Nghiên cứu một số yếu tố môi trường ảnh hưởng tới khả năng sinh cellulase từ một số chủng nấm mốc được phân lập ở vĩnh p

Phân bố ở khắp nơi, có khả năng sinh cellulase là phức hệ enzyme rất quan trọng trong quá trình phân giải cellulose tự nhiên và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: công nghi

_*** _

LÊ THỊ MINH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH CELLULASE TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC ĐƯỢC PHÂN LẬP Ở VĨNH

LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giảng viên - TS Phương Phú Công

đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, giúp đỡ, tạo điều kiện để em thực hiện và hoàn thành tốt luận văn này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong bộ môn Vi sinh vật

Đồng thời em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, khoa Sinh – KTNN, phòng thí nghiệm vi sinh, thư viện đã tạo điều kiện giúp đỡ để

em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp

Ngoài ra, em xin cảm ơn sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, gia đình trong suốt quá trình làm đề tài

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2010

Sinh viên

Lê Thị Minh Phương

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận là hoàn toàn trung thực và không trùng với kết quả của tác giả khác

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2010

Tác giả

Lê Thị Minh Phương

DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

Hình 1.1 Cấu trúc lập thể của phân tử cellulose 4

Hình 1.2 Cấu trúc của cellulose 5

Hình 1.3 Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose theo Erickson,1973 9

Hình 3.1 Khả năng sinh cellulase của một số chủng nấm mốc được phân lập 27

Hình 3.2 Đặc điểm hình thái của chủng M3 và M6-1 29

Hình 3.3 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh cellulase 30

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính cellulase 32

Hình 3.5 Khả năng sinh cellulase của chủng M3 và M6-1 ở 250C và 300C 33

Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính cellulase 34

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase 35

Hình 3.8 Khả năng sinh cellulase của chủng Penicillium M3 và Aspergillus M6-1 trên nguồn nitơ là NaNO3 36

DANH MỤC BẢNG BIỂU TRONG LUẬN VĂN

Bảng 1.1 Các thành phần chính của ligno – cellulose và các enzyme

phân giải của nấm 3

Bảng 1.2 Hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu 6

Bảng 3.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose 26

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính cellulase 30

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính cellulase 31

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase 33

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase 35

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Danh mục từ viết tắt

Danh mục hình trong luận văn

Danh mục bảng biểu trong luận văn

Mở đầu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cellulose 3

1.2 Hệ thống cellulase 7

1.3 Cơ chế phân giải cellulose 8

1.4 Ứng dụng của cellulase 11

1.5 Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose 15

1.5.1 Nấm sợi 15

1.5.2 Vi khuẩn 16

1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật 17

1.6.1 Giống vi sinh vật 17

1.6.2 Nguồn dinh dưỡng 18

1.6.3 Điều kiện nuôi cấy 19

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và vi sinh vật 21

2.1.1 Nguyên liệu 21

2.1.2 Môi trường 21

2.1.2.1 Môi trường bảo quản và giữ giống 21

2.1.2.2 Môi trường nuôi cấy 21

2.1.2.3 Môi trường thử hoạt tính enzyme 22

2.1.3 Hóa chất- thiết bị 23

2.1.3.1 Hóa chất 23

2.1.3.2 Thiết bị 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp vi sinh 23

2.2.2 Phương pháp hóa sinh 24

2.2.2.1 Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp cấy chấm điểm 24

2.2.2.2 Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch (William, 1983) 24

2.2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến hoạt tính của cellulase 25

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose 26

3.2 Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng M3 và M6-1 30

3.2.1 Anh hưởng của pH đến khả năng sinh cellulase 30

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase 31

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase 33

3.2.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Vi sinh vật đóng vai trò vô cùng quan trọng trong tự nhiên cũng như trong cuộc sống của con người Nó tham gia vào tất cả các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên, là khâu quan trọng trong chuỗi, lưới thức ăn của các hệ sinh thái, có vai trò quan trọng trong quá trình tự làm sạch các môi trường tự nhiên

