6. Đóng góp của đề tài
3.2.3.1. Hình thái và tế bào học
Để quan sát hình dạng tế bào 9 chủng vi khuẩn Acetobacter chúng tôi
tiến hành làm tiêu bản nhuộm Gram với dịch nuôi cấy của vi khuẩn trên, sau đó soi trên kính hiển vi Olympus CX31 với độ phóng đại 1000 lần. Kết quả cho thấy 9 mẫu Acetobacter đều là Gram âm, có dạng hình que ngắn, hình elip đầu tròn đều với kích thƣớc trung bình 1,5 – 2,5 µm, tế bào xếp dạng đơn, đôi, hoặc chuỗi ngắn.
Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.6. Hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên kính hiển quang học(x1000 lần)
3.2.3.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa
Vi khuẩn Acetobacter khi nuôi cấy trên môi trƣờng đặc sau 3 ngày sẽ
hình thành các khuẩn lạc đặc trƣng, khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng tròn, màu trắng đục, đa số bề mặt khuẩn lạc trơn bóng, cấu trúc khuẩn lạc đồng nhất, kích thƣớc trung bình của khuẩn lạc 1 – 2 mm.
Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.7. Khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên môi trường thạch đĩa
Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.8. Mẫu vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên môi trường thạch nghiêng
3.2.3.3. Đặc tính sinh hóa
Các đặc tính sinh hóa của 9 chủngvi khuẩn Acetobacter đƣợc trình bày
ở bảng dƣới đây:
Bảng 3.3. Đặc điểm sinh hóa của 9 chủng vi khuẩn Acetobacter
S T T Đặc điểm Hiện tƣợng Kết quả A1, A3, A6, A15 A8, A13,
A18 A2, A19
1 Oxy hoá ethanol thành acid acetic
Chuyển hoá môi trƣờng chứa Brom phenol Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng
+ + +
3 Sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer
Sinh khối không phát triển
– + –
4
Chuyển hoá glucose thành acid
Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng chứa CaCO3
+ + +
5 Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu
Không hình thành sắc tố
nâu – – –
6 Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose
Váng vi khuẩn xuất hiện
màu lam + – –
7
Chuyển hoá
glycerol thành dihydroxyacetone
Tạo kết tủa đỏ gạch trong
dịch sau lên men + + +
8 Nhuộm Gram Bắt màu hồng Gram
âm Gram âm Gram âm Chú thích: +: Kết quả dƣơng tính –: Kết quả âm tính
Dựa theo các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn acetic của Bergeys (1914),
Yamada và cs (2000) [51],Boesch và cs (1998) [17],Bergey (1992) [16], căn
cứ vào các kết quả khảo sát các một số đặc điểm sinh học của 9 chủng vi khuẩn Acetobacter có thể khẳng định đây là các mẫu vi khuẩn thuộc họ
Acetobacteraceae.
Trong khóa phân loại của Bergeys (1914) đã phân chia các loài trong giống Acetobacter thành 2 nhóm:
Nhóm 1: sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất( dung dịch Hoyer) gồm các chủng: A8 , A13, A18
Nhóm 2: không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất gồm 2 nhóm:
Trên môi trƣờng dịch thể tạo thành màng nhầy dày có chứa cellulose gồm các chủng: A1, A3, A6, A15.
Trên môi trƣờng dịch thể không tạo thành màng nhầy có chứa cellulose
gồm các chủng: A2, A19.
Vậy dựa vào đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa của 9 chủng vi khuẩn đã tuyển chọn, theo Bergeys (1914), Nguyễn Lân Dũng (1976) [8] tạm xếp 9 chủng Acetobacter vào 3 chủng sau: Acetobacter xylinus (gồm các chủng vi khuẩn A1, A3, A6, A15), Acetobacter aceti (gồm các chủng vi khuẩn A8, A13, A18),
Acetobacter pasteurianus (gồm các chủng A2, A19).
Năm 1950, Frateur đã chính thức đƣa ra khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn nhƣ: khả năng oxy hoá acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính catalase; khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer [23]... Theo quan điểm này A. xylinus, A. aceti, A. pasteurianus là chủng vi khuẩn thuộc chi
Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp
Schizomycetes. Kết quả này phù hợp với Balentine DA (1997) [15] phân lập đƣợc Acetobacter xylinus, Liu CH, Hsu WH, Lee FL, Liao CC (1996) [38]
phân lập đƣợc Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus trong kombucha.
Như vậy, từ 20 mẫu vi khuẩn ban đầu phân lập được đã tuyển chọn sơ bộ được 9 chủng vi khuẩn Acetobacter xếp vào 3 chủng A. xylinus, A. aceti,A. pasteurianus.
