6. Đóng góp của đề tài
2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu
Số thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng 1 2 3 Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2,0 Tổng cộng 4,0
Bảng 2.3. Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm
Số thứ
tự
Mức chất
lượng Số điểm chung
Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chưa có trọng lượng của hội đồng cảm quan
1 Loại tốt 18,6 – 20,0 Mùi : 4,8
Vị : 4,8
2 Loại khá 15,2 – 18,5 Mùi : 3,8
Vị : 3,8
3 Loại trung bình 11,2 – 15,1 Mỗi chỉ tiêu : 2,8
4 Loại kém 7,2 – 11,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,8
5 Loại rất kém 4,0 – 7,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,0
6 Loại hỏng 0 – 3,9 Mỗi chỉ tiêu nhỏ hơn 1,0
2.2.4
Xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp trong cuốn “Thống kê và ứng dụng” [1] nhƣ:
* Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm. 1 1 n i i X X n
* Trung bình bình phƣơng các sai lệch
1 ) ( 1 2 n X X n i i * Sai số đại diện của trung bình cộng m
n
* Hệ số biến thiên trung bình cộng:
X x
Cv 100
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập các lên men kombucha từ trà Thái Nguyên
Bước 1: Nguyên liệu sử dụng là trà Thái Nguyên và đƣờng để sản xuất
kombucha. Trƣớc hết cần đun sôi 1000ml nƣớc, bổ sung 20g trà Thái Nguyên để trong thời gian 10-15 phút. Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh
sạch, thêm 100g đƣờng khuấy đều, để nguội. Sau khoảng 7 ngày ở 300
C ta thu đƣợc kombucha, bao gồm dịch trà đƣờng lên men và miếng thạch nổi lên trên bề mặt.
Dùng vải sạch lọc lấy dịch, tiến hành phân lập vi khuẩn trên môi trƣờng
1 theo phƣơng pháp của Vinogradski (phương pháp 2.2.1.1.1). Kết quả phân
lập đƣợc 20 mẫu (ký hiệu lần lƣợt là A1, A2, …, A20).
Môi trƣờng 1 dùng để phân lập vi khuẩn đƣợc acid hoá bằng acid acetic cũng góp phần ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật khác. Tuy nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn có thể sống trong môi trƣờng có độ pH thấp.
Bước 2: Nhuộm Gram 20 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn đƣợc (phương
pháp 2.2.1.1.2), kết quả cho thấy khi quan sát trên kính hiển vi quang học tất cả các mẫu vi khuẩn đều bắt màu hồng với thuốc nhuộm. Điều này chứng tỏ rằng các mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn đƣợc đều là Gram âm. Các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha thuộc rất nhiều nhóm khác nhau, bao gồm cả nhóm vi khuẩn Gram dƣơng( vi khuẩn lactic) và nhóm vi khuẩn Gram âm( vi khuẩn Acetobacter). Vì các mẫu vi khuẩn phân lập đƣợc đều là vi khuẩn Gram âm, chính vì vậy chúng tôi quyết định tuyển chọn các mẫu vi khuẩn Acetobacter có khả năng lên men kombucha phục vụ cho mục đích nghiên cứu của đề tài. Bƣớc tiếp theo chúng tôi tiến hành sơ tuyển bằng cách lựa chọn các mẫu vi khuẩn có khả năng chuyển hóa ethanol thành acid acetic.
Hình 3.1. Ảnh mẫu vi khuẩn A15 nhuộm Gram
Bước 3: Từ 20 mẫu vi khuẩn đã chọn đƣợc ở bƣớc 2 tiếp tục tiến hành
tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter theo phƣơng pháp của Carr (1968) [24]
(phương pháp 2.2.2.2).