Vi sinh vật tham gia vào quá trình phân hủy cellulose – một hợp chất hữu cơ có khá nhiều trong đất, thành phần chính cấu tạo nên cơ thể thực vật

Ở cây Bông cellulose chiếm 90% trọng lượng khô, ở các loài cây gỗ khác cellulose chiếm 40-50% Có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose như: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, niêm vi khuẩn…Nhưng đáng chú ý nhất là nấm mốc Phân bố ở khắp nơi, có khả năng sinh cellulase là phức hệ enzyme rất quan trọng trong quá trình phân giải cellulose tự nhiên và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường… Đặc biệt cellulase còn được sử dụng có hiệu quả trong chăn nuôi, là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn gia súc nhằm phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn giúp cho con vật tiêu hóa được tốt hơn

Tuy nhiên ở Việt Nam chế phẩm enzyme thường phải nhập khẩu với giá thành cao nên việc nghiên cứu và sản xuất chế phẩm enzyme để ứng dụng trong chăn nuôi là vấn đề rất cần thiết

Từ những lý do trên tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu một số yếu tố môi

trường ảnh hưởng tới khả năng sinh cellulase từ một số chủng nấm mốc được phân lập ở Vĩnh Phúc”

2 Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu một số yếu tố môi trường ảnh

hưởng tới khả năng sinh cellulase của một số chủng nấm mốc được phân lập ở Vĩnh Phúc’’ nhằm tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy của một số chủng

nấm mốc để sinh cellulase nhiều nhất

3 Nội dung của đề tài

- Phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase ở huyện Yên Lạc, thành phố Vĩnh Yên, Xuân Hòa (Vĩnh Phúc)

- Thử hoạt tính cellulase của một số chủng nấm mốc phân lập được

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng nấm mốc

+ Anh hưởng của pH đến khả năng sinh cellulase

+ Anh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase

+ Anh hưởng của thời gian đến khả năng sinh cellulase

+Anh hưởng của nguồn nitoden khả năng sinh cellulase

4 Ý nghĩa của đề tài

4.1 Ý nghĩa lý luận

Nghiên cứu nhằm đi sâu, tìm hiểu hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hoá của một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Hi vọng các chủng nấm mốc được lựa chọn sẽ tạo cellulase nhiều nhất

và được ứng dụng trong phân giải phế thải công nghiệp thực phẩm bổ sung vào thức ăn gia súc, công nghiệp môi trường…Thủy phân cellulose tạo cơ chất lên men để thu các sản phẩm cuối cùng khác nhau

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cellulose

Thành phần chất khô chủ yếu của thực vật là cellulose, hemicellulose

và lignin Các thành phần này thường có tỉ lệ không giống nhau ở các loại cây khác nhau Chúng phối hợp tạo nên cấu trúc và quyết định tính chất hóa học

và cơ lí của nguyên liệu có nguồn gốc thực vật Các hợp phần này thường đi

liền với nhau, do đó người ta thường gọi là ligno – cellulose (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Các thành phần chính của ligno - cellulose và các enzyme

phân giải của nấm (Fengel và Wegener, 1989; Eaton và Hale, 1993)

% sinh khối 40 – 50 25 – 40 20 – 35

Đơn phân tử D – anhydrogluco

pyranose

Xylose Mannose Hexoses

và các Pentose

Coniferyl alcohol

ρ – counmaryl alcohol Sinapyl alcohol

Cấu trúc đa

phân tử

β – o – 4 liên kết mạch thẳng

β1 – o – 4 liên kết mạch thẳng với các mạch nhánh thay thế

Khử hydro trùng hợp thành chất không kết tinh

Các enzyme

chính liên quan

Endoglucanlase (E C 3.2.1.4)

Endoxylanase (E.C 3.2.1.8)

Lignin peroxidase (E.C 1.11.1.7)

đến phân giải Cellobiohydrolase

(E.C 3.2.1.91)

