

Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới thì trà kombucha có nhiều lợi ích đối với con người, thường được tìm mua ở các cửa hàng thực phẩm chức năng Theo Paupell ở Nhật thì thuỷ sâm kombucha có thể trị dứt hoặc giảm bớt các bệnh sau đây: đái tháo đường hoặc tiểu đường (thủy sâm điều hoà được lượng đường trong cơ thể đối với những người bị bệnh tiểu đường); trị bệnh cao huyết áp (đối với những người cao tuổi, giảm cholestorol trong máu, ngăn ngừa xơ cứng động mạch, phù thũng); bệnh tái đỏ, nổi mụn vòng quanh bụng; chống lão hoá, giảm nếp nhăn trên trán, mặt Làm đẹp da mặt, trị tàn nhang, đồi mồi trên da làm da mịn màng hơn; chống ung thư, giảm bớt

sự nhạy cảm với hoá chất, men gan cao đối với bệnh nhân điều trị xạ trị ung thư, các bệnh về thận, phòng bệnh ung thư và chống lại tế bào ung thư, kéo dài sự sống đối với bệnh nhân ung thư; làm sáng mắt, trị bệnh mắt kéo mây (mắt có cảm giác có sợi tơ trong mắt), chữa mắt có vầng nâu xám làm mờ mắt sưng húp; làm cơ bắp rắn chắc hơn; chữa chân tay đổ mồ hôi, đau lưng

và các khớp xương; đặc trị bệnh mất ngủ (hay bị tỉnh giấc về đêm, đảm bảo dùng sẽ khỏi hoàn toàn) giúp ăn ngon miệng hơn, trị sạm mặt, đau gan, đau bao tử; đặc trị bệnh viêm đường ruột, các bệnh mật, tiêu chảy(các bệnh về đường ruột như hay ăn thức ăn lạ bị đi ngoài, viêm ruột, hay bị đi ngoài không rõ nguyên nhân); trị táo bón làm cho nhuận tràng; trị chóng mặt do thiếu máu lên não; trị bệnh trĩ; làm tóc bạc trở lên đen hơn, tóc mọc dày hơn; trị gan nhiễm mỡ; trị bệnh máu nhiễm mỡ, có tác dụng làm tan mỡ trong máu, gan, thanh lọc cơ thể; giải độc, trị men gan cao, giải độc bị nhiễm thuỷ ngân, tăng cường sự hoạt động của gan và túi mật (chú ý đừng uống

nhiều một cách hấp tấp, chất độc thải ra chưa bài tiết kịp sẽ thấm ngược trở lại vào máu, nên tăng liều lượng một cách từ từ); trị bệnh về thận, uống từ 100 ngày trở lên sẽ thanh lọc được cơ thể; trị bênh thấp khớp; trị bệnh đau cơ bắp, vai, cổ; trị căng thẳng thần kinh, điều hoà thần kinh; làm cân đối với những bệnh nhân béo phì, những người phì mập (nấm có tác dụng đào thải, làm giảm cân, giảm từ 2 đến 4 kg và làm săn chắc cơ thể)

1.1.5.3 Một số lưu ý khi sử dụng

Với những bệnh nhân trong giai đoạn điều trị ung thư do xạ trị hoặc hóa trị, nếu dùng trà cần sự giám sát của thầy thuốc Do trà chứa quá nhiều acid lactic, uống trong một thời gian dài có thể dẫn đến đau khớp, chóng mặt

và viêm xoang; trẻ em có thể dùng nhưng liều lượng thay đổi theo tuổi, cân nặng và quan trọng cần phải được pha loãng với nhiều nước, không nên cho trẻ dưới 2 tuổi uống; phụ nữ có thai không nên dùng vì có đến 1% lượng cồn trong nước trà, không nên uống trong thời gian cho con bú vì gây đau bụng cho trẻ sơ sinh; người tiểu đường chỉ nên dùng trà đang lên men vì hầu hết lượng đường bị biến đổi, tuy nhiên nếu ủ men trà với quá ít đường (dưới 50 g/l) thì khó xuất hiện các đặc tính hữu ích của trà kombucha vì vậy người tiểu đường cũng không nên uống nhiều; trà kombucha gây loãng máu, cần giảm liều và chú ý ngưng một tuần trước khi phẫu thuật; phụ nữ bị rong kinh cũng cần thận trọng và nên ngưng sử dụng trước kinh kỳ tối thiểu một tuần Men trà kombucha có thể bị hỏng và mất hết tác dụng nếu ủ không đúng quy cách

