6. Đóng góp của đề tài
3.3. Khả năng oxy hoá acetate
Bước 5:Kiểm tra hoạt tính catalase (phương pháp 2.2.2.1) thu đƣợc kết
quả là cả 9 mẫu vi khuẩnđều có phản ứng catalase dƣơng tính.
Khi nhỏ H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc thấy có hiện tƣợng sủi bọt khí (hình 3.3). Chứng tỏ oxy đƣợc giải phóng ra, hay nói cách khác dƣới tác dụng của enzyme catalase phân giải H2O2 theo phƣơng trình:
2 2 2 2 1 2 Catalase H O H O O
Hình 3.4. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter
Bước 6: Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone
(phương pháp 2.2.2.4).
Vi khuẩn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 300C trong vòng 48h. Nhỏ dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone.
Bước 7: Khả năng sinh sắc tố nâu
Khi nuôi cấy 9 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn trên môi trƣờng thạch và dịch thể, không thấy hình thành sắc tố nâu, điều đó chứng tỏ rằng những
chủng vi khuẩn Acetobacter không hình thành sản phẩm 2,5-dixeto gluconic
acid và - propyonic cho nên dịch nuôi cấy không màu. Kết quả: 9 mẫu vi khuẩn đều không thấy hình thành sắc tố nâu.
Bước 8: Sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer (phương pháp 2.2.2.5).
Khi nuôi cấy vi khuẩn Acetobacter trên môi trƣờng Hoyer theo dõi bằng cách lấy dịch nuôi cấy đếm số lƣợng tế bào vi khuẩn trên buồng đếm cho thấy số lƣợng 6 mẫu vi khuẩn không tăng. Môi trƣờng Hoyer là môi
trƣờng chỉ bao gồm các nhân tố khoáng, 6 mẫu vi khuẩn Acetobacter sử dụng
muối (NH4)2SO4 nhƣ là nguồn nitơ và rƣợu êtylic nhƣ là nguồn cacbon để duy trì sự tồn tại của tế bào, mà không tăng sinh khối tế bào.
Điều này có thể giải thích nhƣ sau: Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung
[2] và Nguyễn Thành Đạt [10] 6 mẫu Acetobacter này thuộc nhóm vi sinh vật
khuyết dƣỡng, điều kiện cho chúng sinh trƣởng tăng sinh khối khi môi trƣờng nuôi cấy đƣợc bổ sung các chất kích thích sinh trƣởng (acid folic, các loại vitamin B5, B6, B12...). Kết quả thí nghiệm cho thấy 6 mẫu vi khuẩn không có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer là: A1, A2, A3, A6, A15, A19.
Bước 9: Khả năng tổng hợp cellulose (phương pháp 2.2.2.6).
Quan sát sự tạo thành màng ta thấy:
Nhóm 1: Tạo thành màng nhầy nhẵn, không đƣợc nâng lên theo thành bình (gồm các mẫu vi khuẩn: A8, A13).
Nhóm 2: Tạo màng nhẵn dai, đƣợc nâng lên theo thành bình ( gồm các mẫu vi khuẩn: A1, A3, A6, A15).
Nhóm 3: Tạo màng khô và nhăn nheo, đƣợc nâng lên theo thành bình (gồm các mẫu vi khuẩn: A2, A19).
Nhỏ dung dịch Lugol và H2SO4 60% lên mặt lớp màng của 9 mẫu vi khuẩn, trong đó có 4 mẫu màng vi khuẩn của nhóm 2 xuất hiện màu lam. Do màng của vi khuẩn nhóm 2 tạo thành có bản chất là cellulose nên màng này sẽ bắt màu xanh với iốt (hình 3.5).
Hình 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulose của vi khuẩn Acetobacter nhóm 2
Từ 20 mẫu vi khuẩn phân lập được, tuyển chọn sơ bộ được 9 mẫu vi khuẩn thuộc chi (giống) Acetobacter, họ Acetobacteriaceae là: A1, A2, A3, A6, A8, A13, A15, A18, A19.
có khả năng lên men kombucha
3.2.1. Xác định hàm lượng acid tổng số được tạo ra của mỗi chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn
Trong quá trình lên men kombucha không chỉ có sản phẩm acid acetic
do vi khuẩn Acetobacter tạo ra mà còn có nhiều sản phẩm acid khác. Vì vậy
khi nghiên cứu quá trình lên men kombucha tôi xác định hàm lƣợng acid tổng số tạo ra.