β - glucosidase

và hydrolases khác

Mn phụ thuộc vào peroxidase (E.C

1.11.1.7) Laccase (E.C.1.10.3.2) Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật Tổng lượng của chúng chiếm tới 50% tổng số hydratcacbon trên Trái Đất Về cấu trúc hóa học của cellulose là một polyme mạch thẳng do các D-gluco-pyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4glucozid Các đơn phân glucose trong cellulose có cấu hình dạng ghế, quay một góc 1800 so với phân tử trước nó Các nhóm hydroxyl này đều nằm trên mặt phẳng nằm ngang

Hình 1.1 Cấu trúc lập thể của phân tử cellulose

Mức độ trùng hợp của cellulose tự nhiên có thể đạt tới 10.000 đến 14.000 gốc đường Nhờ có phương pháp phân tích bằng tia rơnghen, người ta

đã biết trong tế bào thực vật cellulose có cấu tạo dạng sợi Đơn vị nhỏ nhất hay dạng sợi sơ cấp là chuỗi thẳng, bao gồm các gốc D-glucopyranose, đường kính ≈ 3nm Các sợi sơ cấp này liên kết với nhau bởi mối liên kết hydro hoặc lực Vandervan hợp thành vi sợi, đường kính ≈ 10nm ÷ 40nm Những vi sợi này hợp thành những vi sợi lớn vững chắc có thể quan sát được dưới kính hiển vi quang học Mỗi sợi vi cấp lại được bao bọc bởi lớp lignin và

hemicellulose Chính nhờ sự liên kết chặt chẽ giữa cellulose, hemicellulose và lignin đã làm cho cellulose vững chắc và khó phân giải hơn (Hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc của cellulose

Cấu trúc của cellulose không đồng nhất và thường có 2 vùng:

- Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự cao nên bền vững với tác động bên ngoài

- Vùng vô định hình do cấu trúc không chặt chẽ nên kém bền vững hơn Vùng vô định của cellulose có thể hấp thụ nước và trương lên Trong khi đó các mạng lưới liên kết hydro ở vùng kết tinh lại ngăn cản sự trương này, nên enzyme chỉ tác động lên bề mặt các sợi

Mặc dù với những phương pháp hiện có chưa đủ để xác định chính xác cấu tạo của cellulose nhưng có thể thấy có rất nhiều kiểu gián đoạn và kết thúc chuỗi, các bề mặt dị dạng và các vùng xoắn hoặc phân nhánh dọc theo các vi sợi Trong quá trình sinh tổng hợp cellulose rõ ràng là không có sự khống chế chặt chẽ nào để cho mọi sợi đều có chiều dài như nhau Các sợi

riêng biệt có thể nằm trong nhiều vùng kết tinh, dẫn đến xảy ra nhiều chuỗi kết thúc bất ngờ ngay trong vùng có độ kết tinh cao

Cellulose tự nhiên không tan trong nước, axit hay kiềm loãng và nhiều dung môi hữu cơ khác Chỉ có axit hay kiềm nung nóng mới có tác dụng thủy phân cellulose Dưới tác dụng của axit, các liên kết glucozid sẽ bị phá hủy dần tạo thành các sản phẩm thủy phân không hòa tan có độ bền cơ học kém và cuối cùng nếu thủy phân hoàn toàn sẽ thu được D-glucose Dung d ịch kiềm làm trương phồng cellulose và hòa tan một phần cellulose mạch ngắn Trong

tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh enzyme thủy phân được cellulose như: vi khuẩn, xạ khuẩn, niêm vi khuẩn, nấm mốc…

Cellulose được tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn Sinh khối thực vật của Trái Đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose chiếm tới 720 tỷ tấn Khối lượng cellulose khổng lồ này ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có trong động vật và vi sinh vật nhưng với số lượng rất nhỏ Số liệu thống kê trong bảng 1.2 cho thấy hàm lượng cellulose trong một số nguyên liệu

Bảng 1.2 Hàm lƣợng cellulose trong một số nguyên liệu

Trong các phế liệu cellulose thường có mặt trong các dạng sau:

- Phế liệu nông nghiệp: rơm rạ, vỏ lạc, vỏ trấu, lõi thân cây ngô…

- Phế liệu công nghiệp thực phẩm: vỏ và xơ quả, bã mía, bã cà phê, bã sắn…

- Phế liệu trong công nghiệp chế biến gỗ: rễ cây, mùn cưa, gỗ vụn…

- Các chất thải sinh hoạt: rác, giấy báo, bao bì…

1.2 Hệ thống cellulase

Để có thể phân giải được cellulose tự nhiên cần phải có sự hiệp trợ của các enzyme trong phức hệ cellulase Phức hệ cellulase bao gồm 3 loại enzyme chủ yếu:

- Endoglucanase (EC.3.2.1.4 β-Dglucan glucanolhydrolase hay Carboxymethylcellulase viết tắt là CMCase): có khả năng cắt đứt cellulose các liên kết bên trong phân tử cellulose làm giảm nhanh chiều dài chuỗi nhưng đường khử tăng chậm do chúng thủy phân liên kết β-1,4glucozid một cách tùy tiện trong mạch cellulose và giải phóng cellulodextrin, cellobiose Enzyme này phân giải mạnh mẽ các cellulose hòa tan nhất là dạng cellulose

vô định hình nhưng hoạt động rất yếu ở vùng kết tinh Enzyme này được cho

là enzyme Cx Chính nhờ sự cắt trước của endoglucanase đã tạo ra các đầu không khử, tạo điều kiện dễ dàng cho cellobiohydrolase do đó mà thủy phân hoàn toàn được cellulose kết tinh

- Exoglucanase (EC.3.2.1.91 1,4 β- glucan – celobiohydrolase viết tắt

là CBH) Enzyme này xúc tác tách liên tiếp các phân tử cellobiose từ đầu khử (CBHI) và đầu không khử (CBHII) của chuỗi cellulose Ngày nay nó được coi

là enzyme chủ đạo phân giải cellulose, bởi nó có khả năng phân cắt cellulose

ở cả vùng kết tinh Hoạt tính của enzyme này rất mạnh khi tác động lên vùng

vô định hình và cellulose đã bị phân giải một phần bởi endoglucanase Bởi vậy, khi kết hợp endoglucanase với exoglucanase hoạt tính phân giải cellulose tăng rõ rệt

CBH tác động rất kém lên CMC, nhưng có thể cắt được CMC khi nó đã

bị trương lên một phần Các sợi bông có cấu trúc chắc chắn bởi các mối tương tác hydro và mức độ polyme hóa cao (>10000 glucose) thì CBH phân giải cũng chậm, bởi vì bông cũng có một ít đầu khử tự do Tuy nhiên CBH có thể cắt tốt nhất Avicel, một loại cellulose có các mối liên kết hydro chắc chắn, song mức độ polyme hóa thấp (<200 gốc glucose)

- β- 1,4 glucosidase (EC.3.2.1.21 β-1,4 glucosedase hay cellobiase): là enzyme rất đặc hiệu, có khả năng thủy phân cellobiose hay các cellooligosacarit hòa tan trong nước giải phóng glucose Enzyme này có hoạt tính cực đại trên cellobiose và có hoạt tính giảm dần theo chiều dài của chuỗi cellulodextrin Chức năng của β-1,4 glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích lũy các chất cảm ứng của cellulase

1.3 Cơ chế phân giải cellulose

Reese và các cộng sự lần đầu tiên đưa ra cơ chế phân giải vào năm

1952 như sau:

Theo tác giả này thì enzyme C1 (tương ứng với exoglucanase) là “tiền nhân tố thủy phân” hay là enzyme không đặc hiệu, làm biến dạng cellulose tự nhiên thành chuỗi cellulose hoạt động có mạch ngắn hơn, sau đó enzyme Cx(tương ứng với endoglucanase) tiếp tục phân cắt, giải phóng các đường hòa tan cellodextrin và cellobiose, cuối cùng cellobiose bị cắt tạo thành glucose dưới tác dụng của cellobiase