1.2 Một số đặc điểm về trà Thái Nguyên

Thái Nguyên được biết đến không những là cái nôi của chiến khu Việt Bắc mà còn nổi tiếng với những vùng chè như Tân Cương, La Bằng, Tức Tranh… Ngày nay, sản phẩm chè Thái Nguyên đã có một thương hiệu chính thống, được Nhà nước bảo hộ Tuy nhiên sản phẩm chè tại Thái Nguyên chưa được đa dạng hoá sản phẩm

1.2.1 Phương pháp sản xuất trà xanh

Trà xanh được chế biến từ trà tươi, qua các quá trình sau:

Trà tươi → diệt men → vò trà → làm khô → sao lăn gia nhiệt tạo hình

→ phân loại → sao hương → phân loại → sản phẩm

Trong quá trình sản xuất trà xanh, tùy theo từng phương pháp diệt men khác nhau và phương pháp làm khô khác nhau mà chia ra nhiều loại theo tính chất, hương vị đặc biệt của nó

1.2.2 Đặc điểm của trà xanh Thái Nguyên

Hình 1.8 Trà Thái Nguyên

Do quá trình diệt men làm đình chỉ hoạt động của enzyme, nên các thành phần trong trà xanh rất ít bị biến đổi, hàm lượng polyphenol trích ly trong nước là 30 – 40%, các vitamin và khoáng chất vẫn được giữ lại (đặc biệt

là vitamin C) Vì vậy, giá trị dinh dưỡng của trà xanh tương đối cao Trà xanh

có khả năng chống ung thư cao, tác dụng tương tự như trà tươi

1.3 Tình hình nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam và trên thế giới

1.3.1 Trên thế giới

Đồ uống chức năng là một phân ngành quan trọng trong phạm vi thực phẩm chức năng Thị phần của đồ uống chức

gành công nghiệp không cồn, với tốc độ tăng trưởng hàng năm cao nhất là 15% đến 20% [41] Thị trường này được dự đoán sẽ có sự gia tăng bởi vì mọi người có chủ động hơn trong công tác phòng chống và kiểm soát bệnh tật, họ tập trung vào các thành phần lành mạnh tự nhiên Chức năng của đồ uống để cung cấp lợi ích sức khỏe chẳng hạn như sức khỏe tim mạch, cải thiện khả năng miễn dịch và tiêu hóa trong đó gia tăng lo ngại về bệnh béo phì và tác động của nó đối với sức khỏe [36] Cải thiện chung của y tế và chăm sóc sức khỏe bằng cách giảm lượng đường và lượng calo tiêu thụ và tăng tiêu thụ với liều hàng ngày các vitamin và khoáng chất thiết yếu bằng đồ uống chức năng là nguồn tuyệt vời của vitamin B, giúp đáp ứng nhu cầu của quá trình chuyển hóa năng lượng, và nguồn gốc của chất chống oxy hóa vitamin E và C giúp bảo vệ cơ thể của hoạt động cá nhân [50] Một trong những xu hướng là chế phẩm sinh học cho sức khỏe đường ruột và tăng cường hệ thống miễn dịch, bộ nhớ và độ thoải mái tinh thần cũng đang tập trung vào đồ uống lên men [30] Tác dụng phòng ngừa của trà xanh trên thận do tiểu đường đã được chứng minh [32], ảnh hưởng của kombucha lên men thức uống trà xanh bảo vệ chống lại các bệnh thoái hóa thận Kombucha – sự cộng sinh của vi khuẩn và nấm men đã được nuôi để có được sản phẩm đồ uống lành mạnh [45] Kombucha đã có một thời nổi tiếng tại Châu Âu và Hoa Kỳ, nhiều bài báo đã được viết về kombucha, được đăng tải trên các tạp chí quốc tế như “Taking the Fungal-Tea plunge, Newsweek, January 9, 1995”

