Khảo sát một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của nấm mốc aspergillus niger

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP KHOA KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: LÂM TUẤN KIỆT LÊ HOÀNG THỤY ANH NHƯ NĂM 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP KHOA KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CELLULASE CỦA NẤM MỐC ASPERGILLUS NIGER GVHD: THS LÊ HOÀNG BẢO NGỌC BAN GIÁM HIỆU LÃNH ĐẠO ĐƠN VỊ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NĂM 2013 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Cảm tạ Xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu trường Đại học An Giang Ban chủ nhiệm khoa Nông nghiệp tài nguyên thiên nhiên, Bộ môn Công nghệ sinh học tạo điều kiện để chúng em hoàn đề tài nghiên cứu khoa học Hội đồng phản biện góp ý bổ sung để đề tài chúng em hoàn thiện mặt lý thuyết tạo sở thuận lợi cho tiến hành thí nghiêm Ban quản trị thiết bị thí nghiệm trường Đại học An Giang tạo điều kiện thuận lợi cho việc sử dụng dụng cụ thiết bị q trình tiến hành thí nghiệm Cơ Dương Thị Huỳnh Như cô Đặng Thị Như Thủy tận tình hướng dẫn chúng em việc sử dụng thiết bị Đặc biệt Lê Hồng Bảo Ngọc hỗ trợ nhiều cho chúng em hoàn thành đề tài nghiên cứu khoa học Đại học An Giang – 2013 i Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Tóm lược Đề tài “Khảo sát số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase nấm mốc Aspergillus niger” tiến hành phịng thí nghiệm Khoa Nơng nghiệp – Tài nguyên thiên nhiên, trường Đại học An Giang Mục đích đề tài xác định ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nuôi cấy, pH, nguồn chất cảm ứng, hàm lượng đường bổ sung (glucose), nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase nấm mốc Aspergillus niger Nghiên cứu tiến hành thí nghiệm: - Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger - Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng pH mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger - Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng (cellulose) hàm lượng chất bổ sung vào mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger - Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger - Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ hàm lượng nitơ bổ sung vào mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger Kết thí nghiệm: - Nhiệt độ thời gian nuôi cấy tối ưu 30oC 15 - pH môi trường nuôi cấy tối ưu pH = - Cơ chất hàm lượng bổ sung tối ưu rơm với tỷ lệ 10% - Hàm lượng đường (glucose) bổ sung tối ưu với tỷ lệ 0,1% - Nguồn nitơ hàm lượng bổ sung tối ưu pepton với tỷ lệ 0,1% - Thành phần môi trường nuôi cấy cuối (trấu 56,25%, cám 43,75%), thành phần khác bổ sung theo tỷ lệ % môi trường nuôi cấy (cám, trấu) Đại học An Giang – 2013 ii Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Mục lục Nội dung Trang Cảm tạ i Tóm lược .ii Mục lục iii Danh sách bảng .vii Danh sách hình viii Danh sách chữ viết tắt .x Chương Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Nội dung Chương Lược khảo tài liệu .4 2.1 Giới thiệu chung enzyme .4 2.1.1 Khái niệm enzyme 2.1.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme 2.1.2.1 Nhiệt độ 2.1.2.2 Nồng độ chất 2.1.2.3 Độ pH 2.1.2.4 Các chất ức chế enzyme 2.2 Tổng quan enzyme cellulase 2.2.1 Sơ lược enzyme cellulase 2.2.2 Cơ chất cellulose 2.2.3 Cơ chế tác dụng enzyme cellulase 2.2.4 Hoạt lực enzyme cellulase (cơ chế thủy phân cellulose ) 2.3 Nấm sợi Aspergillus niger 10 2.3.1 Phân loại nấm Aspergillus niger 10 2.3.2 Đặc điểm cấu tạo 11 2.3.3 Các đặc tính cấu trúc hệ cellulase từ Aspergillus niger 12 2.3.4 Nguồn phân lập 13 2.4 Giới thiệu thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn Aspergillus niger .13 2.4.1 Cám .13 2.4.2 Trấu .14 2.4.3 Cơ chất cảm ứng 14 2.5 Kỹ thuật nuôi cấy 15 2.6 Các phương pháp thu nhận enzyme 15 Đại học An Giang – 2013 iii Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa 2.6.1 Các phương pháp phá vỡ tế bào .15 2.6.2 Phương pháp lọc 16 2.6.3 Chiết rút enzyme 16 2.7 Một số nghiên cứu thu nhận enzyme cellulase 17 2.7.1 Nghiên cứu nước 17 2.7.2 Nghiên cứu nước 17 Chương Phương tiện phương pháp nghiên cứu 19 3.1 Phương tiện nghiên cứu 19 3.1.