Nghiên cứu một số chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Thái Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI LÊ THỊ HUỆ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LÊN MEN KOMBUCHA TỪ TRÀ THÁI NGUYÊN CHUYÊN NGÀNH: SINH THÁI HỌC MÃ SỐ: 60 42 01 20 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI, 2013 Lời cảm ơn! ===***=== Lời xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Đinh Thị Kim Nhung - ngƣời hƣớng dẫn tận tình bảo, ngƣời cung cấp cho nhiều kiến thức quý báu, giúp đỡ suốt trình tiến hành nghiên cứu Xin gửi lời cảm ơn giúp đỡ thầy, cô giáo tổ môn Vi sinh khoa Sinh Trƣờng ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện sở vật chất, giúp đỡ trình học tập nghiên cứu đề tài Đồng thời xin chân thành cảm ơn giúp đỡ Ban Giám hiệu Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh, anh chị phòng Vi sinh khoa Sinh, em sinh viên K35, K36 làm đề tài phòng Vi sinh khoa Sinh Thƣ viện Trƣờng ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện tốt để hoàn thành đề tài Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới ngƣời thân gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, 12 tháng năm 2013 Tác giả luận văn Lê Thị Huệ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan viết luận văn thật Đây kết riêng Tất số liệu đƣợc thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, số liệu chép hay bịa đặt, không trùng với kết tác giả công bố Trong đề tài có sử dụng số dẫn liệu số tác giả khác, xin phép tác giả đƣợc trích dẫn để bổ sung cho luận văn Nếu sai xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Tác giả luận văn Lê Thị Huệ NHỮNG TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ADP ATP : Adenozin diphotphat : Adenozin triphotphat cs CFU : cộng : Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) FAD : Flavin adenine dinucleotide GlcUA : Glucuronic acid MT : Môi trƣờng NADP : Nicotiamide adenine PABA : para – amino benzoic acid 10 PQQ : Pyrroloquinoline Quinone 11 PQQH2 : Hydroquinone 12 SCOBY : Symbiotic Colony of Bacteria and Yeast 13 STT : Số thứ tự 14 TCVN : Tiêu chuẩn Việt nam 15 VSV : vi sinh vật MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích đề tài Nội dung nghiên cứu Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu 5.1 Phƣơng pháp vi sinh 5.2 Phƣơng pháp hóa sinh 5.3 Phƣơng pháp cảm quan 5.4 Phƣơng pháp toán học Đóng góp đề tài NỘI DUNG CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan kombucha 1.1.1 Sơ lƣợc kombucha 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo 1.1.3 Hệ sinh vật kombucha 1.1.3.1 Vi khuẩn acetic 1.1.3.2 Nấm men 11 1.1.3.3 Vi khuẩn lactic 12 1.1.4 Cơ sở khoa học trình lên men 12 1.1.5 Thành phần hóa học công dụng kombucha 16 1.1.5.1 Thành phần hóa học kombucha 16 1.1.5.2 Công dụng kombucha 17 1.1.5.3 Một số lƣu ý sử dụng 19 1.2 Một số đặc điểm trà Thái Nguyên 19 1.2.1 Phƣơng pháp sản xuất trà xanh 20 1.2.3 Đặc điểm trà xanh Thái Nguyên 20 1.3 Tình hình nghiên cứu kombucha Việt Nam giới 20 1.3.1 Trên giới 20 1.3.2 Ở Việt Nam 22 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 Vật liệu thiết bị nghiên cứu 25 2.1.1 Đối tƣợng 25 2.1.2 Hóa chất thiết bị 25 2.1.3.1 Hóa chất 25 2.1.3.2 Thiết bị 25 2.1.3 Môi trƣờng 26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh 26 2.2.1.1 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn quan sát hình thái tế bào tiêu nhuộm Gram 26 2.2.1.2 Phƣơng