Erickson và cộng sự, 1973 lại có quan điểm khác, thể hiện trên một sơ

đồ phức tạp hơn nhiều về quá trình thủy phân cellulose (Hình 1.3)

Cellulose

tự nhiên

Cellulose hoạt động

Đường hòa tan

Glucose

Cellobise

Hình 1.3 Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose theo Erickson, 1973

Đầu tiên, endoglucanase tấn công vào các vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt đứt các liên kết β-1,4 glucozid để tạo ra các đầu mạch tự do Tiếp đó, dưới tác dụng của exoglucanase từ phía cực kín (phía không có tính khử), cellulose bị cắt thành các cellodextrin, sau đó cùng với sự hiệp trợ của exoglucanase phân cắt các cellulose tạo ra cellobiose và glucose Cuối cùng β-1,4 glucosidase thủy phân một phần cellodextrin và cellobiose thành glucose

Năm 1997, Tuula T.T, đã đưa ra một sơ đồ khác về cấu tạo của cellulose và tác động của cellulase Theo ông cellulose là một polyme tự nhiên cho nên sự kết tinh của nó cũng không hoàn hảo Các vùng vô định hình xen kẽ với các vùng kết tinh một cách ngẫu nhiên Các vùng vô định hình có thể ở trên bề mặt sợi cellulose hoặc ở ngay sát dưới vùng kết tinh hoàn hảo nhất Các loại cellobiohydrolase (CBH) sẽ tấn công vào các vùng kết tinh và các mạch bị cắt dở dang có các đầu khử hoặc không khử (CBHI tấn công vào đầu khử còn CBHII tấn công vào đầu không khử) lần lượt tách

các cellobiose ra khỏi chuỗi polyme Khả năng làm giảm mức polyme hóa của exoglucanase chậm song hàm lượng đường khử lại tạo ra nhiều Trong khi đó endoglucanase phân cách mạch polyme tùy tiện, không theo trật tự nào, tạo ra các chuỗi oligosaccarit ngắn, dẫn đến giảm nhanh mức polyme hóa của cellulose Trong quá trình cắt gẫy mạch polyme, endoglucanase tạo ra các đầu khử và không khử tự do, tạo cơ hội cho CBH phân cắt thành cellobiose Bởi vậy, khi có tổ hợp endo- exoglucanase quá trình phân giải cellulose mạnh lên nhiều

Tính chất và cấu trúc cũng như những thay đổi của cơ chất trong quá trình thủy phân đều tác động đến vận tốc phân cắt của enzyme Hiệu ứng này

đã được nghiên cứu trên quan điểm cơ chế phản ứng Các kết quả quan trọng thu được như sau:

1 Chỉ số kết tinh của cellulose kết tinh cục bộ tăng trong quá trình phản ứng và sự giảm đáng kế của vận tốc phản ứng phần lớn là do sự biến đổi cấu trúc của cơ chất cellulose

2 Độ kết tinh của cellulose toàn phần vô định hình ví dụ: cellulose đã

xử lí axit photphoric thay đổi không đáng kể và vận tốc cao được duy trì trong quá trình thủy phân

3 Vùng bề mặt đặc hiệu (SSA) của cellulose kết tinh cục bộ giảm đáng

kể trong quá trình thủy phân, trong khi đó SSA của cellulose tái sinh thay đổi không đáng kể

4 Trị số độ polyme hóa của cellulose có độ kết tinh cao gần như không thay đổi, còn của cellulose tái sinh vô định hình thì thay đổi rõ rệt

5 Tổng hợp các yếu tố cấu trúc, sự hấp phụ của cellulase, sự kìm hãm của sản phẩm và sự vô hoạt của cellulase, tất cả đều có ảnh hưởng quan trọng đến vận tốc thủy phân cellulose