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 3.1.2 Nguyên liệu 19 3.1.3 Dụng cụ, thiết bị 19 3.1.4 Hóa chất 19 3.2 Phương pháp tiến hành .20 3.2.1 Quy trình sản xuất 20 3.2.2 Giải thích quy trình 20 3.2.2.1 Sản xuất bột giống Aspergillus niger 20 3.2.2.2 Chuẩn bị nguyên liệu 21 3.2.2.3 Trộn giống vi sinh vật .21 3.2.2.4 Nuôi cấy .21 3.2.2.5 Thu enzyme 21 3.3 Tiến hành thí nghiệm 22 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 22 3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 23 3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng (cellulose) đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger .24 3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào mơi trường ni cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 25 3.3.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 26 Chương Kết thảo luận 28 4.1 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian ni cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 28 Đại học An Giang – 2013 iv Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa 4.2 Kết khảo sát ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 29 4.3 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng (cellulose) đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 31 4.4 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào mơi trường ni cấy đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger 32 4.5 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt tính enzyme cellulase sinh tổng hợp từ nấm mốc Aspergillus niger .33 Chương Kết luận khuyến nghị 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Khuyến nghị .36 Tài liệu tham khảo .37 Phụ chương A Phương pháp chuẩn bị thí nghiệm .40 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 40 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme endoglucanse (phương pháp DNS) (Whitaker, 2003) .40 2.1 Nguyên tắc .40 2.2 Chuẩn bị mẫu 40 2.2.1 Dung dịch CMC (1 %) 41 2.2.2 Pha hỗn hợp Na2CO3/NaHCO3 41 2.3 Chuẩn bị thuốc thử 41 2.4 Tiến hành 41 2.5 Tính kết 41 Xây dựng đường chuẩn glucose 42 Tạo pH thích hợp cho q trình ni cấy nấm Aspergillus niger dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2) .43 Phụ chương B Một số hình ảnh thí nghiệm 44 Phụ chương C Kết phân tích thống kê 49 3.3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 49 3.3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng pH mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 50 3.3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng (cellulose) hàm lượng chất bổ sung vào mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 51 Đại học An Giang – 2013 v Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa 3.3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger .53 3.3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ hàm lượng nitơ bổ sung vào mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 54 Đại học An Giang – 2013 vi Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Danh sách bảng Trang Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng cám 14 Bảng 2: Thành phần nguyên liệu rơm, bã mía, mùn cưa 15 Bảng 3: Bố trí nghiệm