Hình 3.2. Chuyển hoá ethanol thành acid acetic của các mẫu vi khuẩn
Theo Bergey (1992) 16 vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae
gồm 2 chi là Acetobacter và Gluconobacter. Cả hai chi đều có khả năng oxy
hoá ethanol thành acid acetic. Acid acetic làm môi trƣờng có chứa Blue
Bromophenol 0.04% chuyển từ màu xanh lục sang màu vàng (hình 3.1). Các
chủng thuộc chi Acetobacter có khả năng phân giải tiếp tục acid acetic thành
CO2 và H2O phục hồi màu xanh của môi trƣờng. Ngƣợc lại, các chủng thuộc
chi Gluconobacter không có khả năng phân giải acid acetic nên môi trƣờng vẫn giữ màu vàng.
Hầu hết các mẫu vi khuẩn đã phân lập đƣợc đều có khả năng oxy hoá
chủng. Hơn nữa các chủng đã phân lập đƣợc gồm 2 nhóm có tốc độ sinh trƣởng khác nhau (nhóm sinh trƣởng nhanh và nhóm sinh trƣởng chậm) do đó việc theo dõi khả năng phục hồi màu xanh của môi trƣờng để phân biệt 2 chi
Acetobacter và Gluconobacter rất khó khăn, thiếu chính xác. Vì thế, sau bƣớc 3 lựa chọn các chủng làm môi trƣờng chuyển màu vàng và tiếp tục khảo sát
khả năng oxy hoá acetate nhằm phân biệt các chủng thuộc 2 chi Acetobacter
và Gluconobacter. Kết quả thu đƣợc 11 mẫu là: A1, A2, A3, A5, A6, A7, A8, A13, A15, A18, A19
Bước 4: Với 11 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn đƣợc chúng tôi tiếp tục
xác định khả năng tạo thành acid bằng cách cấy trên môi trƣờng thạch đĩa
(môi trƣờng 1)có bổ sung thêm CaCO3 7g/l (phương pháp 2.2.2.3). Các mẫu
vi khuẩn có khả năng sinh acid, acid này phân giải CaCO3 trong môi trƣờng
do đó xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng sáng nhỏ trong suốt. Vòng sáng
xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng có chứa CaCO3 điều đó cho
thấy acid đã đƣợc tạo thành. Chúng tham gia phản ứng với CaCO3 để chuyển
môi trƣờng từ màu trắng sang không màu theo phƣơng trình: H+ + CaCO3 → Ca2+ + H2O + CO2
Theo Bergey (1992) [16], cả 2 chi Acetobacter và Glucobacter đều có
khả năng oxy hoá lactate nhƣng chỉ có các vi khuẩn thuộc chi Acetobacter
mới có khả năng oxy hoá acetate. Vì thế, trong môi trƣờng có chứa calcium acetate, các chủng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter có khả năng sử dụng muối acetate làm nguồn cácbon hay nói cách khác chúng có khả năng oxy hoá acid acetic thành CO2 và H2O; giải phóng ATP. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Hai-Peng Cheng và cs (2002) [25] khi xác định sự có mặt của acid gluconic trong tổng hợp cellulose. Kết quả thu đƣợc 9 mẫu là: A1, A2, A3, A6, A8, A13, A15, A18, A19.
Từ các kết quả trên cho thấy, 9 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn đƣợc là các
Hình 3.3. Khả năng oxy hoá acetate
Bước 5:Kiểm tra hoạt tính catalase (phương pháp 2.2.2.1) thu đƣợc kết
quả là cả 9 mẫu vi khuẩnđều có phản ứng catalase dƣơng tính.
Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tƣợng sủi bọt khí (hình 3.3). Chứng tỏ oxy đƣợc giải phóng ra, hay nói cách khác dƣới tác dụng của enzyme catalase phân giải H2O2 theo phƣơng trình:
2 2 2 2 1 2 Catalase H O H O O
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter
Bước 6: Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone
(phương pháp 2.2.2.4).
Vi khuẩn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 300C trong vòng 48h. Nhỏ dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone.