Cavusoglu K., Gluer P (2010) đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên nhiễm sắc thể gây ra bởi bức xạ gamma trong tế bào bạch huyết ngoại vi của con người trong ống nghiệm [19] Dutta D., Gachhui R

(2006) đã phân lập vi khuẩn Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov cố định

đạm từ trà kombucha [20] Dutta D., Gachhui R (2007) đã phân lập từ trà

kombucha vi khuẩn cố định đạm và cellulose là Gluconacetobacter kombucha

sp.nov [21] J Reiss, (1994) đã tìm hiểu ảnh hưởng của các loại đường khác

nhau lên quá trình trao đổi chất của nấm trà [27] Jayabalan R., Malini K., Sathishkumar M., Swaminathan K.,Yun S.-E (2010) tìm hiểu đặc điểm sinh hóa của nấm trà [28] K.H Steinkraus, K.B Shapiro, J.H Hotchkiss, R.P Mortlock,(1996) viết về hoạt động kháng sinh của trà nấm kombucha [34] Nguyen Vu Tuan; Flanagan, Bernadine; Gidley, Michael J.; Dykes, Gary A

(2008) tìm hiểu đặc tính của màng BC bởi chủng Gluconacetobacter xylinus

phân lập từ kombucha [48] Petrushevska-Tozi L., Bauer-petrovska B (2000)

đã xác định được hàm lượng vitamin hòa tan và khoáng trong nước uống kombucha [42] R.A Ledford C.J Greenwalt, and K.H Steinkraus đã xác định và mô tả đặc điểm của các hoạt động chống vi khuẩn của kombucha trà lên men [43] Velicanski, Aleksandra; Cvetkovic, Dragoljub; Markov, Sinisa; Tumbas, Vesna; Savatovic, Sladjana (2007) viết về hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha [48] Yapar K., Cavusoglu K., Oruc E, Yalcin

E (2010) viết về tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên khả năng gây độc của phenol ở chuột bạch [52]

1.3.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, những công trình nghiên cứu về kombucha còn rất khiêm tốn và chưa đầy đủ, hoàn chỉnh về khu hệ nấm men, vi khuẩn lên men kombucha

Theo Nguyễn Lân Dũng: hiện nay, lĩnh vực nghiên cứu về kombucha ở nước ta còn khá mới mẻ, chưa có một công trình nghiên cứu nào về kombucha cũng như hiệu quả chữa bệnh của loại trà này được công bố Tác dụng chữa bệnh và độ độc hại của loại trà này cần phải được nghiên cứu, kiểm tra và giám định chắc chắn Tóm lại, đây là một dạng cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn sinh acid acetic, có thể tự nhân giống bằng nước chè

đường, có lợi cho sức khỏe tương đương như sữa chua Nhiều công bố nói về tác dụng chữa bệnh hiểm nghèo nhưng không có cơ sở khoa học nào chứng thực như vậy Uống kombucha chỉ có lợi cho sức khỏe, nhất là cho đường tiêu hóa, không có tác hại gì