thức thí nghiệm 23 Bảng 4: Bố trí nghiệm thức thí nghiệm 24 Bảng 5: Bố trí nghiệm thức thí nghiệm 25 Bảng 6: Bố trí nghiệm thức thí nghiệm 26 Bảng 7: Bố trí nghiệm thức thí nghiệm 27 Bảng 8: Lượng chất cho vào q trình thí nghiệm 42 Bảng 9: Kết đo OD dựng đường chuẩn glucose 42 Bảng 10: Bảng pha dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2) 43 Bảng 11: Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian ni cấy đến hoạt tính enzyme cellulase 49 Bảng 12: Phân tích phương sai Hoat tinh - TN1 49 Bảng 13: So sánh trung bình nghiệm thức - TN1 50 Bảng 14: Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến enzyme cellulase 51 Bảng 15: Phân tích phương sai Hoat tinh theo pH – TN2 51 Bảng 16: So sánh trung bình nghiệm thức - TN2 51 Bảng 17: Ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng (cellulose) hàm lượng chất bổ sung đến hoạt tính enzyme cellulase 51 Bảng 18: Phân tích phương sai Hoat tinh – Loại tổng bình phương – TN3 52 Bảng 19: So sánh trung bình nghiệm thức – TN3 52 Bảng 20: So sánh trung bình nghiệm thức– Đối chứng_TN3 53 Bảng 21: Ảnh hưởng hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào mơi trường ni cấy đến hoạt tính enzyme cellulase 53 Bảng 22: Phân tích phương sai Hoat tinh – Loại tổng bình phương – TN4 53 Bảng 23: So sánh trung bình nghiệm thức – TN4 54 Bảng 24: Ảnh hưởng nguồn nitơ hàm lượng nitơ bổ sung vào mơi trường ni cấy đến hoạt tính enzyme cellulase 54 Bảng 25: Phân tích phương sai Hoat tinh – Loại tổng bình phương – TN5 55 Bảng 26: So sánh trung bình nghiệm thức – TN5 55 Bảng 27: So sánh trung bình nghiệm thức – Đối chứng_TN5 55 Đại học An Giang – 2013 vii Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Danh sách hình Trang Hình 1: Cấu tạo phân tử cellulose Hình 2: Cấu trúc ligno-cellulose Hình 3: Cấu trúc CMC Hình 4: Cơ chế hoạt động 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase Hình 5: Cơ chế hoạt động 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase Hình 6: Cơ chế hoạt động β-D-glucoside glucohydrolase Hình 7: Nấm Aspergillus niger 11 Hình 8: Cấu trúc tinh thể endoglucanase (EC.3.2.1.4) từ Aspergillus niger 13 Hình 9: Quy trình sản xuất chế phẩm enzym cellulase từ nấm Aspergillus niger 20 Hình 10: : Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 28 Hình 11: Ảnh hưởng pH mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 30 Hình 12: : Ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng (cellulose) hàm lượng chất bổ sung vào mơi trường ni cấyđến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 31 Hình 13: : Ảnh hưởng hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 32 Hình 14: Ảnh hưởng nguồn nitơ hàm lượng nitơ bổ sung vào môi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 34 Hình 15: Đường chuẩn glucose 43 Hình 16: Mẫu bột giống sau nuôi cấy ngày 44 Hình 17: : Bột giống có mật độ bào tử 8,97.106 CFU /g bột bào tử 44 Hình 18: Mẫu ni cấy Aspergillus niger từ 13-24h 44 Hình 19: Mẫu nuôi cấy Aspergillus niger từ 38-48h 45 Hình 20: Dịch lọc enzyme thơ 45 Hình 21: Enzyme sau ủ với CMC 400C 30 phút 46 Hình 22: Dung dịch Na2CO3/NaHCO3 46 Hình 23: Hỗn hợp enzyme CMC sau cho dung dịch Na2CO3/NaHCO3 46 Hình 24: Hỗn hợp enzyme CMC xử lý 100 0C 47 Đại học An Giang – 2013 viii Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Cân xác 2g CMC khơ hịa tan vào 180 ml nước nóng 1800 C khuấy trộn đến hịa tan hồn tồn (khoảng giờ) Sau lọc dung dịch bình tam giác làm nguội đến nhiệt độ phòng Cho dung dịch axid axetic 0,1 N để chỉnh pH dung dịch Chuyển sang bình định mức 200 ml, thêm nước cho đủ 200 ml Lắc đảo 2.2.2 Pha hỗn hợp Na 2CO 3/NaHCO3 Hòa tan 54,28 g/l (512 nM) Na2CO3 24,2 g/l (288 