pháp xác định số lƣợng tế bào vi sinh vật phƣơng pháp đếm 28 2.2.1.3 Bảo quản chủng giống 29 29 2.2.2 Phƣơng pháp hoá sinh 29 2.2.2.1 Phát hoạt tính catalase 29 2.2.2.2 Phát khả oxy hoá rƣợu êtylic thành acid acetic 29 2.2.2.3 Phát khả oxy hoá acid acetic 30 2.2.2.4 Phát khả chuyển hóa glycerol thành dihydroxyacetone 30 2.2.2.5 Sinh trƣởng môi trƣờng Hoyer 31 2.2.2.6 Phát khả tổng hợp cellulose 31 31 2.2.3 Phƣơng pháp cảm quan 32 2.2.4 33 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 34 ăng lên men kombucha 39 3.2.1 Xác định hàm lƣợng acid tổng số đƣợc tạo chủng vi khuẩn Acetobacter 39 3.2.2 Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha 40 3.2.3 Phân loại chủng vi khuẩn tuyển chọn để lên men kombucha 42 3.2.3.1 Hình thái tế bào học 42 3.2.3.2 Sinh trƣởng môi trƣờng thạch đĩa 42 3.2.3.3 Đặc tính sinh hóa 43 3.2.4 Nghiên cứu động thái sinh trƣởng chủng vi khuẩn Acetobacter A2 A15 46 3.3 Khảo sát ảnh hƣởng số yếu tố tới trình lên men kombucha 48 3.3.1 Khảo sát ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến trình lên men kombucha 48 3.3.1.1 Khảo sát ảnh hƣởng (NH2)2SO4 48 3.3.1.2 Khảo sát ảnh hƣởng MgSO4.7H2O 49 3.3.1.3 Khảo sát ảnh hƣởng KH2PO4 50 3.3.2 Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng tới trình lên men kombucha 51 3.3.2.1 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian lên men 51 3.3.2.2 Khảo sát ảnh hƣởng hàm lƣợng giống bổ sung ban đầu 53 3.3.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng độ pH ban đầu 55 3.3.2.4 Khảo sát ảnh hƣởng nhiệt độ 56 3.4 Xây dựng quy trình lên men kombucha 57 3.4.1 Khảo sát thiết bị lên men 57 3.4.2 Quy trình sản lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm 59 3.4.3 Kiểm tra, đánh giá chất lƣợng sản phẩm 64 3.4.3.1 Đánh giá sản phẩm kombucha phƣơng pháp cảm quan 64 3.4.3.2 Kiểm tra chất lƣợng sản phẩm 64 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 Kết luận 66 Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 DANH MỤC HÌNH, BẢNG HÌNH 1.1 Độ pH kombucha 1.2 Kombucha bị nhiễm nấm mốc 1.3 Cấu trúc hóa học số hợp chất trà kombucha 1.4 “ Con nấm” (SCOBY) 1.5 Kombucha đƣợc lên men bình chứa có kích thƣớc hình dạng khác 1.6 Cơ chế phân giải đƣờng tế bào nấm men 13 1.7 Quá trình oxi hóa rƣợu thành acid acetic 15 1.8 Trà Thái Nguyên 20 3.1 Ảnh mẫu vi khuẩn A15 nhuộm Gram 35 3.2 Chuyển hoá ethanol thành acid acetic 35 3.3 Khả oxy hoá acetate 37 3.4 Hoạt tính catalase Acetobacter 37 3.5 Kết thử hoạt tính cellulose vi khuẩn Acetobacter nhóm 39 3.6 Hình thái tế bào vi khuẩn Acetobacter A2 A15 kính hiển vi quang học (x1000 lần) 42 3.7 Khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter A2 A15 môi trƣờng thạch đĩa 43 3.8 Mẫu vi khuẩn Acetobacter A2 A15 môi trƣờng thạch nghiêng 43 3.9 Đồ thị biểu diễn động thái sinh trƣởng chủng Acetobacter A2 A15 47 3.10 Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng (NH4)2SO4 đến hàm lƣợng acid tổng số sinh chủng Acetobacter A2 A15 48 3.11 Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng MgSO4 7H2O đến hàm lƣợng acid tổng số sinh chủng Acetobacter A2 A15 49 3.12 Biểu đồ biểu diễn ảnh hƣởng KH2PO4 đến hàm lƣợng acid tổng số sinh chủng Acetobacter A2 A15 50 3.13 Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A2 bổ sung hàm lƣợng KH2PO4 1,0 1,5 (g/l) 50 3.14 Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A2 với thời gian lên men 5, ngày 53 3.15 Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A15 với giá trị pH ban đầu 55 3.16 Ảnh kombucha lên men từ chủng Acetobacter A2 nhiệt độ 200C 300C 57 3.17 Lên men kombucha cốc inox thƣờng 150ml, sau trình lên men phần đáy cốc chứa môi trƣờng bị ăn mòn acid acetic 58 3.18 Lên men kombucha cốc thủy tinh 250ml 58 3.19 Lên men kombucha hộp nhựa 500ml 58 3.27 Quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm 61 3.28 Kết thử nghiệm đánh giá sản phẩm kombucha 65 BẢNG 1.1 Thành phần hóa học trà kombucha 17 2.1 Các tiêu đánh giá mức độ cảm quan kombucha 32 2.2 Hệ số quan trọng tiêu 33 2.3 Bảng quy định đánh giá mức chất lƣợng sản phẩm 33 3.1 Hàm lƣợng acid tổng số sinh trình lên men kombucha từ chủng vi khuẩn Acetocbacter 40 3.2 Khả tạo độ trong, hƣơng thơm mùi vị đặc trƣng kombucha từ chủng vi khuẩn Acetobacter 41 3.3 Đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn Acetobacter……….…43 3.4 Quá trình sinh trƣởng chủng Acetobacter A15 A2 (x106 tế bào) 46 3.5 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian lên men đến hàm lƣợng acid tổng số sinh chủng Acetobacter A2 A15 52 3.6 Khảo sát ảnh hƣởng hàm lƣợng giống đến hàm lƣợng acid tổng số sinh chủng Acetobacter A2 A15 54 3.7 Khảo sát ảnh hƣởng pH đến hàm lƣợng acid tổng số sinh chủng Acetobacter A2 A15 55 58 Hình 3.17 Lên men kombucha cốc inox thường 150ml, sau trình lên men phần đáy cốc thường bị ăn mòn acid acetic Hình 3.18 Lên men kombucha cốc thủy tinh 250ml Hình 3.19 Lên men kombucha hộp nhựa 500ml Từ kết quan sát bình lên men sau trình lên men kết thúc, kết hợp với trình tham khảo giá vật liệu thị trƣờng Chúng tiến hành so sánh số đặc điểm khác lên men kombucha dụng cụ làm inox, thủy tinh, nhựa bảng 3.9 59 Bảng 3.9 Một số đặc điểm so sánh lên men kombucha dụng cụ làm vật liệu inox, thủy tinh, nhựa Đặc điểm Bị ăn mòn acid Vật liệu Inox Thủy tinh Nhựa Inox bị ăn mòn Không Không Không quan sát đƣợc Quan sát dễ Quan sát dễ dàng dàng acetic (pH = 3) Có thể quan sát trình lên men Giá thành bình Cao (inox thƣờng có Cao (> 50.000 Thấp (> 6.000 lên men kích thước giá > 30.000 đồng, inox đồng) đồng) 10×15×4 chịu acid có giá > Dễ vỡ Có thể bị biến 70.000 đồng) Rủi ro trình Có thể bị biến dạng sử dụng dạng Từ kết dẫn bảng 3.9, thấy: bình lên men làm vật liệu inox chịu acid có nhƣợc điểm lớn không quan sát đƣợc trình lên men giá thành cao, không nên dùng để lên men kombucha Bình làm vật liệu thủy tinh dùng lên men kombucha nhƣng dễ vỡ, giá thành lại cao Bình lên men làm vật liệu nhựa chịu nhiệt không bị ăn mòn acid acetic, quan sát đƣợc diễn biến trình lên men, sử dụng thời gian dài (ít tuần lên men lần, liên tục tháng) nhựa bị cứng vỡ, nhiên giá thành nhựa chịu nhiệt lại rẻ Như vậy, sử dụng bình làm nhựa tốt cho trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm 3.4.2 Quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm Trong trình lên men kombucha sử dụng nguồn nguyên liệu khác nhau, nhiên định sử dụng nguồn nguyên liệu trà xanh để lên men với mong muốn sản phẩm thu đƣợc vừa có mùi vị đặc trƣng 60 kombucha, vừa có hƣơng vị trà xanh Trà xanh sản phẩm đƣợc sử dụng phổ biến gia đình với nhiều nguồn gốc xuất xứ khác nhau, sản phẩm lựa chọn trà xanh Thái Nguyên làm nguyên liệu lên men kombucha Trà xanh Thái Nguyên sản phẩm tiếng đƣợc nhiều ngƣời tin dùng có nhiều đặc điểm khác biệt: pha trà ngửi thấy mùi thơm nhẹ (thơm mùi cốm), nƣớc trà pha có màu xanh trong, uống