6. Đóng góp của đề tài
2.2.2.4. Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành
Để phát hiện khả năng hình thành dihydroxyacetone từ glycerol. Chúng tôi tiến hành trên môi trƣờng bao gồm thành phần sau:
Glycerol: 4% (g/l) Cao nấm men: 0,3 % (g/l) Cao ngô: 3% (g/l) CaCO3 : 0,3% (g/l) (NH4)2SO4: 0,1% (g/l) H2O: 1000ml pH = 5,3
Hấp thanh trùng 1210C trong 10 phút. Để môi trƣờng nguội cấy giống
vi khuẩn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 300
Nhỏ dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone (có sự xuất hiện kết tủa Cu2O màu đỏ gạch).
2.2.2.5. Sinh trưởng trên môi trường Hoyer
Thành phần môi trƣờng: (g/l)
(NH4)2SO4: 1g KH2PO4 : 0,9g
FeCl3.6H2O: 0,02g MgSO4.7H2O: 0,25g K2HPO4 : 0,1g Rƣợu êtylic 99,5%: 20ml
Hấp thanh trùng 1210C trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội bổ sung
giống nghiên cứu nuôi ở nhiệt độ khoảng 300
C trong 0, 12, 24, 48 giờ sau đó đếm số lƣợng tế bào trên buồng đếm.
2.2.2.6. Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose
Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng dịch thể ở nhiệt độ 28 - 300
C trong vòng 3 - 4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% nó chuyển hoá thành màu xanh lam
2.2.2.7
100 ml –
cid tổng số trong 100 ml dung :
Trong đó: X : tổng số
V
K 1 ml NaOH 0,1N (K = 0,006)
2.2.3. Phương pháp cảm quan
Phân tích cảm quan thực phẩm là kỹ thuật sử dụng cơ quan cảm giác của con ngƣời để tìm hiểu mô tả và định lƣợng các tính chất cảm quan vốn có của thực phẩm nhƣ: màu sắc, mùi vị... Cảm quan của kombucha đƣợc đánh giá trên
một số chỉ tiêu theo TCVN 3215 – 79 [14]:Số điểm chƣa có trọng lƣợng là số
điểm cho tƣơng ứng với từng bậc đánh giá đối với mỗi chỉ tiêu chất lƣợng và đƣợc quy định trong bảng 2.1, hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu đƣợc quy định trong bảng 2.2, đánh giá mức chất lƣợng sản phẩm ở bảng 2.3.
Bảng 2.1. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha
Tên chỉ tiêu
Điểm chưa có trọng
lượng Yêu cầu
1 2 3
Độ trong và màu sắc
5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, mầu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm
4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, mầu đặc trưng cho sản phẩm.
3 Chất lỏng trong, có tương đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm.
2 Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô trầm trọng, màu khác nhiều so với màu đặc trưng của sản phẩm.
1 Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm trọng, thô, màu không đặc trưng cho sản phẩm.
0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng
Mùi
5 Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm.
4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trưng cho sản phẩm nhưng hơi khó
nhận thấy.
3 Hơi nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trưng cho sản phẩm
2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm
1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho sản phẩm
0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng.
Vị
5 Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm
4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, hậu vừa phải, đặc trưng cho sản phẩm bình
thường.
3 Chưa hòa hợp, hơi gắt và xốc, hậu yếu, ít đặc trưng cho sản phẩm. 2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm
Bảng 2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu Số thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng Số thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng 1 2 3 Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2,0 Tổng cộng 4,0
Bảng 2.3. Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm
Số thứ
tự
Mức chất
lượng Số điểm chung
Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chưa có trọng lượng của hội đồng cảm quan
1 Loại tốt 18,6 – 20,0 Mùi : 4,8
Vị : 4,8
2 Loại khá 15,2 – 18,5 Mùi : 3,8
Vị : 3,8
3 Loại trung bình 11,2 – 15,1 Mỗi chỉ tiêu : 2,8
4 Loại kém 7,2 – 11,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,8
5 Loại rất kém 4,0 – 7,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,0
6 Loại hỏng 0 – 3,9 Mỗi chỉ tiêu nhỏ hơn 1,0
2.2.4
Xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp trong cuốn “Thống kê và ứng dụng” [1] nhƣ:
* Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm. 1 1 n i i X X n
* Trung bình bình phƣơng các sai lệch
1 ) ( 1 2 n X X n i i * Sai số đại diện của trung bình cộng m
n
* Hệ số biến thiên trung bình cộng:
X x
Cv 100
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập các lên men kombucha từ trà Thái Nguyên
Bước 1: Nguyên liệu sử dụng là trà Thái Nguyên và đƣờng để sản xuất
kombucha. Trƣớc hết cần đun sôi 1000ml nƣớc, bổ sung 20g trà Thái Nguyên để trong thời gian 10-15 phút. Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh
sạch, thêm 100g đƣờng khuấy đều, để nguội. Sau khoảng 7 ngày ở 300
C ta thu đƣợc kombucha, bao gồm dịch trà đƣờng lên men và miếng thạch nổi lên trên bề mặt.