Theo Vũ Văn Chuyên thì từ năm 1969, ở Bắc Thái (cũ) và Hà Nội, người ta đã phổ biến cho nhau dùng nước thủy hoài sâm để bồi dưỡng và phục hồi sức khỏe, chống lại bệnh tật Từ năm 1994 đến nay, ở tỉnh Bình Định và một số nơi khác ở miền Nam đang lưu hành một loại nước uống có tính chất giải khát đặt tên là “Trà giấm” có tác dụng bồi bổ, tăng cường sức khỏe, làm cho ăn ngon miệng, ngủ yên giấc và chữa được nhiều bệnh, nhất là bệnh huyết áp cao, chứng mất ngủ Đinh Công Bảy, Tổng thư ký Hội Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh, cho biết ông cũng nghe nói đến thủy sâm, tuy nhiên do chưa nghiên cứu nên chưa thể trả lời về công dụng thực sự của loại trà này Hà Văn Hùng, Phó Viện trưởng Viện Y dược học dân tộc Thành phố

Hồ Chí Minh cũng cho rằng cho đến nay Viện cũng chưa có công trình nào nghiên cứu về thủy sâm nên không biết rõ thành phần và công dụng của nó [53] Lê Kim Phụng, nguyên giảng viên Trường Đại học Y dược Thành phố

Hồ Chí Minh, người đã có một số bài viết về thủy sâm, cho biết: "Hiện nay ở nước ta đang xuất hiện một loại thuốc bổ ở dạng lỏng như trà mà mọi người gọi là trà "thủy sâm", thực ra đây chính là một loại thức uống có từ rất lâu được gọi tên là "The Remedy for Immortality", nghĩa là "Phương thuốc Trường sinh" Thủy sâm thực sự chỉ là một loại cái giấm (nấm men) phát triển dưới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng Loại giấm này sinh sôi nhanh trong môi trường nước chè (trà) pha đường Thành phần trà kombucha

có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ Phan Đức Bình, chuyên gia về dược liệu, Phó chủ tịch Hội Bảo vệ người tiêu dùng Thành phố

Hồ Chí Minh cho biết, những quảng cáo kiểu trà kombucha có khả năng “ cải

lão hoàn đồng, tái tạo tóc, ngừa ung thư, trị bách bệnh…” đều không có những bằng chứng xác thực

Sinh viên Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cs (2012), Đại học Mở TP Hồ

Chí Minh đã thực hiện đề tài “ Nghiên cứu hệ vi sinh vật của trà kombucha và

hiệu quả tác dụng trên một số chỉ tiêu sinh lý chuột” Trong đề tài này nghiên

cứu về hệ vi sinh vật trong kombucha bao gồm: vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic và nấm men, đồng thời khảo sát tác dụng của kombucha trên một số chỉ tiêu sinh lý của chuột như: cân nặng, tổng lượng hồng cầu, tổng lượng bạch cầu, sức khỏe của chuột thí nghiệm qua mô hình bơi kiệt sức Kết luận: sản phẩm trà kombucha có tác dụng tăng cường sức khỏe, không gây ảnh hưởng xấu tới các chỉ tiêu sinh lý của chuột [54]

Sinh viên Tôn Nữ Liên Hương thuộc khoa Khoa học Tự nhiên – Đại

học Cần Thơ đã có bản báo cáo khoa học với tên đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng

của thời gian chế biến tới một số tính chất và hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha”, tháng 3 năm 2013 Nội dung của bản báo cáo khoa học: giới

thiệu trà giấm kombucha, định hướng nghiên cứu thực nghiệm, tóm tắt các kết quả nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học của trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt kết quả khảo sát hàm lượng của các hợp chất hữu cơ có hoạt tính trong trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt về một số hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha: tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, độc tính trên tế bào ung thư, theo thời gian lưu mẫu, trên từng loại trà giấm [55]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn thuần khiết phân lập từ kombucha được lên men từ trà Thái Nguyên trong phòng thí nghiệm vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

2.1.2 Hóa chất và thiết bị

2.1.2.1 Hóa chất

Nguồn cacbon: glucose (C6H12O6 ), acid acetic

Nguồn nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4

Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4

Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol, …

H2SO4 , CaCO3 , thạch agar…

2.1.2.2 Thiết bị

 Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

 Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác

2.1.3 Môi trường

(MT1) Glucose : 20g MgSO4.7H2O : 2g

* Môi trường lên men kombucha (MT3)