Sau khi tuyển chọn sơ bộ đƣợc 9 mẫu vi khuẩn Acetobacter chúng tôi
tiến hành nuôi cấy 9 chủng này trên môi trƣờng 3, ở nhiệt độ 300
C sau 7 ngày lên men. Chuẩn độ xác định hàm lƣợng acid tổng số tạo thành, lặp lại 3 lần một mẫu, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 9 chủng vi khuẩn Acetocbacter
STT Chủng M±m δ(%) Cv(%) 1 A1 29,12±0,012 0,021 0,072 2 A2 32,97±0,036 0,063 0,191 3 A3 30,01±0,021 0,037 0,123 4 A6 27,93±0,020 0,035 0,118 5 A8 25,01±0,027 0,046 0,128 6 A13 31,13±0,017 0,03 0,096 7 A15 33,00±0,040 0,069 0,209 8 A18 32,13±0,000 0,000 0,000 9 A19 29,92±0,021 0,037 0,124
Qua bảng 3.1 nhận thấy 9 mẫu vi khuẩn Acetobacter thí nghiệm đều có
khả năng oxy hóa ethanol tạo thành acid acetic. Hàm lƣợng acid tổng số có trong dịch lên men từ 25,01 đến 33,00 (g/l). Các mẫu vi khuẩn khác nhau tạo
ra hàm lƣợng acid acetic khác nhau, trong đó thấp nhất là mẫu vi khuẩn A8,
cao nhất là mẫu A15. Với mục đích tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên men kombucha có chất lƣợng tốt, tôi tiến hành đánh giá chất lƣợng sản phẩm thu đƣợc từ 9 chủng vi khuẩn trên bằng phƣơng pháp cảm quan.
3.2.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha
Sau 7 ngày lên men chúng tôi tiến hành đánh giá chất lƣợng sản phẩm
kombucha tạo ra từ 9 chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn đƣợc bằng
phƣơng pháp cảm quan dựa trên các tiêu chí đƣa ra ở bảng 2.1, 2.2, 2.3
Bảng 3. 2. Khả năng tạo độ trong, hương thơm và mùi vị đặc trưng của kombucha từ 9 chủng vi khuẩn Acetobacter
STT Chỉ tiêu đánh giá Chủng A1 A2 A3 A6 A8 A13 A15 A18 A19 1 Độ trong và màu sắc 2,8 3,6 1,8 3,4 2,0 3,6 3,6 3,2 3,6 2 Mùi 4,2 5,6 2,4 3,6 2,9 4,8 5,6 4,9 4,8 3 Vị 6,0 9,4 5,0 6,8 5,0 8,2 9,4 6,2 7,4 4 Tổng điểm 13,0 18,6 9,2 13,8 9,9 16,6 18,6 14,3 15,8
Kết quả cho thấy đa số mẫu vi khuẩn Acetobacter đều cho chất lƣợng
kombucha có màu vàng tƣơi, mùi vị đặc trƣng tùy theo các mức độ khác nhau. Có thể phân chia các mẫu thành 3 loại sau:
Loại 1: Sản phẩm có chất lƣợng tốt, mùi vị đặc trƣng, màu vàng tƣơi, hƣơng thơm mát dịu gồm các chủng: A2, A15.
Loại 2: Sản phẩm có chất lƣợng khá và trung bình, có mùi đặc trƣng thì vị chua gắt, có vị đặc trƣng thì lại không có mùi thơm, màu sắc tƣơng đối, gồm các chủng: A1, A6, A13, A18, A19.
Loại 3: Sản phẩm có chất lƣợng kém, không có mùi vị đặc trƣng, màu vàng sẫm, gồm các chủng: A3, A8.