nM) NaHCO3, cuối hỗn hợp có Ph = 10 2.3 Chuẩn bị thuốc thử Hòa tan 1,0 g 3,5-dinitrosalicylic acid vào 20 ml NaOH N (1) Hòa tan 30g muối sodium potassium tatrate (KNaC4H4O6) vào 50 ml nước (2) Trộn dung dịch (1) (2) lại thêm nước cất vào đủ 100 ml, dung dịch đựng chai tránh ánh sáng, đậy nấp kỹ tránh CO2 2.4 Tiến hành Cho ml CMC % vào ống tích 20 ml để ổn định 400 C Dung dịch enzyme ủ tương tự CMC kiện Sau cho 0,5 ml dung dịch vào ống chất ủ nhiệt độ 400 C 30 phút Kết thúc phản ứng phân cắt enzyme, lấy mẫu bể ủ nhiệt cho 50 µl dung dịch Na2CO3/NaHCO3 vào Và vô hoạt enzyme cách xử lý nhiệt bể ủ nhiệt 1000 C với thời gian phút Cho ml tác nhân khử DNS vào tuyp (18 × 150 mm) có chứa ml mẫu Xử lý nhiệt phút nhiệt độ sơi sau để nguội bể ủ nhiệt đến nhiệt độ phòng Cho 16 ml nước cất vào để làm loãng dung dịch đo OD bước sóng 540 nm Dùng nước cất làm đối chứng 2.5 Tính kết Đơn vị hoạt tính enzyme ml enzyme tính theo cơng thức:  X  Vhh  1000 U    T  VE  180 Trong : U: hoạt tính enzyme (UI/ml) Đơn vị enzyme quốc tế UI lượng enzyme có khả xúc tác làm chuyển hóa 1mol chất sau phút điều kiện tiêu chuẩn 1UI = 1mol chất (10 -6 mol)/phút X: hàm lượng glucose dung dịch đo (mg/ml) Vhh: thể tích hỗn hợp Đại học An Giang – 2013 41 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa T: thời gian phản ứng (30 phút) VE: thể tích enzyme (0,5) Xây dựng đường chuẩn glucose Cân g glucose (dạng khơ khơng ngậm nước) hịa tan vào 200 ml với nước cất sử dụng bình định mức Hút 0, 10, 20, 30, 40, 50 ml dung dịch đường pha vào bình định mức 50 ml Thêm nước cất vạch định mức Các dung dịch đường pha có nồng độ glucose ; 2; ; ; mg/ml Bảng 8: Lượng chất cho vào trình thí nghiệm ống ống ống ống ống ống 1(mẫu trắng) Chuẩn 1 1 Glucose 1%(ml) DNS(ml) 1 1 1 Thực phản ứng : Đầu tiên cho ml tác nhân khử DNS vào ống nghiệm, sau cho ml glucose vào ống nghiệm, cho chất vào Xử lý nhiệt phút nhiệt độ sơi sau để nguội bể ủ nhiệt đến nhiệt độ phịng Đo bước sóng 540 nm Bảng 9: Kết đo OD dựng đường chuẩn glucose Glucose (mg/ml) OD ĐC 0,058 0,566 1,166 1,721 2,331 2,961 Đại học An Giang – 2013 42 Độ hấp thu (OD) Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa y = 0,5695x R2 = 0,9972 3,5 2,5 1,5 0,5 Đường chuẩn Linear (Đường chuẩn) 0,0 2,0 4,0 6,0 Nồng độ glucose chuẩn (mg/ml) Hình 15: Đường chuẩn glucose Tạo pH thích hợp cho q trình ni cấy nấm Aspergillus niger dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2) - Dung dịch acid citric 0,1M (a): 21,01 g C6H8O7.H2O hòa tan định mức đến 1000 ml - Dung dịch trinatri citrate 0,1M (b): 29,41 g C6H5O7Na3.2H2O hòa tan dẫn nước đến 1000 ml Dung dịch đệm citrate có giá trị pH khác phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) số ml dung dịch (b) theo bảng sau: Bảng 10: Bảng pha dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2) a b pH a b pH 46,5 3,5 3,0 23,0 27,0 4,8 43,8 6,2 3,2 20,5 29,5 5,0 40,0 10 3,4 18,0 32,0 5,2 37,0 13 3,6 16,0 34,0 5,4 35,0 15 3,8 13,7 36,3 5,6 33,0 17 4,0 11,8 38,2 5,8 31,0 19 4,2 9,5 40,5 6,0 28,0 22 4,4 7,2 42,8 6,2 25,5 24,5 4,6 Ghi chú: Dùng pH kế để kiểm tra dung dịch đệm sau pha Đại học An Giang – 2013 43 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Phụ chương B Một số hình ảnh thí nghiệm Hình 16: Mẫu bột giống sau ni cấy ngày Hình 17: Bột giống có mật độ bào tử 8,97.106 CFU /g bột bào tử Hình 18: Mẫu nuôi cấy Aspergillus niger từ 13 – 24 h Đại học An Giang – 2013 44 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Hình 19: Mẫu ni cấy Aspergillus niger từ 38 – 48 h Hình 20: Dịch lọc enzyme thô Đại học An Giang – 2013 45 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Hình 21: Enzyme sau ủ với CMC 40 C 30 phút Hình 