Bước 7: Khả năng sinh sắc tố nâu
Khi nuôi cấy 9 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn trên môi trƣờng thạch và dịch thể, không thấy hình thành sắc tố nâu, điều đó chứng tỏ rằng những
chủng vi khuẩn Acetobacter không hình thành sản phẩm 2,5-dixeto gluconic
acid và - propyonic cho nên dịch nuôi cấy không màu. Kết quả: 9 mẫu vi khuẩn đều không thấy hình thành sắc tố nâu.
Bước 8: Sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer (phương pháp 2.2.2.5).
Khi nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter trên môi trƣờng Hoyer theo dõi bằng cách lấy dịch nuôi cấy đếm số lƣợng tế bào vi khuẩn trên buồng đếm cho thấy số lƣợng 6 mẫu vi khuẩn không tăng. Môi trƣờng Hoyer là môi
trƣờng chỉ bao gồm các nhân tố khoáng, 6 mẫu vi khuẩn Acetobacter sử dụng
muối (NH4)2SO4 nhƣ là nguồn nitơ và rƣợu êtylic nhƣ là nguồn cacbon để duy trì sự tồn tại của tế bào, mà không tăng sinh khối tế bào.
Điều này có thể giải thích nhƣ sau: Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung
[2] và Nguyễn Thành Đạt [10] 6 mẫu Acetobacter này thuộc nhóm vi sinh vật
khuyết dƣỡng, điều kiện cho chúng sinh trƣởng tăng sinh khối khi môi trƣờng nuôi cấy đƣợc bổ sung các chất kích thích sinh trƣởng (acid folic, các loại vitamin B5, B6, B12...). Kết quả thí nghiệm cho thấy 6 mẫu vi khuẩn không có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer là: A1, A2, A3, A6, A15, A19.
Bước 9: Khả năng tổng hợp cellulose (phương pháp 2.2.2.6).
Quan sát sự tạo thành màng ta thấy:
Nhóm 1: Tạo thành màng nhầy nhẵn, không đƣợc nâng lên theo thành bình (gồm các mẫu vi khuẩn: A8, A13).
Nhóm 2: Tạo màng nhẵn dai, đƣợc nâng lên theo thành bình ( gồm các mẫu vi khuẩn: A1, A3, A6, A15).
Nhóm 3: Tạo màng khô và nhăn nheo, đƣợc nâng lên theo thành bình (gồm các mẫu vi khuẩn: A2, A19).
Nhỏ dung dịch Lugol và H2SO4 60% lên mặt lớp màng của 9 mẫu vi khuẩn, trong đó có 4 mẫu màng vi khuẩn của nhóm 2 xuất hiện màu lam. Do màng của vi khuẩn nhóm 2 tạo thành có bản chất là cellulose nên màng này sẽ bắt màu xanh với iốt (hình 3.5).
Hình 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulose của vi khuẩn Acetobacter nhóm 2
Từ 20 mẫu vi khuẩn phân lập được, tuyển chọn sơ bộ được 9 mẫu vi khuẩn thuộc chi (giống) Acetobacter, họ Acetobacteriaceae là: A1, A2, A3, A6, A8, A13, A15, A18, A19.
có khả năng lên men kombucha
3.2.1. Xác định hàm lượng acid tổng số được tạo ra của mỗi chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn
Trong quá trình lên men kombucha không chỉ có sản phẩm acid acetic
do vi khuẩn Acetobacter tạo ra mà còn có nhiều sản phẩm acid khác. Vì vậy
khi nghiên cứu quá trình lên men kombucha tôi xác định hàm lƣợng acid tổng số tạo ra.