Từ kết quả ở bảng 3.1 kết hợp với bảng 3.2 nhận thấy 2 chủng vi khuẩn
Acetobacter A2 và A15 có khả năng sinh acid cao và chất lƣợng sản phẩm kombucha tạo ra thơm, ngon, đặc trƣng nên tôi quyết định tuyển chọn 2 chủng này làm đối tƣợng nghiên cứu tiếp theo.
Kết quả đã phân lập được 20 mẫu vi khuẩn lên men kombucha từ trà Thái Nguyên, tuyển chọn sơ bộ được 9 chủng vi khuẩn Acetobacter. Các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được dùng để lên men kombucha tạo ra hàm lượng acid và tạo ra sản phẩm có chất lượng khác nhau. Trong số các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn được có 2 chủng vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 tạo
ra hàm lượng acid cao nhất, lên men tạo sản phẩm kombucha thơm, ngon, đặc trưng.
3.2.3. Phân loại các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn để lên men kombucha
Để tiến hành phân loại các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn chúng tôi cần tiến hành nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn đó.
3.2.3.1. Hình thái và tế bào học
Để quan sát hình dạng tế bào 9 chủng vi khuẩn Acetobacter chúng tôi
tiến hành làm tiêu bản nhuộm Gram với dịch nuôi cấy của vi khuẩn trên, sau đó soi trên kính hiển vi Olympus CX31 với độ phóng đại 1000 lần. Kết quả cho thấy 9 mẫu Acetobacter đều là Gram âm, có dạng hình que ngắn, hình elip đầu tròn đều với kích thƣớc trung bình 1,5 – 2,5 µm, tế bào xếp dạng đơn, đôi, hoặc chuỗi ngắn.
Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.6. Hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên kính hiển quang học(x1000 lần)
3.2.3.2. Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa
Vi khuẩn Acetobacter khi nuôi cấy trên môi trƣờng đặc sau 3 ngày sẽ
hình thành các khuẩn lạc đặc trƣng, khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng tròn, màu trắng đục, đa số bề mặt khuẩn lạc trơn bóng, cấu trúc khuẩn lạc đồng nhất, kích thƣớc trung bình của khuẩn lạc 1 – 2 mm.
Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.7. Khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên môi trường thạch đĩa
Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.8. Mẫu vi khuẩn Acetobacter A2 và A15 trên môi trường thạch nghiêng
3.2.3.3. Đặc tính sinh hóa
Các đặc tính sinh hóa của 9 chủngvi khuẩn Acetobacter đƣợc trình bày
ở bảng dƣới đây:
Bảng 3.3. Đặc điểm sinh hóa của 9 chủng vi khuẩn Acetobacter
S T T Đặc điểm Hiện tƣợng Kết quả A1, A3, A6, A15 A8, A13,
A18 A2, A19
1 Oxy hoá ethanol thành acid acetic
Chuyển hoá môi trƣờng chứa Brom phenol Blue 0,04% từ màu xanh sang màu vàng
+ + +
3 Sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer
Sinh khối không phát triển
– + –
4
Chuyển hoá glucose thành acid
Vòng sáng xuất hiện xung quanh khuẩn lạc trên môi trƣờng chứa CaCO3
+ + +
5 Kiểm tra khả năng sinh sắc tố nâu
Không hình thành sắc tố
nâu – – –
6 Kiểm tra khả năng tổng hợp cellulose
Váng vi khuẩn xuất hiện
màu lam + – –
7
Chuyển hoá
glycerol thành dihydroxyacetone
Tạo kết tủa đỏ gạch trong
dịch sau lên men + + +
8 Nhuộm Gram Bắt màu hồng Gram
âm Gram âm Gram âm Chú thích: +: Kết quả dƣơng tính –: Kết quả âm tính
Dựa theo các tiêu chuẩn phân loại vi khuẩn acetic của Bergeys (1914),
Yamada và cs (2000) [51],Boesch và cs (1998) [17],Bergey (1992) [16], căn
cứ vào các kết quả khảo sát các một số đặc điểm sinh học của 9 chủng vi khuẩn Acetobacter có thể khẳng định đây là các mẫu vi khuẩn thuộc họ
Acetobacteraceae.