22: Dung dịch Na2CO3/NaHCO3 Đại học An Giang – 2013 Hình 23: Hỗn hợp enzyme CMC sau cho dung dịch Na2CO3/NaHCO3 46 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Hình 24: Hỗn hợp enzyme CMC xử lý 1000 C Hình 25: Mẫu enzyme (đã cho thuốc thử DNS) trước đun Đại học An Giang – 2013 47 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Hình 26: Mẫu enzyme (đã cho thuốc thử DNS) sau đun 1000 C Hình 27: Mẫu enzyme (đã cho thuốc thử DNS đun 1000 C) pha loãng với 16 ml nước cất dùng để đo OD Đại học An Giang – 2013 48 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Phụ chương C Kết phân tích thống kê 3.3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger Bảng 11: Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian ni cấy đến hoạt tính enzyme cellulase Hoạt tính cellulase Thời gian (giờ) Nhiệt độ (o C) trung bình (UI/ml) 30 11,238cd 13 35 8,850ef 40 8,912ef 30 15,370a 15 35 13,189bc 40 11,893bcd 30 13,556ab 24 35 8,467ef 40 8,702ef 30 6,918f 38 35 9,010ef 40 10,301de 30 7,867f 48 35 7,843f 40 11,226cd Ghi chú: Các số mang chữ số mũ giống cột khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê độ tin cậy 95 % Bảng 12: Phân tích phương sai Hoat tinh - TN1 Nguồn biến động Tổng bình Độ tự Trung bình F-Ratio P-Value phương bình phương Nhân tố A:Nhiệt độ 17.2866 8.64328 5.37 0.0101 B:Thời gian 132.148 33.0371 20.54 0.0000 Tương tác AB 102.078 12.7598 7.93 0.0000 Phần dư 48.2558 30 1.60853 Tổng chung 299.769 44 Đại học An Giang – 2013 49 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Bảng 13: So sánh trung bình nghiệm thức - TN1 Phương pháp: 95.0 phần trăm LSD Số lần Trung Nhóm tương đồng lặp lại bình A1t4 6.91833 X A2t5 A1t5 7.843 X 7.86667 X A2t3 8.46767 XX A3t3 8.70167 XX A2t1 8.84967 XX A3t1 8.91233 XX A2t4 9.00967 A3t4 10.3013 XX A3t5 11.2263 XX A1t1 A3t2 11.238 11.8933 XX XXX A2t2 A1t3 13.189 13.5557 XX XX XX A1t2 15.37 X 3.3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger Đại học An Giang – 2013 50 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Bảng 14: Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến enzyme cellulase pH Hoạt tính (UI/ml) 4,5 18,098 b 5,0 22,335 a 5,5 17,629 b 6,0 14,539 c Ghi chú: Các số mang chữ số mũ giống cột khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê độ tin cậy 95 % Bảng 15: Phân tích phương sai Hoat tinh theo pH – TN2 Nguồn biến động Tổng bình Độ tự Trung bình F-Ratio P-Value phương bình phương Giữa nhóm 92.4904 30.8301 25.12 0.0002 Trong nhóm 9.81845 1.22731 Tổng chung 102.309 11 Bảng 16: So sánh trung bình nghiệm thức - TN2 Phương pháp: 95.0 phần trăm LSD Số lần lặp lại Trung bình Nhóm tương đồng H4 14.539 X H3 17.6293 X H1 18.098 X H2 22.3353 X 3.3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng (cellulose) hàm lượng chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger Bảng 17: Ảnh hưởng nguồn chất cảm ứng (cellulose) hàm lượng chất bổ sung đến hoạt tính enzyme cellulase Hoạt tính (UI/ml) Loại Tỷ lệ Trung bình chất Vỏ bắp Bã mía Mùn cưa Rơm Trung bình (tỷ lệ) Đại học An Giang – 2013 (%) 10 20 13,825 14,676 16,720 20,427 16,412a 51 30 11,815 11,714 14,414 12,061 15,319 12,865 18,429 16,541 14,995b 13,295 c (cơ chất) 12,451 d 13,717 c 14,968 b 18,466 a Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Ghi chú: Các số mang chữ số mũ giống cột hàng khác biệt ý nghĩa mặt thống kê độ tin cậy 95 % Bảng 18: Phân tích phương sai Hoat tinh – Loại tổng bình phương – TN3 Nguồn biến động Tổng bình Độ tự Trung bình FPphương bình phương Ratio Value Nhân tố A:Cơ chất bổ sung 181.041 60.347 97.34 0.0000 B:Tỷ lệ 58.4409 29.2205 47.13 0.0000 Tương tác AB 8.01276 1.33546 2.15 0.0839 Phần dư 14.8798 