Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

6. Đóng góp của đề tài

2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng

Đối tƣợng nghiên cứu là các chủng vi khuẩn thuần khiết phân lập từ kombucha đƣợc lên men từ trà Thái Nguyên trong phòng thí nghiệm vi sinh, trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị

2.1.2.1. Hóa chất

Nguồn cacbon: glucose (C6H12O6 ), acid acetic... Nguồn nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4 ... Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4 ... Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol, …

H2SO4 , CaCO3 , thạch agar…

2.1.2.2. Thiết bị

 Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)

 Nồi hấp Tommy (nhật)

 Box vô trùng (Haraeus)

 Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

 Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

 Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl – 10ml

 Máy đo pH (MP 200R - Thuỵ Sĩ)

 Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)

 Máy cất nƣớc 2 lần (Hamilton – Anh)

 Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức)

 Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, lamen, đèn cồn...và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác.

2.1.3. Môi trường (MT1) Glucose : 20g MgSO4.7H2O : 2g (NH4)2SO4 : 3g CaCO3 : 10g KH2PO4 : 2g Agar: 20g Pepton : 4g : 1000ml

Acid ung sau )

) (MT2) Glucose : 20g MgSO4.7H2O : 2g (NH4)2SO4: 3g KH2PO4 : 2g Pepton : 4g : 1000ml Acid acetic: 2% ( ) : 2% ( )

* Môi trƣờng lên men kombucha (MT3)

Saccharose : 100g Trà xanh Thái Nguyên: 20g Nƣớc máy : 1000ml

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram

a. Phân lập vi khuẩn theo phƣơng pháp Vinogradski

Để có đƣợc chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành phân lập từ nguồn nguyên liệu là kombucha. Trƣớc hết cần thực hiện quá trình lên men kombucha từ trà Thái Nguyên thu đƣợc mẫu màng lên men giấm tự nhiên.

Cách làm: lấy dịch lên men kombucha lắc đều bằng máy vôntex trong 10 phút thu đƣợc huyền phù vi sinh vật. Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng

độ khác nhau từ 10-1

đến 10-8. Dùng pipet hút 50μl mẫu ở các độ pha loãng

10-3 đến 10-8 nhỏ lên mặt môi trƣờng thạch vô trùng trong hộp petri, dùng que trang trang đều. Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong 2 - 3 ngày. Dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trƣng ra khỏi môi trƣờng phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 40

C [7], [8], [10].

b. Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram

Nhuộm Gram là phƣơng pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốc nhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi khuẩn dựa trên khả năng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protein đặc biệt với thuốc nhuộm kiềm và iốt.

Để tiến hành phƣơng pháp nhuộm Gram cần lấy mẫu từ các chủng đã qua sơ tuyển làm tiêu bản. Khi đó tùy vào màu của tiêu bản thu đƣợc giúp ta

phân biệt đƣợc vi khuẩn Gr-

hay Gr+. Nếu sau khi nhuộm kép tế bào bắt màu

hồng thì đó là vi khuẩn Gr-, bắt màu tím là vi khuẩn Gr+

. Bản chất của hiện

tƣợng bắt màu khác nhau này là do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gr+

đƣợc cấu tạo từ một loại protein đặc biệt, chứa muối Nucleatmagie có khả năng tạo với tím Geltian và Lugol một loại phức chất bền, khó bị rửa trôi, khi quan sát tiêu bản trên kính hiển vi tế bào vi khuẩn Gr+

bắt màu tím geltian. Vi khuẩn Gr-

không có khả năng giữ màu này nên dễ bị rửa trôi bởi cồn. Chỉ khi

nhỏ Fucshin vi khuẩn Gr-

mới bắt màu hồng của Fucshin [5], [8], [10], [11]. Sau đó soi tiêu bản dƣới vật kính dầu và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đại 1000 lần).

2.2.1.2. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đếm

a. Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào sống trên thạch đĩa

Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24 giờ nuôi cấy, pha loãng theo phƣơng pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha

loãng rồi trang đều trên môi trƣờng thạch đĩa. Nuôi ở 300C sau 3 ngày đếm số

khuẩn lạc (CFU) trong môi trƣờng đĩa petri, từ đó xác định số lƣợng tế bào vi khuẩn trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức.

1000 1

. .