Sau khi tuyển chọn sơ bộ đƣợc 9 mẫu vi khuẩn Acetobacter chúng tôi
tiến hành nuôi cấy 9 chủng này trên môi trƣờng 3, ở nhiệt độ 300
C sau 7 ngày lên men. Chuẩn độ xác định hàm lƣợng acid tổng số tạo thành, lặp lại 3 lần một mẫu, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 9 chủng vi khuẩn Acetocbacter
STT Chủng M±m δ(%) Cv(%) 1 A1 29,12±0,012 0,021 0,072 2 A2 32,97±0,036 0,063 0,191 3 A3 30,01±0,021 0,037 0,123 4 A6 27,93±0,020 0,035 0,118 5 A8 25,01±0,027 0,046 0,128 6 A13 31,13±0,017 0,03 0,096 7 A15 33,00±0,040 0,069 0,209 8 A18 32,13±0,000 0,000 0,000 9 A19 29,92±0,021 0,037 0,124
Qua bảng 3.1 nhận thấy 9 mẫu vi khuẩn Acetobacter thí nghiệm đều có
khả năng oxy hóa ethanol tạo thành acid acetic. Hàm lƣợng acid tổng số có trong dịch lên men từ 25,01 đến 33,00 (g/l). Các mẫu vi khuẩn khác nhau tạo
ra hàm lƣợng acid acetic khác nhau, trong đó thấp nhất là mẫu vi khuẩn A8,
cao nhất là mẫu A15. Với mục đích tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên men kombucha có chất lƣợng tốt, tôi tiến hành đánh giá chất lƣợng sản phẩm thu đƣợc từ 9 chủng vi khuẩn trên bằng phƣơng pháp cảm quan.
3.2.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha
Sau 7 ngày lên men chúng tôi tiến hành đánh giá chất lƣợng sản phẩm
kombucha tạo ra từ 9 chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn đƣợc bằng
phƣơng pháp cảm quan dựa trên các tiêu chí đƣa ra ở bảng 2.1, 2.2, 2.3
Bảng 3. 2. Khả năng tạo độ trong, hương thơm và mùi vị đặc trưng của kombucha từ 9 chủng vi khuẩn Acetobacter
STT Chỉ tiêu đánh giá Chủng A1 A2 A3 A6 A8 A13 A15 A18 A19 1 Độ trong và màu sắc 2,8 3,6 1,8 3,4 2,0 3,6 3,6 3,2 3,6 2 Mùi 4,2 5,6 2,4 3,6 2,9 4,8 5,6 4,9 4,8 3 Vị 6,0 9,4 5,0 6,8 5,0 8,2 9,4 6,2 7,4 4 Tổng điểm 13,0 18,6 9,2 13,8 9,9 16,6 18,6 14,3 15,8
Kết quả cho thấy đa số mẫu vi khuẩn Acetobacter đều cho chất lƣợng
kombucha có màu vàng tƣơi, mùi vị đặc trƣng tùy theo các mức độ khác nhau. Có thể phân chia các mẫu thành 3 loại sau:
Loại 1: Sản phẩm có chất lƣợng tốt, mùi vị đặc trƣng, màu vàng tƣơi, hƣơng thơm mát dịu gồm các chủng: A2, A15.
Loại 2: Sản phẩm có chất lƣợng khá và trung bình, có mùi đặc trƣng thì vị chua gắt, có vị đặc trƣng thì lại không có mùi thơm, màu sắc tƣơng đối, gồm các chủng: A1, A6, A13, A18, A19.
Loại 3: Sản phẩm có chất lƣợng kém, không có mùi vị đặc trƣng, màu vàng sẫm, gồm các chủng: A3, A8.
Từ kết quả ở bảng 3.1 kết hợp với bảng 3.2 nhận thấy 2 chủng vi khuẩn
Acetobacter A2 và A15 có khả năng sinh acid cao và chất lƣợng sản phẩm kombucha tạo ra thơm, ngon, đặc trƣng nên tôi quyết định tuyển chọn 2 chủng này làm đối tƣợng nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả đã phân lập được 20 mẫu vi khuẩn lên men kombucha từ trà Thái Nguyên, tuyển chọn sơ bộ được 9 chủng vi khuẩn Acetobacter. Các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được dùng để lên men kombucha tạo ra hàm lượng acid và tạo ra sản phẩm có chất lượng khác nhau. Trong số các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được có 2 chủng vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 tạo
ra hàm lượng acid cao nhất, lên men tạo sản phẩm kombucha thơm, ngon, đặc trưng.
