cellulase
+ Xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của cellulase
Cho cellulase phản ứng với CMC trong 30 phút trong các dung dịch đệm (dung dịch NaOH 1N và HCl 1N) có pH khác nhau từ 2-7. Xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
+ Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của cellulase
Cho dịch cellulase và dung d ịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các nhiệt độ khác nhau từ 250C- 400C trong 30 giờ. Hoạt tính cellulase được xác định theo phương pháp cấy chấm điểm.
+ Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Cho dịch cellulase và dung d ịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các mức thời gian khác nhau từ 1-5 ngày. Sau mỗi ngày xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp cấy chấm điểm.
+ Xác định ảnh hưởng của các nguồn nitơ
Nuôi cấy các chủng tuyển chọn trên môi trường Czapek- Dox thích hợp với nguồn nitơ được sử dụng lần lượt là: NaNO3, NaNO2, NH4Cl, (NH4)2SO4 trong thời gian là 4 ngày. Sau đó lấy dịch nuôi cấy đem li tâm loại bỏ sinh khối. Xác định hoạt tính cellulase trong dịch nuôi cấy theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose
Theo các phương pháp nghiên cứu như trên chúng tôi đã phân lập được 30 chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase, kết quả này cho thấy các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose ở Vĩnh Phúc khá là đa dạng. Hoạt tính phân giải cellulose của các chủng nấm mốc được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose (D-d, cm) TTT Chủng vi sinh vật Hoạt tính STT Chủng vi sinh vật Hoạt tính 1 M1-1 0,6 16 M5-3 2,0 2 M1-2 1,3 17 M5-6 1,3 3 M1-3 0,5 18 M6-1 1,8 4 M1-4 1,1 19 M6-2 1,1 5 M2-1 0,7 20 M6-3 1,0 6 M2-2 1,2 21 M6-4 0,6 7 M2-3 0,5 22 M7-1 0,7 8 M3 2,2 23 M7-2 1,3 9 M3-2 1,0 24 M7-3 1,5 10 M3-3 1,2 25 M8-1 0,5 11 M3-6 1,1 26 M8-2 0,6 12 M4-1 1,0 27 M8-3 0,7 13 M4-2 0,8 28 M9-1 1,2 14 M4-3 0,7 29 M9-2 1,3 15 M5-1 0,8 30 M9-3 1,4
Hình 3.1. Khả năng sinh cellulase của một số chủng nấm mốc đƣợc phân lập
Từ bảng trên cho thấy tất cả 30 chủng đều có hoạt tính phân giải cellulose. Chủng M1-3, M2-3, M8-1 có hoạt tính phân giải cellulose là thấp nhất (D-d= 0,5cm). Các chủng M3, M5-3, M6-1 có hoạt tính phân giải cellulose khá mạnh với D-d lần lượt là: 2,2cm, 2,0cm, 1,8cm. Chúng tôi quyết định lựa chọn 2 chủng M3 và M6-1 để tiếp tục nghiên cứu một số yếu tố môi trường có ảnh hưởng đến khả năng sinh cellulase của chúng.
Bằng phương pháp nhận diện truyền thống, chúng tôi đã bước đầu xác định được một số đặc điểm về hình thái của 2 chủng nấm mốc M3 và M6-1. Từ kết quả đó chúng tôi đem so sánh với các đặc điểm của các chi, loài trong các khóa phân loại và thấy:
- Chủng M3 có những đặc điểm giống với chi Penicillium (Samson và ctv, 1995) như: trên môi trường Crapek- Dox khuẩn lạc màu xanh lục, xanh đen, mặt sau khuẩn lạc có màu nâu tối, giá bào tử trần phân nhánh, bông nấm hình cột dạng xẻ thùy, thể bình thuộc dạng lưỡng tầng, bào tử có hình ovan đến hình cầu.