Trong quá trình lên men kombucha chúng tôi đã tiến hành đánh giá
cảm quan các sản phẩm đƣợc lên men từ 9 mẫu vi khuẩn Acetobacter( bảng
3.2), trong số các sản phẩm đó nhận thấy có 2 sản phẩm tạo ra từ chủng
Acetobacter A2 và Acetobacter A15 có mùi vị thơm, ngon, đặc trƣng phù hợp với mục đích nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định dùng 2 chủng vi khuẩn này sử dụng để nghiên cứu trong suốt đề tài.
3.2.4. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter A2 và A15
Động thái sinh trƣởng của một chủng vi khuẩn phản ánh khả năng sinh
trƣởng và sinh sản của chúng trong thời gian nhất định. Tùy vào hình thức nuôi cấy liên tục (môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật thƣờng xuyên đƣợc bổ sung chất dinh dƣỡng) hay hình thức nuôi cấy không liên tục (môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật không đƣợc bổ sung chất dinh dƣỡng) mà động thái sinh trƣởng
của chúng là khác nhau. Để nghiên cứu động thái sinh trƣởng của Acetobacter
A2 và A15 chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau những khoảng thời gian định sẵn, dịch nuôi cấy đƣợc lấy ra để xác định số lƣợng tế bào. Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào trong dịch nuôi cấy ở các thời điểm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ bằng cách đếm số lƣợng tế bào trên buồng đếm. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.9
Bảng 3.4. Quá trình sinh trưởng của chủng Acetobacter A2 và
A15 (x106 tế bào)
Thời gian ( h) Acetobacter A2 Acetobacter A15 Số lƣợng tế bào δ Số lƣợng tế bào δ 0 2,0±0,006 0,01 2,3±0,057 0,10 12 16,9±1,295 2,24 18,4±0,530 0,92 24 48,6±0,682 1,18 51,2±2,890 5,00 36 73,5±0,578 1,00 86,5±1,873 3,24 48 115,1±2,514 4,35 128,2±1,821 3,15 60 125,7±2,405 4,16 132,1±4,219 7,30 72 127,3±0,017 0,03 130,8±2,514 4,35 84 103,1±0,035 0,06 110,2±1,295 2,24 96 90,5±0,099 0,17 96,5±1,873 3,24
0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 0 12 24 36 48 60 72 84 96
Thời gian nuôi cấy ( h)
S ố lư ợ ng t ế bà o (. 10 6) Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter A2 và A15
Từ kết quả nghiên cứu ở bảng 3.4 và hình 3.9 ta thấy:
Trong 12 giờ đầu pha lag, số lƣợng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng đều nhƣng mức tăng chậm. Giai đoạn này vi khuẩn làm quen với môi trƣờng, tích luỹ chất dinh dƣỡng và năng lƣợng cho các giai đoạn sinh trƣởng tiếp theo.
Từ 12 - 48 giờ: Pha cấp số mũ (pha log), ở pha này số lƣợng tế bào tăng nhanh và đạt giá trị cực đại ở 48 giờ. Từ 24 giờ trở đi trong dịch nuôi cấy bắt đầu xuất hiện những sợi cellulose lơ lửng.
Từ 48 - 72 giờ: Pha cân bằng động, ở pha này số lƣợng tế bào trong dịch nuôi cấy ổn định; số lƣợng tế bào chết đi và số lƣợng tế bào sinh ra tƣơng đối bằng nhau. Các sợi cellulose liên kết với nhau tạo thành lớp màng mỏng trên bề mặt môi trƣờng dịch thể dần dần dày dần lên theo thời gian.