Trong khóa phân loại của Bergeys (1914) đã phân chia các loài trong giống Acetobacter thành 2 nhóm:
Nhóm 1: sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất( dung dịch Hoyer) gồm các chủng: A8 , A13, A18
Nhóm 2: không sử dụng muối amoni làm nguồn nitơ duy nhất gồm 2 nhóm:
Trên môi trƣờng dịch thể tạo thành màng nhầy dày có chứa cellulose gồm các chủng: A1, A3, A6, A15.
Trên môi trƣờng dịch thể không tạo thành màng nhầy có chứa cellulose
gồm các chủng: A2, A19.
Vậy dựa vào đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa của 9 chủng vi khuẩn đã tuyển chọn, theo Bergeys (1914), Nguyễn Lân Dũng (1976) [8] tạm xếp 9 chủng Acetobacter vào 3 chủng sau: Acetobacter xylinus (gồm các chủng vi khuẩn A1, A3, A6, A15), Acetobacter aceti (gồm các chủng vi khuẩn A8, A13, A18),
Acetobacter pasteurianus (gồm các chủng A2, A19).
Năm 1950, Frateur đã chính thức đƣa ra khóa phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn nhƣ: khả năng oxy hoá acid acetic thành CO2 và H2O; hoạt tính catalase; khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng Hoyer [23]... Theo quan điểm này A. xylinus, A. aceti, A. pasteurianus là chủng vi khuẩn thuộc chi
Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp
Schizomycetes. Kết quả này phù hợp với Balentine DA (1997) [15] phân lập đƣợc Acetobacter xylinus, Liu CH, Hsu WH, Lee FL, Liao CC (1996) [38]
phân lập đƣợc Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus trong kombucha.
Như vậy, từ 20 mẫu vi khuẩn ban đầu phân lập được đã tuyển chọn sơ bộ được 9 chủng vi khuẩn Acetobacter xếp vào 3 chủng A. xylinus, A. aceti,A. pasteurianus.
Trong quá trình lên men kombucha chúng tôi đã tiến hành đánh giá
cảm quan các sản phẩm đƣợc lên men từ 9 mẫu vi khuẩn Acetobacter( bảng
3.2), trong số các sản phẩm đó nhận thấy có 2 sản phẩm tạo ra từ chủng
Acetobacter A2 và Acetobacter A15 có mùi vị thơm, ngon, đặc trƣng phù hợp với mục đích nghiên cứu. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định dùng 2 chủng vi khuẩn này sử dụng để nghiên cứu trong suốt đề tài.
3.2.4. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter A2 và A15
Động thái sinh trƣởng của một chủng vi khuẩn phản ánh khả năng sinh
trƣởng và sinh sản của chúng trong thời gian nhất định. Tùy vào hình thức nuôi cấy liên tục (môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật thƣờng xuyên đƣợc bổ sung chất dinh dƣỡng) hay hình thức nuôi cấy không liên tục (môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật không đƣợc bổ sung chất dinh dƣỡng) mà động thái sinh trƣởng
của chúng là khác nhau. Để nghiên cứu động thái sinh trƣởng của Acetobacter
A2 và A15 chúng tôi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, sau những khoảng thời gian định sẵn, dịch nuôi cấy đƣợc lấy ra để xác định số lƣợng tế bào. Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào trong dịch nuôi cấy ở các thời điểm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ bằng cách đếm số lƣợng tế bào trên buồng đếm. Kết quả thí nghiệm đƣợc trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.9
Bảng 3.4. Quá trình sinh trưởng của chủng Acetobacter A2 và
A15 (x106 tế bào)
Thời gian ( h) Acetobacter A2 Acetobacter A15 Số lƣợng tế bào δ Số lƣợng tế bào δ 0 2,0±0,006 0,01 2,3±0,057 0,10 12 16,9±1,295 2,24 18,4±0,530 0,92 24 48,6±0,682 1,18 51,2±2,890 5,00 36 73,5±0,578 1,00 86,5±1,873 3,24 48 115,1±2,514 4,35 128,2±1,821 3,15 60 125,7±2,405 4,16 132,1±4,219 7,30 72 127,3±0,017 0,03 130,8±2,514 4,35 84 103,1±0,035 0,06 110,2±1,295 2,24 96 90,5±0,099 0,17 96,5±1,873 3,24
0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 0 12 24 36 48 60 72 84 96
Thời gian nuôi cấy ( h)
S ố lư ợ ng t ế bà o (. 10 6) Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter A2 và A15
Từ kết quả nghiên cứu ở bảng 3.4 và hình 3.9 ta thấy:
Trong 12 giờ đầu pha lag, số lƣợng tế bào trong dịch nuôi cấy tăng đều nhƣng mức tăng chậm. Giai đoạn này vi khuẩn làm quen với môi trƣờng, tích luỹ chất dinh dƣỡng và năng lƣợng cho các giai đoạn sinh trƣởng tiếp theo.