- Chủng M6-1có những đặc điểm rất giống với chi Aspergillus (Raper & Fennell, 1965) như: trên môi trường Crapek- Dox khuẩn lạc màu vàng hoa cau, màu đen nâu, mặt sau màu vàng tối, giá bào tử trần không phân nhánh, thẳng, nhẵn hoặc hơi ráp, bông nấm màu đen hơi nâu, hình bán cầu cho đến hình cầu, bọng đỉnh giá hình gần cầu, chỉ có một lớp thể bình, bào tử trần hình cầu, elip, hơi nhẵn hoặc nhẵn [18].
Mặt trước khuẩn lạc của chủng M3 Mặt trước khuẩn lạc của chủng M6-1
Bông nấm (X10) của chủng M3 Bông nấm (X40) của chủng M6-1
Bào tử (X40) của chủng M3 Bào tử (X100) của chủng M6-1
3.2. Ảnh hƣởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng M3 và M6-1
3.2.1. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh cellulase
Tiến hành nuôi cấy chủng Penicillium M3, Aspergillus M6-1 trong môi trường Czapek- Dox thích hợp (phần 2.1.2.1) rồi xác định hoạt tính phân giải cellulose theo phương pháp cấy chấm điểm (phần 2.2.2.1). Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.3.
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính cellulase
pH M3 (D-d, cm) M6-1 (D-d, cm) 2 0,6 0,5 3 1,0 0,7 4 1,9 1,5 5 2,3 1,8 6 1,2 0,9 7 0,9 0,8
Từ kết quả trên cho thấy pH ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh cellulase. Khả năng sinh cellulase tăng dần từ pH= 2- pH= 5, sau đó giảm dần từ pH=5- pH= 7. Cả 2 chủng Penicillium M3 và Aspergillus M6-1 sinh cellulase mạnh nhất ở điều kiện môi trường pH= 5. Tuy nhiên chủng M3 có khả năng sinh cellulase mạnh hơn so với chủng M6-1.
Khả năng sinh trưởng và sinh cellulase của hai chủng Penicillium M3 và Aspergillus M6-1 tốt nhất ở điều kiện môi trường axit, chúng có khả năng sinh cellulase ngay cả khi pH= 2.
Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu trước đây, các chủng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong khoảng pH= 4,5-6,0 [11].
3.2.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy hai chủng Penicillium M3 và Aspergillus
M6-1 trong môi trường Czapek- Dox thích hợp (phần 2.1.2.1) ở các nhiệt độ được chọn là: 250
C, 300C, 350C, 400C. Hoạt tính phân giải cellulose được xác định theo phương pháp cấy chấm điểm (phần 2.2.2.1). Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.4.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính cellulase
Nhiệt độ M3 (D-d, cm) M6-1 (D-d, cm) 25 1,1 0,6 30 2,2 1,6 35 2,0 0,9 40 1,5 0,8
Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính cellulase
Kết quả cho thấy cả hai chủng Penicillium M3 và Aspergillus M6-1 đều sinh tổng hợp cellulase ở dải nhiệt độ từ 250C- 400C. Tuy nhiên khả năng sinh tổng hợp cellulase của 2 chủng mạnh nhất là ở 300C. Khả năng phân giải cellulose của 2 chủng giảm dần từ 300C- 400C. Chủng M3 sinh cellulase mạnh hơn chủng M6-1.
Các chủng nấm thường là các chủng ưa ấm và nhiệt độ tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp cellulase là 300
C trong các nhiệt độ khảo sát. Những nghiên cứu trước đây cho thấy, các chủng nấm khác cũng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở dải nhiệt độ 31oC- 34oC [11].