Từ 72 giờ trở đi: Pha suy vong, ở pha này số lƣợng tế bào chết đi nhiều số lƣợng tế bào sinh ra làm cho tổng tế bào trong dịch nuôi cấy giảm nhanh, hơn giảm nhanh chóng do nguồn dinh dƣỡng cạn kiệt, sản phẩm độc sản sinh trong quá trình trao đổi chất tăng. Trong quá trình sinh trƣởng, Acetobacter A2
và A15 có thể tích luỹ đƣợc lƣợng acid acetic nhất định trong dịch lên men làm cho giá trị pH môi trƣờng giảm dần theo thời gian 3]. Kết quả trên phù
hợp với nghiên cứu của Bergey 16, Đinh Thị Kim Nhung (1996) 2 với số
3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha kombucha
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình lên men kombucha
3.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của (NH2)2SO4
Nguồn nitơ cung cấp cho cơ thể vi sinh vật nguyên liệu để hình thành các nhóm amin trong các phân tử aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên sinh chất giúp cho vi sinh vật sinh trƣởng và phát triển. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Do đó tôi quyết định chọn nguồn nitơ là (NH4)2SO4 và thay đổi nồng độ từ 1 đến 3 g/l. Kết quả thu đƣợc thể hiện qua biểu đồ sau:
28,000 29,000 30,000 31,000 32,000 33,000 34,000 1 1.5 2 2.5 3 Hàm lượng (NH2)2SO4 (g/l) H à m l ư ợ n g a c id t ổ n g s ố (g /l ) Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của (NH4)2SO4đến hàm lượng
acid tổng số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15
Từ biểu đồ ta nhận thấy hàm lƣợng acid tạo thành từ 2 chủng
Acetobacter A2 và Acetobacter A15 đạt cực đại khi hàm lƣợng (NH4)2SO4 bổ
sung ở mức 2 g/l. Hàm lƣợng (NH4)2SO4 bổ sung cao quá hoặc thấp quá đều
ảnh hƣởng đến hàm lƣợng acid tạo thành. Nguyên nhân này đƣợc giải thích nhƣ sau: mỗi loài vi sinh vật đều có khả năng hấp thụ nhất định các chất dinh dƣỡng khác nhau là khác nhau. (NH4)2SO4 cung cấp nguồn nitơ cần thiết cho
(NH4)2SO4 bổ sung quá cao vi khuẩn sẽ không thể hấp thụ hết, lƣợng (NH4)2SO4 dƣ trong môi trƣờng sẽ ức chế sự phát triển của tế bào vi khuẩn cũng nhƣ đối với nấm men cùng sống cộng sinh trong kombucha. Nếu hàm
lƣợng (NH4)2SO4 bổ sung quá thấp sẽ không đủ cung cấp cho nhu cầu của vi
khuẩn, do vậy lƣợng acid tạo ra thấp. Mặt khác nitơ còn có mặt trong thành phần cấu tạo của nhiều hợp chất quan trọng nhƣ: acid nucleic, photphoslipid, một số coenzyme quan trọng nhƣ ATP, ADP, NADP, FAD và một số vitamin tham gia vào quá trình oxy hóa ethanol thành acid acetic.
Như vậy, hàm lượng (NH4)2SO4 thích hợp bổ sung cho quá trình lên men kombucha là 2 g/l.
3.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của MgSO4.7H2O
Chúng ta cần phải cung cấp một lƣợng magie khá cao cho vi sinh vật. Magie mang tính chất của một cofactor, chúng tham gia vào nhiều phản ứng enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Ngoài ra magie giữ vai trò quan trọng trong việc làm liên kết các tiểu phần ribosome với nhau [6]. Tiến
hành khảo sát ảnh hƣởng của MgSO4.7H2Ođến quá trình lên men kombucha
ở các nồng độ khác nhau, kết quả đƣợc thể hiện qua biểu đồ sau:
28,000 29,000 30,000 31,000 32,000 33,000 34,000 0.5 1 1.5 2 2.5 Hàm lượng MgSO4.7H2O (g/l) H à m lư ợ n g a c id t ổ n g s ố (g /l ) Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.11. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của MgSO4.7H2O đếnhàm
lượng acid tổng số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15
Qua biểu đồ ta thấy hàm lƣợng MgSO4.7H2O bổ sung cho quá trình lên men ảnh hƣởng tới hàm lƣợng acid tổng số sinh ra. Mg là một nhân
tố tham gia tạo thành enzyme có liên quan đến quá trình phosphoryl hóa. Hàm
lƣợng MgSO4.7H2O quá thấp sẽ không đủ cung cấp cho hoạt động của tế bào
vi khuẩn, nếu hàm lƣợng quá cao sẽ ức chế quá trình tạo ra acid.
Như vậy, hàm lượng MgSO4.7H2O cần bổ sung cho quá trình lên men kombucha là 1,5 g/l.
3.3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của KH2PO4
Phospho(P) và các hợp chất chứa phospho cũng nhƣ nồng độ của chúng trong môi trƣờng có ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật. Khi thay đổi nồng độ các hợp chất phospho trong môi trƣờng sẽ dẫn đến thay đổi hàng loạt các quá trình tổng hợp các chất hợp phần của tế bào có chứa phospho, tế bào chất và nhân. Ngoài ra, phospho trong môi trƣờng có tác dụng điều chỉnh hoạt tính enzyme đồng hóa thức ăn cacbon.
Tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của KH2PO4 đến quá trình lên men kombucha ở các nồng độ khác nhau, kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
28,000 29,000 30,000 31,000 32,000 33,000 34,000 0.5 1 1.5 2 2.5 Hàm lượng KH2PO4 (g/l) H à m lư ợ n g a c id t ổ n g s ố (g /l ) Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.12. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của KH2PO4 đến hàm lượng
acid tổng số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15
KH2PO4 1,0 (g/l) KH2PO4 1,5 (g/l)
Hình 3.13. Ảnh kombucha lên men từ chủng
Qua biểu đồ trên cho thấy, ở hàm lƣợng 1,0 g/l môi trƣờng cho hiệu suất lên men cao nhất.
Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ảnh hƣởng của hàm lƣợng acid sinh ra nhƣng chủ yếu là do phospho và kali có nhiều trong thành phần cấu tạo quan trọng của tế bào vi khuẩn nhƣ: acid nucleic, protein, phospholipid và nhiều coenzyme quan trọng nhƣ ADP, ATP, NADP,... tham gia vào quá trình oxy hóa rƣợu thành acid acetic đến CO2 và H2O. Khi hàm lƣợng KH2PO4 từ 2,5 g/l trở lên sẽ dẫn tới dƣ thừa nó làm thay đổi đặc tính lý hóa của môi trƣờng, ức chế quá trình sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn dẫn tới ảnh hƣởng đến hàm lƣợng acid acetic sinh ra. Ngƣợc lại nếu lƣợng phospho kali quá thấp (dƣới 0,5 g/l) sẽ ảnh hƣởng tới việc cấu thành coezyme xúc tác cho phản ứng trong quá trình sinh trƣởng của vi khuẩn. Hàm lƣợng KH2PO4 bổ sung cho quá trình lên men kombucha là 1,5 g/l.
Như vậy, hàm lượng (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4 bổ sung cho quá trình lên men kombucha lần lượt là 2; 1,5; 1,5 (g/l).
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha
3.3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men
Khi nuôi cấy Acetobacter A2 và Acetobacter A15 trong MT3 đã đƣợc thanh trùng ở 1100C trong vòng 20 phút, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh ở 300
C, nhận thấy:
Trong ngày đầu, số lƣợng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng nhƣng ở mức độ chậm. Vì ở giai đoạn này vi khuẩn làm quen với môi trƣờng, tích lũy chất dinh dƣỡng và năng lƣợng cho các giai đoạn tiếp theo. Đồng thời với quá trình tăng trƣởng tế bào thì lƣợng acid cũng bắt đầu hình thành, pH môi trƣờng giảm nhẹ.
Từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 7 lƣợng acid tăng nhanh, giai đoạn này các tế bào sinh trƣởng mạnh và biến đổi êtylic thành acid acetic. Từ ngày thứ 7 trở đi lƣợng acid vẫn tiếp tục tăng nhƣng với tốc độ chậm. Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thời gian lên men đƣợc thể hiện qua bảng sau:
Bảng 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15
Chủng Ngày M±m (g/l) δ (%) Cv (%) A2 0 0,000±0,000 0,000 0,000 1 4,310±0,006 0,010 2,320 2 9,380±0,023 0,040 4,264 3 15,610±0,010 0,017 1,089 4 23,250±0,035 0,061 2,624 5 29,810±0,004 0,007 0,235 6 31,320±0,017 0,030 0,958 7 32,450±0,053 0,092 2,835 8 32,890±0,099 0,171 5,199 9 33,150±0,035 0,061 1,840 A15 0 0,000±0,000 0,000 0,000 1 5,120±0,017 0,030 5,859 2 9,950±0,035 0,061 6,131 3 16,720±0,023 0,040 2,392 4 22,190±0,039 0,069 3,110 5 28,920±0,034 0,059 2,040 6 31,290±0,027 0,046 1,470 7 32,820±0,012 0,020 0,609 8 33,010±0,053 0,092 2,787 9 33,190±0,021 0,036 1,085
5 ngày 7 ngày 9 ngày
Hình 3.14. Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A2 với thời gian
lên men 5, 7 và 9 ngày
Thời gian lên men càng lâu thì lƣợng acid sinh ra càng tăng, độ pH càng ngày càng giảm làm cho sản phẩm trở nên chua hơn. Để thu đƣợc sản phẩm kombucha thơm, ngon, có vị chua dịu mát chúng ta nên thu sản phẩm ở ngày lên men thứ 7 của quá trình lên men.
3.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống bổ sung ban đầu
Hàm lƣợng giống là một trong những yếu tố quyết định đến quá trình lên men, cần có tỷ lệ giống phù hợp với quá trình lên men nhằm đạt hiệu suất lên men cao và cho ra chất lƣợng sản phẩm kombucha thơm, ngon. Hàm lƣợng giống bổ sung trƣớc khi lên men là rất quan trọng. Nếu bổ sung không đủ giống thì quá trình lên men diễn ra chậm, hơn nữa dịch lên men sẽ dễ nhiễm tạp. Ngƣợc lại, nếu bổ sung nhiều giống quá thì hàm lƣợng dinh dƣỡng trong dịch lên men có thể không đáp ứng đủ cho vi khuẩn sinh trƣởng