trà có cảm giác chát đầu lƣỡi, sau uống có vị cổ họng Hàm lƣợng tanin trà xanh Thái Nguyên cao, có số vitamin trà có tác dụng tốt cho sức khỏe Sau nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng điều kiện lên men, với tham khảo tài liệu cách làm kombucha, kết hợp với quy trình lên men kombucha quy gia đình, xây dựng quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm nhƣ sau: * Nguyên liệu: Nƣớc: 1000 ml Trà xanh Thái Nguyên: 20g Đƣờng saccharose: 100g Bình thủy tinh, khăn vải * Quy trình lên men kombucha 61 Nƣớc Gia nhiệt Đƣờng, nƣớc Trích ly Trà Lọc Bã Làm nguội Nấu sirô Lọc; làm nguội Phối trộn Dịch trà đƣờng Nấm men Thanh trùng Vi khuẩn Dịch lên men Lên men nhiệt độ 300 C, pH:4,2 Thời gian lên men ngày Thu dịch lên men Thanh trùng Đóng chai Sản phẩm kombucha Hình 3.20 Quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm 62 Thuyết minh quy trình * Giai đoạn 1: Chế biến dịch trà đường Bước 1: Chế biến dịch trà Tuyển chọn trà, tiến hành gia nhiệt nƣớc, trích ly chất hòa tan trà khô để thu đƣợc dịch trà tiêu diệt vi sinh vật Nhiệt độ gia nhiệt nƣớc phải thích hợp để hiệu suất trích ly tối ƣu nhƣng giữ đƣợc chất lƣợng cảm quan trà tốt Tỉ lệ nƣớc/trà = 1000ml/20g, nhiệt độ 1000C phút Bước 2: Lọc Mục đích: nhằm tách bã chè khỏi dịch trà, làm cho dịch trà không bị vẩn đục làm tăng giá trị cảm quan sản phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho trình lên men Bước 3: Làm nguội Mục đích: hạ thấp nhiệt độ dịch trà, hạn chế xâm nhập vi sinh vật thuận tiện cho trình phối trộn, tránh làm hƣơng vị đặc trƣng sản phẩm Bước 4: Nấu sirô, lọc làm nguội Nấu: đƣờng trƣớc đƣa vào phối trộn với dịch trà phải nấu thành dạng syrup có nồng độ 60 – 70% Sirô thiết phải đƣợc đun sôi, lọc làm nguội Mục đích trình đun sôi sirô đun sôi tiêu diệt đƣợc vi sinh vật có đƣờng nƣớc, mặt khác tạo điều kiện tốt để biến saccharose thành glucose fructose làm giảm độ nhớt dung dịch đƣờng giúp cho việc lọc dễ dàng Yêu cầu sirô: màu sắc suốt, không màu có màu vàng nhạt Có mùi đặc trƣng sirô, mùi vị lạ Lọc – làm nguội sirô: Lọc sirô trƣớc hết phải lọc trạng thái nóng để giảm độ nhớt Lọc nhằm mục đích tách hết hợp chất học nhƣ rác, đất cát lẫn vào đƣờng trình vận chuyển bảo quản Sau lọc, cần làm lạnh nguội để sirô không bị sẫm màu 63 Bước 5: Phối trộn Dịch sirô sau làm nguội đƣợc phối trộn với dịch trà để tạo thành dung dịch đồng có nồng độ theo yêu cầu Sau phối trộn, dịch trà cần đƣợc trùng để nguội nhiệt độ phòng (28 – 320C) để chuẩn bị cho trình lên men * Giai đoạn 2: Lên men Bổ sung nấm men (10%V), vi khuẩn (10%V) vào dịch lên men Đây trình lên men hiếu khí nên dễ nhiễm vi sinh vật lạ đặc biệt nấm mốc Do cần điều chỉnh pH dịch trà ≤ 4,2 Khoảng pH tạo điều kiện bất lợi cho xâm nhiễm đa số loài vi sinh vật nấm mốc Thời gian lên men khoảng ngày Lên men đến đạt pH cuối = 2,5 * Giai đoạn 3: Hoàn thiện thu sản phẩm Bước 1: Thu dịch lên men Sau trình lên men kết thúc, vớt nấm kombucha, để thu lấy dịch lên men đem lọc Thao tác vớt nấm kombucha phải đảm bảo điều kiện vệ sinh nghiêm ngặt, hạn chế nhiễm vi sinh vật từ bên môi trƣờng vào Bước 2: Lọc dịch lên men Mục đích: loại bỏ cặn, xác vi sinh vật sau trình lên men, làm dịch lên men, tăng chất lƣợng cảm quan sản phẩm, sau lọc, dịch lên men phải trong, không vẩn đục, giữ đƣợc mùi vị, màu sắc đặc trƣng sản phẩm Bước 3: Thanh trùng Mục đích: tiêu diệt nấm men, vi khuẩn, đình hoàn toàn trình