Hình 3.5. Khả năng sinh cellulase của chủng M3 và M6-1 ở 250
C và 300C
3.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase
Hai chủng M3 và M6-1 được nuôi cấy trên môi trường Czapek- Dox (phần 2.1.2.1) ở các mức thời gian khác nhau từ 1-5 ngày. Sau đó xác định hoạt tính phân giải cellulose theo phương pháp cấy chấm điểm (phần 2.2.2.1). Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.6.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase Thời gian (ngày) M3 (D-d, cm) M6-1 (D-d, cm)
1 0,41 0,35 2 0,8 0,6 3 0,9 0,68 4 1,2 0,9 5 0,7 0,63 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 (ngày) 1 2 3 4 5 D -d ,c m
Thời gian (ngày)
M3 M6-1
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian đến hoạt tính cellulase
Qua số liệu ở bảng 3.4 và hình 3.6, cho thấy hoạt tính cellulase của hai chủng tăng dần theo thời gian và cả hai chủng đều đạt giá trị cực đại sau ngày nuôi cấy thứ 4, sau đó giảm dần ở ngày nuôi cấy tiếp theo. Chủng M3 có hoạt tính phân giải cellulose mạnh hơn so với chủng M6-1.
Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây trên các chủng nấm sợi ưa ấm sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 72 giờ – 96 giờ nuôi cấy. Cả hai chủng Penicillium M3, Aspergillus M6-1 có thời gian và khả năng sinh tổng hợp cellulase tương đương với các chủng nấm sợi đã nghiên cứu.
Như vậy thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai chủng được tuyển chọn.
3.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase
Để phân giải polysaccarit khó phân giải như cellulose thì tế bào vi sinh vật phải tổng hợp một lượng lớn cellulase, vì thế quá trình sinh tổng hợp có thể cần tới lượng lớn nitơ, có chủng có thể sử dụng tới 60% nitơ tổng số cho việc sản xuất enzyme. Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng nấm mốc có ý nghĩa quan trọng.
Hai chủng nấm Penicillium M3, Aspergillus M6-1 được nuôi cấy trên môi trường Czapek- Dox thích hợp (phần 2.1.2.1) với các nguồn nitơ được sử dụng lần lượt là: NaNO3, NaNO2, NH4Cl, (NH4)2SO4 . Sau đó, lấy dịch nuôi cấy đem li tâm loại bỏ sinh khối. Xác định hoạt tính phân giải cellulose trong dịch nuôi cấy theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch (phần 2.2.2.2). Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.7.
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase Nguồn nitơ M3 (D-d, cm) M6-1 (D-d, cm) NaNO3 2,1 1,5 NaNO2 1,6 0,9 NH4Cl 1,8 1,3 (NH4)2SO4 2,0 1,2
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase
Mức độ sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của 2 chủng nấm mốc trên các nguồn nitơ là rất khác nhau. Kết quả cho thấy mặc dù cả 2 chủng đều có khả năng sử dụng nhiều nguồn nitơ nhưng NaNO3 là nguồn nitơ tốt nhất cho cả hai chủng sinh tổng hợp cellulase. Điều này phù hợp với nhiều nghiên cứu cho rằng nitrat là nguồn nitơ thích hợp để tổng hợp cellulase ở nhiều nấm sợi như Aspergillus, Trichoderma.
Khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng M3 mạnh hơn so với chủng M6-1 ở các nguồn nitơ khác nhau.
Hình 3.8. Khả năng sinh cellulase của chủng Penicillium M3 và Aspergillus M6-1 trên nguồn nitơ là NaNO3
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Từ 30 chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase được phòng thí nghiệm vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2 phân lập từ các mẫu rác thải, cành gỗ, lá cây, rơm rạ mục, đất mùn ở Vĩnh Phúc, đã tuyển chọn được 3 chủng M3, M5-3 và M6-1 có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao nhất.
1.2. Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh lí, sinh hóa và đặc tính sinh học của hai chủng M3, M6-1. Định loại đến chi và đặt tên là
Penicillium M3 (Samson và ctv, 1995), Aspergillus M6-1 (Raper & Fennell, 1965).