Dùng vải sạch lọc lấy dịch, tiến hành phân lập vi khuẩn trên môi trƣờng
1 theo phƣơng pháp của Vinogradski (phương pháp 2.2.1.1.1). Kết quả phân
lập đƣợc 20 mẫu (ký hiệu lần lƣợt là A1, A2, …, A20).
Môi trƣờng 1 dùng để phân lập vi khuẩn đƣợc acid hoá bằng acid acetic cũng góp phần ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật khác. Tuy nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn có thể sống trong môi trƣờng có độ pH thấp.
Bước 2: Nhuộm Gram 20 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn đƣợc (phương
pháp 2.2.1.1.2), kết quả cho thấy khi quan sát trên kính hiển vi quang học tất cả các mẫu vi khuẩn đều bắt màu hồng với thuốc nhuộm. Điều này chứng tỏ rằng các mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn đƣợc đều là Gram âm. Các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha thuộc rất nhiều nhóm khác nhau, bao gồm cả nhóm vi khuẩn Gram dƣơng( vi khuẩn lactic) và nhóm vi khuẩn Gram âm( vi khuẩn Acetobacter). Vì các mẫu vi khuẩn phân lập đƣợc đều là vi khuẩn Gram âm, chính vì vậy chúng tôi quyết định tuyển chọn các mẫu vi khuẩn Acetobacter có khả năng lên men kombucha phục vụ cho mục đích nghiên cứu của đề tài. Bƣớc tiếp theo chúng tôi tiến hành sơ tuyển bằng cách lựa chọn các mẫu vi khuẩn có khả năng chuyển hóa ethanol thành acid acetic.
Hình 3.1. Ảnh mẫu vi khuẩn A15 nhuộm Gram
Bước 3: Từ 20 mẫu vi khuẩn đã chọn đƣợc ở bƣớc 2 tiếp tục tiến hành
tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter theo phƣơng pháp của Carr (1968) [24]
(phương pháp 2.2.2.2).
Hình 3.2. Chuyển hoá ethanol thành acid acetic của các mẫu vi khuẩn
Theo Bergey (1992) 16 vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae
gồm 2 chi là Acetobacter và Gluconobacter. Cả hai chi đều có khả năng oxy
hoá ethanol thành acid acetic. Acid acetic làm môi trƣờng có chứa Blue
Bromophenol 0.04% chuyển từ màu xanh lục sang màu vàng (hình 3.1). Các
chủng thuộc chi Acetobacter có khả năng phân giải tiếp tục acid acetic thành
CO2 và H2O phục hồi màu xanh của môi trƣờng. Ngƣợc lại, các chủng thuộc
chi Gluconobacter không có khả năng phân giải acid acetic nên môi trƣờng vẫn giữ màu vàng.
Hầu hết các mẫu vi khuẩn đã phân lập đƣợc đều có khả năng oxy hoá
chủng. Hơn nữa các chủng đã phân lập đƣợc gồm 2 nhóm có tốc độ sinh trƣởng khác nhau (nhóm sinh trƣởng nhanh và nhóm sinh trƣởng chậm) do đó việc theo dõi khả năng phục hồi màu xanh của môi trƣờng để phân biệt 2 chi
Acetobacter và Gluconobacter rất khó khăn, thiếu chính xác. Vì thế, sau bƣớc 3 lựa chọn các chủng làm môi trƣờng chuyển màu vàng và tiếp tục khảo sát
khả năng oxy hoá acetate nhằm phân biệt các chủng thuộc 2 chi Acetobacter
và Gluconobacter. Kết quả thu đƣợc 11 mẫu là: A1, A2, A3, A5, A6, A7, A8, A13, A15, A18, A19
Bước 4: Với 11 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn đƣợc chúng tôi tiếp tục
xác định khả năng tạo thành acid bằng cách cấy trên môi trƣờng thạch đĩa
(môi trƣờng 1)có bổ sung thêm CaCO3 7g/l (phương pháp 2.2.2.3). Các mẫu
vi khuẩn có khả năng sinh acid, acid này phân giải CaCO3 trong môi trƣờng
do đó xung quanh khuẩn lạc xuất hiện vòng sáng nhỏ trong suốt. Vòng sáng
xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng có chứa CaCO3 điều đó cho
thấy acid đã đƣợc tạo thành. Chúng tham gia phản ứng với CaCO3 để chuyển
môi trƣờng từ màu trắng sang không màu theo phƣơng trình: H+ + CaCO3 → Ca2+ + H2O + CO2
Theo Bergey (1992) [16], cả 2 chi Acetobacter và Glucobacter đều có
khả năng oxy hoá lactate nhƣng chỉ có các vi khuẩn thuộc chi Acetobacter
mới có khả năng oxy hoá acetate. Vì thế, trong môi trƣờng có chứa calcium acetate, các chủng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter có khả năng sử dụng muối acetate làm nguồn cácbon hay nói cách khác chúng có khả năng oxy hoá acid acetic thành CO2 và H2O; giải phóng ATP. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Hai-Peng Cheng và cs (2002) [25] khi xác định sự có mặt của acid gluconic trong tổng hợp cellulose. Kết quả thu đƣợc 9 mẫu là: A1, A2, A3, A6, A8, A13, A15, A18, A19.