lên men, tiêu diệt vi sinh gây hại, tăng thời gian bảo quản sản phẩm 64 Bước 4: Thu sản phẩm Sau đƣợc trùng, kombucha đƣợc đóng chai Trong khâu đóng chai bị nhiễm, khâu cần tuân thủ nghiêm ngặt yêu cầu vệ sinh công nghiệp Bảo quản sản phẩm tủ lạnh, thời gian tháng 3.4.3 Kiểm tra, đánh giá chất lượng sản phẩm 3.4.3.1 Đánh giá sản phẩm kombucha phương pháp cảm quan Lên men kombucha từ chủng vi khuẩn Acetobacter A15, nấm men Saccharomyces M2 (chủng nấm men Lâm Thị Hồng Liên phân lập tuyển chọn từ kombucha), vi khuẩn lactic Hội đồng gồm ngƣời (A, B, C, D, E, G, H) đánh giá chất lƣợng mẫu kombucha phƣơng pháp cảm quan cho điểm [14] Bảng 3.10 Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha phương pháp cảm quan Chỉ tiêu chất lượng Độ màu sắc Mùi Điểm chưa có trọng lượng Tổng số điểm chưa có trọng Điểm trung bình chưa có trọng lượng Hệ số quan trọng Điểm hiệu chỉnh A B C D E G H 5 5 33 4,7 0,8 3,8 4 5 5 33 4,7 1,2 5,6 4 5 32 4,6 2,0 9,2 Vị Số điểm chung: 18,6 Đối chiếu với bảng 2.3, theo TCVN 3217- 79, mẫu kombucha đạt mức chất lƣợng tốt 3.4.3.2 Kiểm tra chất lượng sản phẩm Sản phẩm kombucha thu đƣợc có độ trong, màu vàng tƣơi, vị đƣờng, vị chua mát, vị chát trà, vị giống rƣợu táo, mùi giống mật ong pha 65 loãng, có ga Chúng gửi mẫu kiểm tra vi sinh hàm lƣợng số kim loại nặng sản phẩm Kết quả: sản phẩm đạt chất lƣợng an toàn cho ngƣời sử dụng Hình 3.21 Kết thử nghiệm đánh giá sản phẩm kombucha 66 VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Phân lập đƣợc 20 mẫu vi khuẩn, tuyển chọn sơ mẫu vi khuẩn Acetobacter, định loại gồm chủng: A xylinus, A aceti, A pasteurianus Nghiên cứu động thái sinh trƣởng chủng vi khuẩn Acetobacter A2 A15 1.2 Đã nghiên cứu ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng điều kiện lên men tới trình lên men kombucha Hàm lƣợng chất dinh dƣỡng thích hợp bổ sung: (NH4)2SO4 : g/l; MgSO4.7H2O: 1,5 g/l; KH2PO4: 1,5 g/l; Thời gian lên men: ngày; Hàm lƣợng giống bổ sung 10%; pH: – 4,5; nhiệt độ: 300C 1.3 Đã lựa chọn thiết bị lên men phù hợp cho trình lên men kombucha vật liệu nhựa thủy tinh Xây dựng quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm Kiến nghị 2.1 k 2.2 Nghiên cứu định hƣớng vào việc tìm kiếm giải pháp sử dụng nguồn nguyên liệu trà tỉnh Thái Nguyên, đồng thời đa dạng hóa sản phẩm nƣớc giải khát có nguồn gốc tự nhiên 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Đặng Hùng Thắng (1999), Thống kê ứng dụng, Nxb Giáo dục, tr 214- 267 [2] Đinh Thị Kim Nhung (1996), Nghiên cứu số đặc điểm sinh học vi khuẩn Acetobacter ứng dụng chúng lên men acid acetic theo phương pháp chìm, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ Phạm Hà Nội [3] Lƣơng Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nxb Nông nghiệp [4] Lƣơng Đức Phẩm (2006), Nấm men công nghiệp , Nxb Khoa học Kĩ thuật [5] Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vƣơng Trọng Hào (2011), Thực hành vi sinh vật học, Nxb Đại học Sƣ Phạm Hà Nội [6] Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vƣơng Trọng Hào (1990), Thực hành vi sinh vật, Nxb Giáo Dục [7] Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lƣơng, Đoàn Xuân Mƣợu, Nguyễn Đình Quyết, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nxb khoa học kĩ thuật [8] Nguyễn Lân Dũng ( 1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1-2-3, Nxb Khoa học &kĩ thuật, Hà Nội [9] Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh vật học (sách dịch), Nxb “Mir” Moskwa [10] Nguyễn Thành Đạt (1999), Cơ sở vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục [11] Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo (1986), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục [12] Vũ Thị Minh Đức (2001) Thực tập vi sinh vật Nxb ĐHQG Hà Nội, tr - 50 [13] Trần Linh Thƣớc (2006), Phương pháp phân tích vi sinh vật, Nxb giáo dục, trang 1- 29, 40- 69 [14] TCVN, 3217 – 79 Rượu, phân tích cảm quan, phương pháp cho điểm 68 [15] Balentine DA (1997), Special issue: Tea and Health, Crit Rev Food Sci Nutr 8:691-692 [16] Bergey H, John G Holt.( 1992) Bergey‟s manual of dererminativa bacteriology Wolters kluwer health, p.71- 84 [17] Boesch, C., Trček, J., Sievers, M & Teuber, M (1998) Acetobacter intermedius sp nov Syst Appl Microbiol 21, 220–229 [18] Carr J.G (1968), “Identification of acetic acid bacteria”, Identification methods for microbiologists, Academic Press, London, pp – [19] Cavusoglu K., Gluer P (2010), Protective effect of kombucha mushroom tea on chromosomal aberrations induced by gamma radiation in human peripheral lymphocytes in vitro, J Environ Biol 31, N5.P 851-856 [20] Dutta D., Gachhui R (2006), Novel nitrogen-fixing Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov., isolated from Kombucha tea, Int J Syst Evol Microbiol 56 pt8 p.1899-1903 [21] Dutta D., Gachhui R (2007), Nitrogen-fixing and cellulose producing Gluconacetobacter kombucha sp.nov., isolated from Kombucha tea, Int J Syst Evol Microbiol 57 pt2 p.353-357 [22] Farnworth.E Dufresne.C,(1999), Tea, Kombucha, and health, Food Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food canada,3600 Casavant Blvd.West, Saint-Hyacinthe,QC,Canada J2S 8E3 [23] Frateur J (1950), Essai sur la systématique des Acétobacter, La cellule, Vol 53, pp 278 – 398 [24] Greenwalt CJ, Steinkraus KH, Ledford RA (2000), Kombucha, the fermented tea: microbiology, composition, and claimed health effects, J.Food Prot 63:976-981 [25] Hai-Peng Cheng, Pei-Ming Wang, Jech-Wei Chen, Wen-Teng Wu (2002), Cultivation of Acetobacter xylinum for bacterial cellulose 69 production in a modified airlift reator, Vol 35, Biotechnol Appl Biochem, p 125-132 [26] Jean F MacFaddin, (2000), Biochemical tests for identification of medical bacteria, Third edition [27] J Reiss, (1994), Influence of different sugars on the metabolism of the tea fungus., Zeitschrift fuer Lebensmittel-Untersuchung und Forschung [28] Jayabalan R., Malini K., Sathishkumar M., Swaminathan K.,Yun S.-E., Biochemical characteristics of tea fungus produced du-ring kombucha fermentation // Food Sci Biotechnol.–2010.– 19 ,N 3.–P 843–847 [29] Jayabalan R, Marimuthu S, Swaminathan K (2007), Changes in content of organic acids and tea polyphenols during kombucha tea fermentation, Food Chem 102:392-398 [30] Jayarajah CN, Skelley AM, Fortner AD, Mathies RA (2007), Analysis of neuroactive amines in fermented beverages using a portable microchip capillary electrophoresis system, Anal Chem 21:8162-8169 [31] J Trcek, (2005), Quick identification acetic acid bacteria based on nucleotide sequences of the 16S-23S rDNA internal transcribed spacer regio and of the PQQ, dependent alcohol dehydrogenase gene, Systematic and Applied Microbiology 28(8) [32] Kang MY, Park YH, Kim BS, Seo SY, Jeong BC, Kim JI, Kim HH (2012), Preventive effects of green tea( Camellia sinensis var