1.3. Tiến hành nghiên cứu một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai chủng M3, M6-1 và rút ra điều kiện môi trường nuôi cấy tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp cellulase của hai chủng là:
- pH thích hợp là pH= 5 - Nhiệt độ thích hợp là 300C - Thời gian nuôi cấy: 4 ngày - Nguồn nitơ tốt nhất là NaNO3
2. Kiến nghị
Trên đây là một số kết quả nghiên cứu bước đầu trong việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy của hai chủng M3 và M6-1 nhằm sinh cellulase là nhiều nhất. Để có được chế phẩm cellulase ứng dụng vào thực tiễn cần giải quyết các vấn đề sau:
2.1. Tiếp tục nghiên cứu thêm một số điều kiện nuôi cấy tối ưu của hai chủng trên như: độ ẩm, nguồn cac bon tự nhiên…
2.2. Tiếp tục nghiên cứu các đặc tính cellulase của hai chủng M3 và M6-1 để định hướng cho các ứng dụng tiếp theo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
A. Tài liệu tiếng việt
1. Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lƣơng Thị Thùy Dƣơng,
Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các chủng nấm men có khả năng phân giải cellulose nhằm ứng dụng trong xử lý bã thải hoa quả làm thức ăn chăn nuôi. Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.
2. Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (1992), Hóa sinh học. Nxb Giáo
dục, tr. 80 - 81.
3.Tăng Thị Chính, Lý Kim Bằng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên cứu sản xuất
cellulase của một số chủng vi sinh vật ưu nhiệt phân lập từ bể ủ rác. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ sinh học Toàn quốc. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 790 - 797.
4. Nguyễn Lân Dũng (1976), Góp phần nghiên cứu cải tiến cơ cấu thức ăn
chănnuôi lợn, Báo cáo tại Hội nghị Khoa Học, Trường Đại học Tổng Hợp.
5. Nguyễn Lân Dũng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập
1-2-3. Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr. 325 - 347.
6. Nguyễn Lân Dũng (1994), Nghiên cứu khả năng phân giải cellulose của
mộtsố chủng vi sinh vật phân lập ở Việt Nam. Báo cáo tại Hội nghị Khoa học ủy ban Khoa học Kỹ thuật nông nghiệp.
7. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thế Hòa, Nguyễn Anh Bảo (1991), Điều
kiện sinh khối nấm sợi Aspergillus hennebergii TH 386 trên môi trường xốp sắn ngô, tạp chí nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm.
8. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thế Hòa, Nguyễn Anh Bảo, Lê Chí Công
(1993), Nghiên cứu khả năng tích lũy sinh khối của chủng Aspergillus hennbergii TH 386 trên môi trường nuôi cấy dịch thể chứa bột sắn sống, tạp chí Sinh học, tr. 3-7.
10. Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vƣơng Trọng Hào (1990),
Thực hành vi sinh vật. Nxb Giáo dục.
11. Đặng Minh Hằng (1999), Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả
năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi sinh vật để xử lý rác. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, tr. 333 - 339.
12. Nguyễn Đức Lƣợng, Cao Tƣờng, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Anh, Nguyễn Thúy Hƣơng, Phan Thị
Huyền, Công nghệ enzyme. Nxb Đại học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh.
13. Th.s Đỗ Hữu Phƣơng, Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, số
3/2004.
14. Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hƣng, Phạm Văn Toản (2003), Công
nghệ vi sinh vật trong sản xuất nông nghiệp và xử lý môi trường. Nxb Nông nghiệp.
15. TS. Trần Cẩm Vân, Giáo trình Vi sinh vật học môi trường. Nxb Đại học
Quốc gia Hà Nội, tr. 9 - 63.
B. Tài liệu tiếng anh
16. Hrmova M, Fincher GB (2009), Plant and microbial enzymes involved
in the depolymerisation of (1,3)-β-D-glucans and related polysaccharides. In: Chemistry, Biochemistry and Biology of (1,3)-β-D-Glucans and Related Polysaccharides, Academic Press, Elsevier Inc., San Diego, USA, 677 pp, 16 color plates (Bacic T, Fincher GB, Stone BA, eds), pp 119-170.
17. Robert A. Samson, John I. Pitt (2000), Integration of modern taxonomic
methods for Penicillium and Aspergillus classification, p: 83- 113.
18. Raper và Fennell, (1965), The Genus Aspergillus, The williiams & Wikins Company 428 E. Preston street Baltimore, Md. 21202 U.S.A, 570pp.