Từ các kết quả trên cho thấy, 9 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn đƣợc là các
Hình 3.3. Khả năng oxy hoá acetate
Bước 5:Kiểm tra hoạt tính catalase (phương pháp 2.2.2.1) thu đƣợc kết
quả là cả 9 mẫu vi khuẩnđều có phản ứng catalase dƣơng tính.
Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tƣợng sủi bọt khí (hình 3.3). Chứng tỏ oxy đƣợc giải phóng ra, hay nói cách khác dƣới tác dụng của enzyme catalase phân giải H2O2 theo phƣơng trình:
2 2 2 2 1 2 Catalase H O H O O
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter
Bước 6: Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone
(phương pháp 2.2.2.4).
Vi khuẩn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 300C trong vòng 48h. Nhỏ dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone.
Bước 7: Khả năng sinh sắc tố nâu
Khi nuôi cấy 9 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn trên môi trƣờng thạch và dịch thể, không thấy hình thành sắc tố nâu, điều đó chứng tỏ rằng những
chủng vi khuẩn Acetobacter không hình thành sản phẩm 2,5-dixeto gluconic
acid và - propyonic cho nên dịch nuôi cấy không màu. Kết quả: 9 mẫu vi khuẩn đều không thấy hình thành sắc tố nâu.
Bước 8: Sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer (phương pháp 2.2.2.5).
Khi nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter trên môi trƣờng Hoyer theo dõi bằng cách lấy dịch nuôi cấy đếm số lƣợng tế bào vi khuẩn trên buồng đếm cho thấy số lƣợng 6 mẫu vi khuẩn không tăng. Môi trƣờng Hoyer là môi
trƣờng chỉ bao gồm các nhân tố khoáng, 6 mẫu vi khuẩn Acetobacter sử dụng
muối (NH4)2SO4 nhƣ là nguồn nitơ và rƣợu êtylic nhƣ là nguồn cacbon để duy trì sự tồn tại của tế bào, mà không tăng sinh khối tế bào.
Điều này có thể giải thích nhƣ sau: Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung
[2] và Nguyễn Thành Đạt [10] 6 mẫu Acetobacter này thuộc nhóm vi sinh vật
khuyết dƣỡng, điều kiện cho chúng sinh trƣởng tăng sinh khối khi môi trƣờng nuôi cấy đƣợc bổ sung các chất kích thích sinh trƣởng (acid folic, các loại vitamin B5, B6, B12...). Kết quả thí nghiệm cho thấy 6 mẫu vi khuẩn không có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer là: A1, A2, A3, A6, A15, A19.
Bước 9: Khả năng tổng hợp cellulose (phương pháp 2.2.2.6).
Quan sát sự tạo thành màng ta thấy:
Nhóm 1: Tạo thành màng nhầy nhẵn, không đƣợc nâng lên theo thành bình (gồm các mẫu vi khuẩn: A8, A13).
Nhóm 2: Tạo màng nhẵn dai, đƣợc nâng lên theo thành bình ( gồm các mẫu vi khuẩn: A1, A3, A6, A15).
Nhóm 3: Tạo màng khô và nhăn nheo, đƣợc nâng lên theo thành bình (gồm các mẫu vi khuẩn: A2, A19).
Nhỏ dung dịch Lugol và H2SO4 60% lên mặt lớp màng của 9 mẫu vi khuẩn, trong đó có 4 mẫu màng vi khuẩn của nhóm 2 xuất hiện màu lam. Do màng của vi khuẩn nhóm 2 tạo thành có bản chất là cellulose nên màng này sẽ bắt màu xanh với iốt (hình 3.5).