Từ 12 - 48 giờ: Pha cấp số mũ (pha log), ở pha này số lƣợng tế bào tăng nhanh và đạt giá trị cực đại ở 48 giờ. Từ 24 giờ trở đi trong dịch nuôi cấy bắt đầu xuất hiện những sợi cellulose lơ lửng.
Từ 48 - 72 giờ: Pha cân bằng động, ở pha này số lƣợng tế bào trong dịch nuôi cấy ổn định; số lƣợng tế bào chết đi và số lƣợng tế bào sinh ra tƣơng đối bằng nhau. Các sợi cellulose liên kết với nhau tạo thành lớp màng mỏng trên bề mặt môi trƣờng dịch thể dần dần dày dần lên theo thời gian.
Từ 72 giờ trở đi: Pha suy vong, ở pha này số lƣợng tế bào chết đi nhiều số lƣợng tế bào sinh ra làm cho tổng tế bào trong dịch nuôi cấy giảm nhanh, hơn giảm nhanh chóng do nguồn dinh dƣỡng cạn kiệt, sản phẩm độc sản sinh trong quá trình trao đổi chất tăng. Trong quá trình sinh trƣởng, Acetobacter A2
và A15 có thể tích luỹ đƣợc lƣợng acid acetic nhất định trong dịch lên men làm cho giá trị pH môi trƣờng giảm dần theo thời gian 3]. Kết quả trên phù
hợp với nghiên cứu của Bergey 16, Đinh Thị Kim Nhung (1996) 2 với số
3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha kombucha
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình lên men kombucha
3.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của (NH2)2SO4
Nguồn nitơ cung cấp cho cơ thể vi sinh vật nguyên liệu để hình thành các nhóm amin trong các phân tử aminoacid, nucleotit, các bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên sinh chất giúp cho vi sinh vật sinh trƣởng và phát triển. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH3 và NH4+. Do đó tôi quyết định chọn nguồn nitơ là (NH4)2SO4 và thay đổi nồng độ từ 1 đến 3 g/l. Kết quả thu đƣợc thể hiện qua biểu đồ sau:
28,000 29,000 30,000 31,000 32,000 33,000 34,000 1 1.5 2 2.5 3 Hàm lượng (NH2)2SO4 (g/l) H à m l ư ợ n g a c id t ổ n g s ố (g /l ) Acetobacter A2 Acetobacter A15
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của (NH4)2SO4đến hàm lượng
acid tổng số sinh ra của 2 chủng Acetobacter A2 và A15
Từ biểu đồ ta nhận thấy hàm lƣợng acid tạo thành từ 2 chủng
Acetobacter A2 và Acetobacter A15 đạt cực đại khi hàm lƣợng (NH4)2SO4 bổ
sung ở mức 2 g/l. Hàm lƣợng (NH4)2SO4 bổ sung cao quá hoặc thấp quá đều
ảnh hƣởng đến hàm lƣợng acid tạo thành. Nguyên nhân này đƣợc giải thích nhƣ sau: mỗi loài vi sinh vật đều có khả năng hấp thụ nhất định các chất dinh