100 10 n

N  A 

Trong đó: N- Tổng số CFU trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu. A- Số CFU trung bình đếm đƣợc trên mỗi đĩa petri. 10-n - Độ pha loãng dịch nuôi cấy [6], [8], [11]. b. Phƣơng pháp đếm số lƣợng tế bào bằng phòng đếm

Đây là phƣơng pháp đếm trực tiếp số lƣợng tế bào vi sinh vật có trong

mẫu phân tích. Pha loãng dịch huyền phú VSV đến 10-n, nhỏ một giọt dịch

huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa khung đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ khung đếm cho dịch chiếm đầy khoang. Đếm số lƣợng tế bào theo các ô theo đƣờng chéo hoặc theo các góc ở trung tâm khung đếm. Thƣờng đếm 4 ô lớn ở 4 góc và 1 ô lớn ở trung tâm của khung đếm để tính số lƣợng tế bào trung bình của ô lớn. Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1ml lúc đầu:

N=A x 25 : V : n

Trong đó: N – số lƣợng tế bào trong 1ml dịch huyền phù lúc đầu A – số lƣợng tế bào trung bình trong 1 ô lớn

V – thể tích của 1 ô lớn

n – độ pha loãng của mẫu ( 10-n) 25 là số ô lớn của toàn khung đếm [5]

2.2.1.3. Bảo quản chủng giống

a. Bảo quản trên thạch nghiêng

Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trƣờng giữ

giống trong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 300C. Sau đó giữ trong tủ

lạnh 40C dùng cho nghiên cứu tiếp theo. Cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳ mỗi tháng một lần [10], [12].

b. Bảo quản trong dung dịch glycerin 15%

Chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng dịch lỏng ở 300

C sau 48 giờ đem li tâm dịch nuôi cấy trong 20 phút ở 3000 vòng/ phút, tách lấy phần sinh khối. Hoà đều sinh khối trong 1ml dung dịch glycerin 15% vô trùng giữ ở -800C trong các ống eppendof vô trùng. Bảo quản theo phƣơng pháp này cho phép giữ giống trong vòng 1 đến 3 năm [9].

2.2.1.4. Phươ

Giống từ ống nghiệm đƣợc bảo quản trong tủ lạnh, trƣớc khi đem sử dụng phải hoạt hoá giống, nhân giống đảm bảo đủ số lƣợng tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phƣơng pháp hoạt hoá giống sử dụng môi trƣờng tiêu

chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 1210

C trong 20 phút. Sau đó đem xử lý trong đèn tím 15 phút, cấy chuyền giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong 24 giờ [12], [13].

2.2.2

2.2.2.1. Phát hiện hoạt tính catalase

Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tƣợng sủi

bọt khí thì chủng vi khuẩn đó đƣợc coi là có hoạt tính catalase (catalase +). Ngƣợc lại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -) [2], [5], [8].

2.2.2.2. Phát hiện khả năng oxy hoá rượu etylic thành acid acetic

Cao nấm men: 10g Rƣợu êtylic: 10%-15% (vol/vol)

Nƣớc máy : 1000ml pH: 6,8-7.0

Xanh Bromophenol (BPB) 0,04%: 20ml

Phân môi trƣờng vào các ống nghiệm (4-5ml), khử trùng ở 1210

C trong

20 phút, để nguội khoảng 300C cấy vi khuẩn nghiên cứu mới hoạt hoá, nuôi 7

ngày trong điều kiện thích hợp. Quan sát thấy môi trƣờng chuyển sang màu vàng là dƣơng tính, không đổi màu là âm tính.

Pha dung dịch BPB 0,04%: cân 0,1g BPB nghiền nhỏ trong cốc sứ, sau đó bổ sung 14,9 ml NaOH 0,001N hoà tan cho đều. Đổ tất cả vào bình định mức thêm nƣớc cho đến khi thể tích đạt 250ml [2].

2.2.2.3. Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic

Sử dụng môi trƣờng sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩn tuyển chọn.

Thành phần (g/l): Cao nấm men : 10g Canxi acetat: 10g

Thạch : 20g Nƣớc máy: 1000ml

pH : 7,0-7,2

Quan sát hiện tƣợng nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi là phản ứng dƣơng tính, ngƣợc lại là âm tính [2], [6], [9].

2.2.2.4. Phát hiện khả năng chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone

Để phát hiện khả năng hình thành dihydroxyacetone từ glycerol. Chúng tôi tiến hành trên môi trƣờng bao gồm thành phần sau:

Glycerol: 4% (g/l) Cao nấm men: 0,3 % (g/l) Cao ngô: 3% (g/l) CaCO3 : 0,3% (g/l) (NH4)2SO4: 0,1% (g/l) H2O: 1000ml pH = 5,3

Hấp thanh trùng 1210C trong 10 phút. Để môi trƣờng nguội cấy giống

vi khuẩn nghiên cứu nuôi lắc 140 vòng/ phút ở nhiệt độ 300

Nhỏ dung dịch Fehling để kiểm tra sự tạo thành dihydroxyacetone (có sự xuất hiện kết tủa Cu2O màu đỏ gạch).