Hình 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulose của vi khuẩn Acetobacter nhóm 2
Từ 20 mẫu vi khuẩn phân lập được, tuyển chọn sơ bộ được 9 mẫu vi khuẩn thuộc chi (giống) Acetobacter, họ Acetobacteriaceae là: A1, A2, A3, A6, A8, A13, A15, A18, A19.
có khả năng lên men kombucha
3.2.1. Xác định hàm lượng acid tổng số được tạo ra của mỗi chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn
Trong quá trình lên men kombucha không chỉ có sản phẩm acid acetic
do vi khuẩn Acetobacter tạo ra mà còn có nhiều sản phẩm acid khác. Vì vậy
khi nghiên cứu quá trình lên men kombucha tôi xác định hàm lƣợng acid tổng số tạo ra.
Sau khi tuyển chọn sơ bộ đƣợc 9 mẫu vi khuẩn Acetobacter chúng tôi
tiến hành nuôi cấy 9 chủng này trên môi trƣờng 3, ở nhiệt độ 300
C sau 7 ngày lên men. Chuẩn độ xác định hàm lƣợng acid tổng số tạo thành, lặp lại 3 lần một mẫu, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 9 chủng vi khuẩn Acetocbacter
STT Chủng M±m δ(%) Cv(%) 1 A1 29,12±0,012 0,021 0,072 2 A2 32,97±0,036 0,063 0,191 3 A3 30,01±0,021 0,037 0,123 4 A6 27,93±0,020 0,035 0,118 5 A8 25,01±0,027 0,046 0,128 6 A13 31,13±0,017 0,03 0,096 7 A15 33,00±0,040 0,069 0,209 8 A18 32,13±0,000 0,000 0,000 9 A19 29,92±0,021 0,037 0,124
Qua bảng 3.1 nhận thấy 9 mẫu vi khuẩn Acetobacter thí nghiệm đều có
khả năng oxy hóa ethanol tạo thành acid acetic. Hàm lƣợng acid tổng số có trong dịch lên men từ 25,01 đến 33,00 (g/l). Các mẫu vi khuẩn khác nhau tạo
ra hàm lƣợng acid acetic khác nhau, trong đó thấp nhất là mẫu vi khuẩn A8,
cao nhất là mẫu A15. Với mục đích tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên men kombucha có chất lƣợng tốt, tôi tiến hành đánh giá chất lƣợng sản phẩm thu đƣợc từ 9 chủng vi khuẩn trên bằng phƣơng pháp cảm quan.
3.2.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha
Sau 7 ngày lên men chúng tôi tiến hành đánh giá chất lƣợng sản phẩm
kombucha tạo ra từ 9 chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn đƣợc bằng
phƣơng pháp cảm quan dựa trên các tiêu chí đƣa ra ở bảng 2.1, 2.2, 2.3
Bảng 3. 2. Khả năng tạo độ trong, hương thơm và mùi vị đặc trưng của kombucha từ 9 chủng vi khuẩn Acetobacter
STT Chỉ tiêu đánh giá Chủng A1 A2 A3 A6 A8 A13 A15 A18 A19 1 Độ trong và màu sắc 2,8 3,6 1,8 3,4 2,0 3,6 3,6 3,2 3,6 2 Mùi 4,2 5,6 2,4 3,6 2,9 4,8 5,6 4,9 4,8 3 Vị 6,0 9,4 5,0 6,8 5,0 8,2 9,4 6,2 7,4 4 Tổng điểm 13,0 18,6 9,2 13,8 9,9 16,6 18,6 14,3 15,8
Kết quả cho thấy đa số mẫu vi khuẩn Acetobacter đều cho chất lƣợng
kombucha có màu vàng tƣơi, mùi vị đặc trƣng tùy theo các mức độ khác nhau. Có thể phân chia các mẫu thành 3 loại sau:
Loại 1: Sản phẩm có chất lƣợng tốt, mùi vị đặc trƣng, màu vàng tƣơi, hƣơng thơm mát dịu gồm các chủng: A2, A15.
Loại 2: Sản phẩm có chất lƣợng khá và trung bình, có mùi đặc trƣng thì vị chua gắt, có vị đặc trƣng thì lại không có mùi thơm, màu sắc tƣơng đối, gồm các chủng: A1, A6, A13, A18, A19.
Loại 3: Sản phẩm có chất lƣợng kém, không có mùi vị đặc trƣng, màu vàng sẫm, gồm các chủng: A3, A8.
Từ kết quả ở bảng 3.1 kết hợp với bảng 3.2 nhận thấy 2 chủng vi khuẩn
Acetobacter A2 và A15 có khả năng sinh acid cao và chất lƣợng sản phẩm kombucha tạo ra thơm, ngon, đặc trƣng nên tôi quyết định tuyển chọn 2 chủng này làm đối tƣợng nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả đã phân lập được 20 mẫu vi khuẩn lên men kombucha từ trà