assamica ) on diabetic nephropathy, Yonsei Med J 1:138-144 [33] Kappel T, Anken RH (1993), The tea-mushroom, Mycol 7:12-13 [34] K.H Steinkraus, K.B Shapiro, J.H Hotchkiss, R.P Mortlock,(1996), Examinations on Antibiotic Activity of Tea Fungus Kombucha Beverage, Acta Biotechnologica 70 [35] Kurtzman CP, Robnett CJ, Basehoar-Powers E (2001), Zigosaccharomyces kombuchaensis , a new ascosporogeneous yeast from , Kombucha tea, FEMS Yeast Res 2:133-138 [36] Landi H (2009), Tea Revolution, Beverage World 10:78 [37] Lončar E, Petrović S, Malbaša R, Verac R (2000), Biosynthesis of glucuronic acid by means of tea fungus, Nahr 44:138-139 [38] Liu CH, Hsu WH, Lee FL, Liao CC (1996), The isolation and identification of microbes from a fermented tea beverage, Haipao, and their interactions during Haipao fermentation, Food Microbiol 6:407415 [39] Mayser, P; Fromme, S; Leitzmann, C; Gründer, K (1995), The yeast spectrum of the “tea fungus Kombucha”, Mycoses 38 (7–8): 289–95 [40] Nguyen, Vu Tuan; Flanagan, Bernadine; Gidley, Michael J.; Dykes, Gary A (2008), Characterization of Cellulose Production by a Gluconacetobacter xylinus strain from Kombucha Current Microbiology 57 (5): 449–53 [41] Paquin P (ed) (2009), Functional and Speciality Beverage Technology, Woodhead Publishing Limited, Cambridge [42] Petrushevska-Tozi L., Bauer-petrovska B (2000), Mineral and water soluble vitamin content in the Kombucha drink, Int J Food Sci Technol 35, N2.P.201-205 [43] R.A Ledford C.J Greenwalt, and K.H Steinkraus, Determination And characterization of the anti-microbial activity of the fermented tea Kombucha, Department of Food Science [44] Steinkraus KH (1996), Handbook of indigenous fermented foods, 2nd edn, Marcel Dekker, New York 71 [45] Teoh AL, Heard G, Cox J (2004), Yeast ecology of Kombucha fermentation, Int J Food Microbiol 2: 119-126 [46] The American Center of Disease Control (1995), Unexplained Severe Illness Possibility Associated with Consumption of Kombucha Tea – Iowa, 1995, Morb Mortal Wkly Rep 48:892-900 [47] US Food and Drug Administration (1995), FDA Talk Paper: FDA cautions consumers on "Kombucha mushroom tea." Rockville, Md.: National Press Office, Talk Pap, T95-15 [48] Velicanski, Aleksandra; Cvetkovic, Dragoljub; Markov, Sinisa; Tumbas, Vesna; Savatovic, Sladjana (2007), "Antimicrobial and antioxidant activity of lemon balm Kombucha" Acta periodica technologica (38): 165–72 [49] V Robles – Olvera T Romero – Cortes, G Rodriguez – Jimenez and M Ramirez – Lepe, (January 2012), Isolation and characterization of acetic acid bacteria in cocoa fermentation, African Journal of Microbiology Research Vol [50] Wright R (2009), Functional Beverages: Surviving or Thriving? Nutraceuticals World [51] Yamada, Y., Hoshino, K & Ishikawa, T (1997) The phylogeny of acetic acid bacteria based on the partial sequences of 16S ribosomal RNA: the elevation of the subgenus Gluconacetobacter to the generic level Biosci Biotechnol Biochem 61, 1244–1251 [52] Yapar K., Cavusoglu K., Oruc E, Yalcin E (2010), Protective effect of kombucha mushroom tea on phenol-induced cytotoxicity in albino mice J Environ Biol 31 P 615-621 [53] http://cand.com.vn/News/PrintView.aspx?ID=153269 72 [54] http://tvdt.khoahoctre.com.vn/index.php/thƣ-viện/tìm-kiếm.html? [55] cns.ctu.edu.vn/index.php/en/student-page-2/43-khoa-khtn/272-bao-cao-semeninar-cua-bo-mon-hoa-ngay-25-03-2013