24 0.619992 Tổng chung 262.374 35 Bảng 19: So sánh trung bình nghiệm thức – TN3 Phương pháp: 95.0 phần trăm LSD Số lần lặp lại Trung bình Nhóm tương đồng C1N3 11.714 X C1N2 11.8153 X C2N3 12.0613 XX C3N3 12.865 XXX C1N1 13.825 XXXX C2N2 14.4143 XXXX C2N1 14.6757 XXX C3N2 15.3197 XX C4N3 16.541 XX C3N1 16.72 XX C4N2 18.4297 X C4N1 18.7095 X Đại học An Giang – 2013 52 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Bảng 20: So sánh trung bình nghiệm thức– Đối chứng_TN3 Phương pháp: 95.0 phần trăm LSD Số lần lặp lại Trung bình Nhóm tương đồng Đối chứng 7,223 X Vỏ bắp 12,451 X Bã mía 13,717 X Mùn cưa 14,968 X Rơm 18,466 X 3.3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger Bảng 21: Ảnh hưởng hàm lượng đường (glucose) bổ sung vào mơi trường ni cấy đến hoạt tính enzyme cellulase Tỷ lệ glucose bổ Hoạt tính sung 0,0% 16,966b 0,1% 19,121a 0,2% 15,572b 0,4% 15,818b 0,6% 12,649c Ghi chú: Các số mang chữ số mũ giống cột khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê độ tin cậy 95 % Bảng 22: Phân tích phương sai Hoat tinh – Loại tổng bình phương – TN4 Nguồn biến động Tổng Độ tự Trung bình F-Ratio P-Value bình bình phương phương Nhân tố A:Tỷ lệ glucose bổ sung 66.3349 16.5837 18.39 0.0001 Phần dư 9.01953 10 0.901953 Tổng chung 75.3544 14 Đại học An Giang – 2013 53 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Bảng 23: So sánh trung bình nghiệm thức – TN4 Phương pháp: 95.0 phần trăm LSD Số lần lặp lại Trung bình Nhóm tương đồng G5 12.6493 X G3 15.5717 X G4 15.8177 X G1 16.9657 X G2 19.1207 X 3.3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ hàm lượng nitơ bổ sung vào môi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger Bảng 24: Ảnh hưởng nguồn nitơ hàm lượng nitơ bổ sung vào mơi trường ni cấy đến hoạt tính enzyme cellulase Hoạt tính cellulase Loại nitơ bổ sung Tỷ lệ (%) trung bình (UI/ml) 0,1 20,187bc Urea 0,2 19,830bc 0,3 16,638e 0,1 18,652cde (NH4)2SO4 0,2 19,405bcd 0,3 21,360b 0,1 19,807bc NaNO3 0,2 17,122de 0,3 16,873e 0,1 26,569a Pepton 0,2 20,595bc 0,3 18,281cde Ghi chú: Các số mang chữ số mũ giống cột khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê độ tin cậy 95 % Đại học An Giang – 2013 54 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp khoa Bảng 25: Phân tích phương sai Hoat tinh – Loại tổng bình phương – TN5 Nguồn biến động Tổng bình Độ Trung bình F-Ratio P-Value phương tự bình phương Nhân tố A:Nguồn nitơ bổ sung 74.1147 24.7049 11.69 0.0001 B:Tỷ lệ 57.0534 28.5267 13.50 0.0001 Tương tác AB 103.189 17.1981 8.14 0.0001 Phần dư 50.7125 24 2.11302 Tổng chung 285.069 35 Bảng 26: So sánh trung bình nghiệm thức – TN5 Phương pháp: 95.0 phần trăm LSD Số lần lặp lại Trung bình Nhóm tương đồng I4D3 16.6387 X I2D3 16.8723 X I2D2 17.1223 XX I3D3 18.281 XXX I1D1 18.652 XXX I1D2 19.4047 XXX I2D1 19.8067 XX I4D2 19.8307 XX I4D1 20.187 XX I3D2 20.595 XX I1D3 21.36 X I3D1 26.569 X Bảng 27: So sánh trung bình nghiệm thức – Đối chứng_TN5 Phương pháp: 95.0 phần trăm LSD Số lần lặp lại Trung bình Nhóm tương đồng Đối chứng 9,833 X Natri nitrate 17,934 X Urea 18,885 X Amonium sufate 19,806 X Pepton 21,815 X Đại học An Giang – 2013 55 ... cấy cho Aspergillus niger sinh tổng hợp cellulase hiệu suất cịn giới hạn Vì đề tài ? ?Khảo sát số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme cellulase nấm mốc Aspergillus niger? ?? tiến... đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger 49 3.3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng pH mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger. .. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger - Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến trình sinh tổng