Saccharose : 100g Trà xanh Thái Nguyên: 20g Nước máy : 1000ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram

a Phân lập vi khuẩn theo phương pháp Vinogradski

Để có được chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành phân lập từ nguồn nguyên liệu là kombucha Trước hết cần thực hiện quá trình lên men kombucha từ trà Thái Nguyên thu được mẫu màng lên men giấm tự nhiên

Cách làm: lấy dịch lên men kombucha lắc đều bằng máy vôntex trong

10 phút thu được huyền phù vi sinh vật Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng

độ khác nhau từ 10-1

10-3 đến 10-8 nhỏ lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp petri, dùng que trang trang đều Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong 2 - 3 ngày Dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trưng ra khỏi môi trường phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 40

C [7], [8], [10]

b Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram

Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi khuẩn dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protein đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt

Để tiến hành phương pháp nhuộm Gram cần lấy mẫu từ các chủng đã qua sơ tuyển làm tiêu bản Khi đó tùy vào màu của tiêu bản thu được giúp ta phân biệt được vi khuẩn Gr-

hồng thì đó là vi khuẩn Gr-, bắt màu tím là vi khuẩn Gr+

Bản chất của hiện

được cấu tạo từ một loại protein đặc biệt, chứa muối Nucleatmagie có khả năng tạo với tím Geltian và Lugol một loại phức chất bền, khó bị rửa trôi, khi quan sát tiêu bản trên kính hiển vi tế bào vi khuẩn Gr+

bắt màu tím geltian Vi khuẩn Gr-

không có khả năng giữ màu này nên dễ bị rửa trôi bởi cồn Chỉ khi nhỏ Fucshin vi khuẩn Gr-

mới bắt màu hồng của Fucshin [5], [8], [10], [11] Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đại 1000 lần)

2.2.1.2 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đếm

a Phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch đĩa

Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi ở 300C sau 3 ngày đếm số khuẩn lạc (CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức

Trong đó: N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu

A- Số CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri

10-n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy [6], [8], [11]

b Phương pháp đếm số lượng tế bào bằng phòng đếm

Đây là phương pháp đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật có trong

huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa khung đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ khung đếm cho dịch chiếm đầy khoang Đếm số lượng tế bào theo các ô theo đường chéo hoặc theo các góc ở trung tâm khung đếm Thường đếm 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm của khung đếm để tính số lượng tế bào trung bình của ô lớn Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1ml lúc đầu:

N=A x 25 : V : n Trong đó: N – số lượng tế bào trong 1ml dịch huyền phù lúc đầu

A – số lượng tế bào trung bình trong 1 ô lớn

V – thể tích của 1 ô lớn

n – độ pha loãng của mẫu ( 10-n)

25 là số ô lớn của toàn khung đếm [5]

2.2.1.3 Bảo quản chủng giống

a Bảo quản trên thạch nghiêng

Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trường giữ giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 300C Sau đó giữ trong tủ lạnh 40C dùng cho nghiên cứu tiếp theo Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [10], [12]

b Bảo quản trong dung dịch glycerin 15%

C sau

48 giờ đem li tâm dịch nuôi cấy trong 20 phút ở 3000 vòng/ phút, tách lấy phần sinh khối Hoà đều sinh khối trong 1ml dung dịch glycerin 15% vô trùng giữ ở -800C trong các ống eppendof vô trùng Bảo quản theo phương pháp này cho phép giữ giống trong vòng 1 đến 3 năm [9]

2.2.1.4 Phươ

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men Phương pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trường tiêu

C trong 20 phút Sau

đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [12], [13]

2.2.2

2.2.2.1 Phát hiện hoạt tính catalase

bọt khí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +) Ngược lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -) [2], [5], [8]

2.2.2.2 Phát hiện khả năng oxy hoá rượu etylic thành acid acetic

Nuôi cấy chủng vi khuẩn trên môi trường có thành phần (g/l):