2.2.2.5. Sinh trưởng trên môi trường Hoyer

Thành phần môi trƣờng: (g/l)

(NH4)2SO4: 1g KH2PO4 : 0,9g

FeCl3.6H2O: 0,02g MgSO4.7H2O: 0,25g K2HPO4 : 0,1g Rƣợu êtylic 99,5%: 20ml

Hấp thanh trùng 1210C trong 15 phút. Để môi trƣờng nguội bổ sung

giống nghiên cứu nuôi ở nhiệt độ khoảng 300

C trong 0, 12, 24, 48 giờ sau đó đếm số lƣợng tế bào trên buồng đếm.

2.2.2.6. Phát hiện khả năng tổng hợp cellulose

Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng dịch thể ở nhiệt độ 28 - 300

C trong vòng 3 - 4 ngày, quan sát sự hình thành màng. Kiểm tra khả năng bắt màu của màng bằng cách nhỏ lên đó dung dịch lugol và H2SO4 60% nó chuyển hoá thành màu xanh lam

2.2.2.7

100 ml –

cid tổng số trong 100 ml dung :

Trong đó: X : tổng số

V

K 1 ml NaOH 0,1N (K = 0,006)

2.2.3. Phương pháp cảm quan

Phân tích cảm quan thực phẩm là kỹ thuật sử dụng cơ quan cảm giác của con ngƣời để tìm hiểu mô tả và định lƣợng các tính chất cảm quan vốn có của thực phẩm nhƣ: màu sắc, mùi vị... Cảm quan của kombucha đƣợc đánh giá trên

một số chỉ tiêu theo TCVN 3215 – 79 [14]:Số điểm chƣa có trọng lƣợng là số

điểm cho tƣơng ứng với từng bậc đánh giá đối với mỗi chỉ tiêu chất lƣợng và đƣợc quy định trong bảng 2.1, hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu đƣợc quy định trong bảng 2.2, đánh giá mức chất lƣợng sản phẩm ở bảng 2.3.

Bảng 2.1. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha

Tên chỉ tiêu

Điểm chưa có trọng

lượng Yêu cầu

1 2 3

Độ trong và màu sắc

5 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục và vật thể lạ nhỏ, mầu hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm

4 Chất lỏng trong suốt, không vẩn đục, có ít vật thể lạ nhỏ, mầu đặc trưng cho sản phẩm.

3 Chất lỏng trong, có tương đối nhiều vật thể lạ nhỏ, màu hơi khác một ít so với màu đặc trưng của sản phẩm.

2 Chất lỏng hơi đục, có khá nhiều vật thể lạ nhỏ thô trầm trọng, màu khác nhiều so với màu đặc trưng của sản phẩm.

1 Chất lỏng đục nhiều lắng cặn, có nhiều vật thể lạ nhỏ trầm trọng, thô, màu không đặc trưng cho sản phẩm.

0 Vẩn đục, màu bẩn, sản phẩm bị hỏng

Mùi

5 Hòa hợp, thơm dịu, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm.

4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, thơm đặc trưng cho sản phẩm nhưng hơi khó

nhận thấy.

3 Hơi nồng, thoảng mùi phụ, ít đặc trưng cho sản phẩm

2 Nồng, thoảng mùi lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm

1 Nồng, hăng, mùi lạ rõ, không đặc trưng cho sản phẩm

0 Có mùi lạ khó chịu của sản phẩm hỏng.

Vị

5 Hòa hợp, êm dịu, hậu tốt, hoàn toàn đặc trưng cho sản phẩm

4 Chưa hoàn toàn hòa hợp, hậu vừa phải, đặc trưng cho sản phẩm bình

thường.

3 Chưa hòa hợp, hơi gắt và xốc, hậu yếu, ít đặc trưng cho sản phẩm. 2 Đắng, xốc, thoảng vị lạ, rất ít đặc trưng cho sản phẩm

Bảng 2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu Số thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng Số thứ tự Chỉ tiêu Hệ số quan trọng 1 2 3 Độ trong và màu sắc Mùi Vị 0,8 1,2 2,0 Tổng cộng 4,0

Bảng 2.3. Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm

Số thứ

tự

Mức chất

lượng Số điểm chung

Yêu cầu tối thiểu về điểm trung bình chưa có trọng lượng của hội đồng cảm quan

1 Loại tốt 18,6 – 20,0 Mùi : 4,8

Vị : 4,8

2 Loại khá 15,2 – 18,5 Mùi : 3,8

Vị : 3,8

3 Loại trung bình 11,2 – 15,1 Mỗi chỉ tiêu : 2,8

4 Loại kém 7,2 – 11,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,8

5 Loại rất kém 4,0 – 7,1 Mỗi chỉ tiêu : 1,0

6 Loại hỏng 0 – 3,9 Mỗi chỉ tiêu nhỏ hơn 1,0

2.2.4

Xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp trong cuốn “Thống kê và ứng dụng” [1] nhƣ:

* Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm. 1 1 n i i X X n   

* Trung bình bình phƣơng các sai lệch

1 ) ( 1 2      n X X n i i  * Sai số đại diện của trung bình cộng m

n



  * Hệ số biến thiên trung bình cộng:

X x

Cv   100

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân lập các lên men kombucha từ trà Thái Nguyên

Bước 1: Nguyên liệu sử dụng là trà Thái Nguyên và đƣờng để sản xuất

kombucha. Trƣớc hết cần đun sôi 1000ml nƣớc, bổ sung 20g trà Thái Nguyên để trong thời gian 10-15 phút. Sau đó lọc lấy dịch trà đổ vào bình thủy tinh

sạch, thêm 100g đƣờng khuấy đều, để nguội. Sau khoảng 7 ngày ở 300

C ta thu đƣợc kombucha, bao gồm dịch trà đƣờng lên men và miếng thạch nổi lên trên bề mặt.

Dùng vải sạch lọc lấy dịch, tiến hành phân lập vi khuẩn trên môi trƣờng

1 theo phƣơng pháp của Vinogradski (phương pháp 2.2.1.1.1). Kết quả phân

lập đƣợc 20 mẫu (ký hiệu lần lƣợt là A1, A2, …, A20).

Môi trƣờng 1 dùng để phân lập vi khuẩn đƣợc acid hoá bằng acid acetic cũng góp phần ức chế sự phát triển của các chủng vi sinh vật khác. Tuy nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn có thể sống trong môi trƣờng có độ pH thấp.

Bước 2: Nhuộm Gram 20 mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn đƣợc (phương

pháp 2.2.1.1.2), kết quả cho thấy khi quan sát trên kính hiển vi quang học tất cả các mẫu vi khuẩn đều bắt màu hồng với thuốc nhuộm. Điều này chứng tỏ rằng các mẫu vi khuẩn đã tuyển chọn đƣợc đều là Gram âm. Các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha thuộc rất nhiều nhóm khác nhau, bao gồm cả nhóm vi khuẩn Gram dƣơng( vi khuẩn lactic) và nhóm vi khuẩn Gram âm( vi khuẩn Acetobacter). Vì các mẫu vi khuẩn phân lập đƣợc đều là vi khuẩn Gram âm, chính vì vậy chúng tôi quyết định tuyển chọn các mẫu vi khuẩn Acetobacter có khả năng lên men kombucha phục vụ cho mục đích nghiên cứu của đề tài. Bƣớc tiếp theo chúng tôi tiến hành sơ tuyển bằng cách lựa chọn các mẫu vi khuẩn có khả năng chuyển hóa ethanol thành acid acetic.

Hình 3.1. Ảnh mẫu vi khuẩn A15 nhuộm Gram

Bước 3: Từ 20 mẫu vi khuẩn đã chọn đƣợc ở bƣớc 2 tiếp tục tiến hành

tuyển chọn vi khuẩn Acetobacter theo phƣơng pháp của Carr (1968) [24]

(phương pháp 2.2.2.2).

Hình 3.2. Chuyển hoá ethanol thành acid acetic của các mẫu vi khuẩn

Theo Bergey (1992) 16 vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae

gồm 2 chi là Acetobacter và Gluconobacter. Cả hai chi đều có khả năng oxy

hoá ethanol thành acid acetic. Acid acetic làm môi trƣờng có chứa Blue

Bromophenol 0.04% chuyển từ màu xanh lục sang màu vàng (hình 3.1). Các

chủng thuộc chi Acetobacter có khả năng phân giải tiếp tục acid acetic thành

CO2 và H2O phục hồi màu xanh của môi trƣờng. Ngƣợc lại, các chủng thuộc

chi Gluconobacter không có khả năng phân giải acid acetic nên môi trƣờng vẫn giữ màu vàng.

Hầu hết các mẫu vi khuẩn đã phân lập đƣợc đều có khả năng oxy hoá

chủng. Hơn nữa các chủng đã phân lập đƣợc gồm 2 nhóm có tốc độ sinh trƣởng khác nhau (nhóm sinh trƣởng nhanh và nhóm sinh trƣởng chậm) do đó việc theo dõi khả năng phục hồi màu xanh của môi trƣờng để phân biệt 2 chi

Acetobacter và Gluconobacter rất khó khăn, thiếu chính xác. Vì thế, sau bƣớc 3 lựa chọn các chủng làm môi trƣờng chuyển màu vàng và tiếp tục khảo sát