3.2.3. Phân loại các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn để lên men kombucha
Để tiến hành phân loại các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn chúng tôi cần tiến hành nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn đó.
3.2.3.1. Hình thái và tế bào học
Để quan sát hình dạng tế bào 9 chủng vi khuẩn Acetobacter chúng tôi
tiến hành làm tiêu bản nhuộm Gram với dịch nuôi cấy của vi khuẩn trên, sau đó soi trên kính hiển vi Olympus CX31 với độ phóng đại 1000 lần. Kết quả cho thấy 9 mẫu Acetobacter đều là Gram âm, có dạng hình que ngắn, hình elip đầu tròn đều với kích thƣớc trung bình 1,5 – 2,5 µm, tế bào xếp dạng đơn, đôi, hoặc chuỗi ngắn.
Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.6. Hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên kính hiển quang học(x1000 lần)
3.2.3.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa
Vi khuẩn Acetobacter khi nuôi cấy trên môi trƣờng đặc sau 3 ngày sẽ
hình thành các khuẩn lạc đặc trƣng, khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng tròn, màu trắng đục, đa số bề mặt khuẩn lạc trơn bóng, cấu trúc khuẩn lạc đồng nhất, kích thƣớc trung bình của khuẩn lạc 1 – 2 mm.
Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.7. Khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên môi trường thạch đĩa
Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.8. Mẫu vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên môi trường thạch nghiêng
3.2.3.3. Đặc tính sinh hóa
Các đặc tính sinh hóa của 9 chủngvi khuẩn Acetobacter đƣợc trình bày
ở bảng dƣới đây:
Bảng 3.3. Đặc điểm sinh hóa của 9 chủng vi khuẩn Acetobacter
S T T Đặc điểm Hiện tƣợng Kết quả A1, A3, A6, A15 A8, A13,
A18 A2, A19
1 Oxy hoá ethanol thành acid acetic
Chuyển hoá môi trƣờng chứa Brom phenol Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng
+ + +
3 Sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer
Sinh khối không phát triển
– + –
4
Chuyển hoá glucose thành acid
Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng chứa CaCO3
+ + +
5 Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu
Không hình thành sắc tố
nâu – – –
6 Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose
Váng vi khuẩn xuất hiện
màu lam + – –
7
Chuyển hoá
glycerol thành dihydroxyacetone
Tạo kết tủa đỏ gạch trong
dịch sau lên men + + +
8 Nhuộm Gram Bắt màu hồng Gram
âm Gram âm Gram âm Chú thích: +: Kết quả dƣơng tính –: Kết quả âm tính
Dựa theo các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn acetic của Bergeys (1914),
Yamada và cs (2000) [51],Boesch và cs (1998) [17],Bergey (1992) [16], căn
cứ vào các kết quả khảo sát các một số đặc điểm sinh học của 9 chủng vi khuẩn Acetobacter có thể khẳng định đây là các mẫu vi khuẩn thuộc họ
Acetobacteraceae.
Trong khóa phân loại của Bergeys (1914) đã phân chia các loài trong giống Acetobacter thành 2 nhóm:
Nhóm 1: sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất( dung dịch Hoyer) gồm các chủng: A8 , A13, A18
Nhóm 2: không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất gồm 2 nhóm:
Trên môi trƣờng dịch thể tạo thành màng nhầy dày có chứa cellulose gồm các chủng: A1, A3, A6, A15.
Trên môi trƣờng dịch thể không tạo thành màng nhầy có chứa cellulose
gồm các chủng: A2, A19.
Vậy dựa vào đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa của 9 chủng vi khuẩn đã tuyển chọn, theo Bergeys (1914), Nguyễn Lân Dũng (1976) [8] tạm xếp 9