Nói chung, cho đến nay chưa có giả thuyết nào giải thích được thật đầy

đủ và thỏa đáng về cơ chế tác động của cellulase Tuy nhiên, công nghệ và giải pháp thiết bị để chuyển hóa cellulose bằng con đường công nghệ sinh học thì hiện nay nhiều nước trên thế giới đã đưa vào triển khai ở quy mô công nghệ và đã thu được nhiều kết quả rực rỡ

cơ chất rẻ tiền

Cellulase là phức hệ enzyme rất quan trọng và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Trong hiện tại và tương lai người ta sử dụng cellulase cho 2 mục đích chính:

- Dùng cellulase trực tiếp trong phân giải phế thải của công nghiệp thực phẩm bổ sung vào thức ăn gia súc và trong công nghệ môi trường

- Thủy phân cellulose tạo cơ chất lên men để thu các sản phẩm cuối cùng khác nhau

Các lĩnh vực chính ứng dụng cellulase bao gồm:

- Công nghiệp chế biến thực phẩm:

+ Cải thiện độ tiêu hóa thức ăn

+ Chiết rút các chất gây vị, dầu, dịch ép protein từ rau quả

+ Cải thiện độ hòa tan của các nguyên liệu trong công nghệ lên men

+ Chế biến thạch từ rau câu

+ Sản xuất rượu và một số axit hữu cơ

- Công nghiệp dược phẩm:

+ Chế biến các chất tự tiêu hóa, loại bỏ các sợi không mong muốn

- Sản xuất thức ăn gia súc:

+ Cải thiện độ tiêu hóa rơm, cỏ làm thức ăn gia súc

+ Sản xuất thức ăn giàu protein

- Công nghệ môi trường [14]:

+ Ứng dụng trong xử lí phế liệu sau thu hoạch, xử lí rác đô thị, phân hủy thành phân bón hữu cơ

+ Phân hủy các chất tồn lưu

- Công nghệ lên men:

+ Cung cấp cơ chất cho tổng hợp khí metan, glyxerin, axit citric, axit lactic, vitamin, protein đơn bào, chất kháng sinh, các chất có hoạt tính sinh học khác

Ngoài ra, trong giao thông vận tải, từ sinh khối lignocellulose sản xuất

ra etanol là nhiên liệu tuyệt vời cho động cơ đốt trong và nó có thể thay thế cho nhiên liệu hóa thạch để giảm bớt sự ô nhiễm môi trường và sự nóng lên toàn cầu (Philippidis và Smith, 1995)

Trong công nghiệp dệt may, người ta thấy nếu dùng cellulase ở liều thấp để xử lí bông sẽ làm bông trắng và mịn màng hơn, do nó loại bỏ được các sợi tơ và hạt trên mặt sợi bông làm cho sợi phẳng, bóng mượt và mềm Hoặc có thể dùng cellulase (các loại cellulase trung tính) để mài vải quần áo

bò thay thế cho mài bằng đá bọt để tạo ra những điểm “bạc” tự nhiên của quần áo bò Điều này có ý nghĩa rất lớn đối với ngành công nghiệp mài vải bò

vì khi xử lí bằng cellulase làm cho vải bò bền hơn nhiều, nó không phá cấu

trúc của vải mạnh như đá mài, hơn nữa khối lượng mài một mẻ tăng lên 50%

do đã loại bỏ 50% thể tích đá bọt phải bổ sung vào vải ở thùng mài

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy, giấy sử dụng cellulase để tẩy mực trên các giấy phế thải thay thế dùng Cl hoặc ClO2 gây ô nhiễm môi trường

Để làm sạch, trắng giấy người ta sử dụng chủ yếu là loại hemicellulase,

xylanase từ Sporotricchum pulverulentum, S dimorphosphorum, cellulase từ

A niger hoặc từ Phanerochaeta chrysosporium, hoặc mannase từ T reesei

Cellulase thường được dùng ở (0,001÷0,1%), cellulase (0,05÷0,5%), cellobiase (0,005÷0,015%)

Trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa Tác dụng của cellulase trong chất tẩy rửa chủ yếu là loại bỏ các sợi hỏng, làm cho vải trở nên mịn đẹp, mềm sáng màu hơn Cellulase thường được sử dụng kết hợp với lipase (loại bỏ mỡ) và protease (loại bỏ protein) Các enzyme này dùng cho chất giặt đều là các enzyme trung tính hoặc kiềm

Cellulase còn được sử dụng có hiệu quả để phá vỡ thành tế bào thực vật trong kỹ nghệ lai ghép tế bào trần - một công nghệ lai tế bào giữa các loài hoặc thậm chí giữa các chi khác nhau tạo giống cây trồng mới trong nông nghiệp

*Ứng dụng của cellulase trong chăn nuôi

Trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng của thức ăn ở mức cao nhất Để giải quyết nhiệm vụ này, người ta có thể dùng chế phẩm enzyme

bổ sung khẩu phần thức ăn của vật nuôi Các enzyme này cùng với các enzyme có sẵn trong đường tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn, giúp cho con vật tiêu hóa được tốt hơn

Cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gia súc Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế phẩm enzyme

này mà thường bổ sung cùng với các enzyme khác như: amylase, protease, xylanase… tạo ra một dạng chế phẩm chứa nhiều loại enzyme (multienzyme) Việc bổ sung nhiều loại enzyme giúp vật nuôi phân giải được nhiều loại cơ chất, vật nuôi sẽ hấp thụ tốt hơn các nguồn thức ăn khác nhau

Khi động vật ở giai đoạn còn non, hệ enzyme tiêu hóa của chúng chưa hoàn chỉnh, chủ yếu ở động vật ăn bột và ăn cỏ Sử dụng enzyme trong chăn nuôi, người ta thấy lợn con theo ổ tăng trọng 20% và giảm thức ăn 6÷14% Thí nghiệm trên lợn 1÷3 tuần tuổi thì lợn tăng trọng 8÷40%, tăng khả năng sử dụng thức ăn từ 10÷18% [6]

Người ta cũng đã dùng enzyme bổ sung vào thức ăn của trâu bò Quá trình tiêu hóa thức ăn trong dạ cỏ của trâu bò được gắn liền với hoạt động enzyme của các vi sinh vật sống nhờ ở đấy Vì vậy, bổ sung vào thức ăn những chế phẩm enzyme để nâng cao khả năng tiêu hóa là điều rất cần thiết Dùng các chế phẩm có hoạt tính amylase, protease, cellulase… đều thu được kết quả tốt, kết quả tăng trọng của trâu bò có thể đạt tới 12÷17%, có khi còn cao hơn [13], [14]

Trên thế giới người ta đã sử dụng thức ăn gia súc có chứa các enzyme tiêu hóa từ đầu những năm 1990 Hiện nay, hằng năm người ta sản xuất khoảng 30 triệu tấn thức ăn gia súc có bổ sung chế phẩm enzyme Chiếm khoảng 5% trong tổng số 600 triệu tấn thức ăn gia súc được sản xuất

Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong thức

ăn chăn nuôi như: GS Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp sắn với

Aspergillus henebergii, Aspergillus niger dùng làm thức ăn cho gà, lợn, bò…

kết quả thấy có nhiều triển vọng [4] Chu Thị Thanh Bình và cs (2002) đã ứng dụng các chủng nấm men trong chế biến bã thải hoa quả giầu cellulose làm thức ăn gia súc [1] Gần đây, đã có nghiên cứu thử nghiệm về sự ảnh hưởng của enzyme thương mại: phytase hoặc tổ hợp các enzyme (amylase, protease,

xylanase, cellulase…) đến khả năng tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn con cai sữa Kết quả thử nghiệm cho thấy khi trong thức ăn có bổ sung chế phẩm phytase và tổ hợp các enzyme thì tăng trọng hơn so với đối chứng tương ứng là: 13,3% và 32% Nếu sử dụng phối hợp cả hai chế phẩm này thì tăng trọng hơn so với đối chứng là 50%

Như vậy, hiệu quả của việc bổ sung enzyme vào thức ăn chăn nuôi là rõ ràng làm tăng tỷ lệ tiêu hóa cho vật nuôi và giảm chi phí Tuy nhiên, hiện nay

ở Việt Nam chế phẩm enzyme thường phải nhập khẩu với giá thành cao nên nghiên cứu và sản xuất chế phẩm enzyme là vấn đề rất cần thiết

1.5 Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose

Sinh tổng hợp cellulase là quá trình phức tạp chịu sự điều khiển của bộ máy di truyền, sự hoạt hóa của các chất cảm ứng, và sự kiềm chế của các chất

trao đổi và các sản phẩm cuối cùng

1.5.1 Nấm sợi

Theo Carle-Urioste và cs cơ chế cảm ứng của cellulose đến sinh tổng

hợp cellulase ở nấm sợi T reesei dựa trên sự có mặt một lượng nhỏ cellulase

sẵn có trong nấm Lượng cellulase cơ sở này phân giải các oligosaccarit đã bị tách khỏi cellulose và có thể xâm nhập vào tế bào, mở đầu cho việc tổng hợp cellulase

Khi nghiên cứu sinh tổng hợp endoglucanase từ Nectria catalinenesis

người ta thấy chất cảm ứng tốt nhất CMC-Na

Các kết quả của Hrmova và cs cho thấy rằng các disaccarit trong tự nhiên cấu tạo bởi glucose và xylose, có vai trò quan trọng trong điều hòa sinh

tổng hợp cellulase của nấm sợi Aspergillus terreus Chất cảm ứng tốt nhất là

beta-D-glucopyranosyl D-Xylose (Glcbeta 1-2Xyl), Sophorose và beta-D-glucopyranosyl D-Xylose (Xylbeta 1-2Xyl) hoặc các đồng phân của chúng cũng là những chất cảm ứng tốt Loewenberg và cs khi nghiên cứu

2-O-cellulase của nấm sợi Trichoderma cũng có kết luận rằng: chỉ một lượng nhỏ

sophorose cũng gây lên sự tổng hợp cellulase Bổ sung nhiều lần với một lượng nhỏ sophorose sẽ tốt hơn là một lần với lượng lớn

Sorbose một loại đường không khử và không phải là sản phẩm của quá trình thủy phân cellulose cũng có vai trò điều hòa sinh tổng hợp và giải phóng cellulase

Lactose là chất cảm ứng hòa tan cho phức hệ enzyme cellulase của Trichoderma lignorum Tween-80 (0,1%) có ảnh hưởng tốt đến sinh tổng hợp

cellulase của Aspergillus terreus

Nhiều sản phẩm trung gian của chu trình Krebs (axit citric, succinic …)

là những chất ức chế của quá trình sinh tổng hợp cellulase Alcol phenethylic (PEA) là chất kìm hãm sinh trưởng và kích thích sinh tổng hợp cellulase của

Myrothecium verucaria Một số hợp chất hóa học khác có cấu trúc tương tự

PEA như alcol benzylic, propylic, aceton cũng có tác dụng thúc đẩy sinh tổng hợp cellulase PEA tác động đến tế bào chất và thành tế bào, nơi xảy ra quá trình sinh tổng hợp cellulase

Các chủng nấm sợi có khả năng phân giải cellulose thường thuộc các chi: alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Coprinus, Myrothecium Penicillium, Rhizopus, Trichoderma…

1.5.2 Vi khuẩn

Bacilus subtilis tổng hợp CMC-ase tốt nhất trên môi trường có chứa

chất cảm ứng là D (+) raffinose 0,2% Các chất kìm hãm là glucose và

cellobiose Sinh tổng hợp CMC-ase của Acetivibrio cellulolyticus được cảm

ứng bởi cellulose, cellobiose và salicin b ị kìm hãm nhưng không hoàn toàn bởi glucose Hoạt tính exoglucannase được tăng cường nếu nuôi cấy trên poly beta-glucozid polyme tan hay không tan và bị kìm hãm bởi sự tăng thêm cellobiose