Nghiên cứu một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh sản cellulase trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINHCELLULASE TRONG ĐẤT ĐỒI TẠI KHU VỰC XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 60 42 01 20 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn: PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung HÀ NỘI, 2013 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Cellulose thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật Đó loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp Việc phân huỷ cellulose tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hưởng đến tốc độ nhiều trình sản xuất công nghiệp Enzyme cellulase nhóm enzyme thủy phân có khả cắt mối liên kết β-1,4-0-glycoside phân tử cellulose, olygosaccharide, disaccharide số chất tương tự khác Hiện nay, việc sử dụng enzyme cellulase số ngành công nghiệp như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, sản xuất dung môi hữu đặc biệt xử lý rác thải hữu vấn đề người đặc biệt quan tâm Nhiều nghiên cứu chứng minh enzyme cellulase có nhiều khả triển vọng giải vấn đề nêu giám định xử lý ô nhiễm môi trường Chúng hoạt động chất thải khó xử lý, làm thay đổi đặc tính chất thải đưa chúng dạng dễ xử lý chuyển thành sản phẩm có giá trị Enzyme cellulase sinh tổng hợp nhiều loài khác như: loài xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men động vật nguyên sinh Ngoài ra, cellulase có loài sinh vật khác thực vật động vật.Trong số nhóm vi sinh vật nêu xạ khuẩn phân giải cellulose đối tượng nhà khoa học đặc biệt quan tâm Xạ khuẩn đất nhóm sinh vật đất có số lượng lớn Chúng chiếm tới 10 - 70 % số tế bào vi sinh vật đất Ở môi trường trung tính xạ khuẩn phát triển mạnh đất giàu hữu thông thoáng Xạ khuẩn có vai trò phân giải chất hữu phân giải đường tan nước, hemicellulose cellulose Xạ khuẩn tham gia vào trình hình thành acid mùn Một vài loài xạ khuẩn có khả cố định nitơ tự từ khí trời cộng sinh với thực vật thuộc đậu Xạ khuẩn vi sinh vật tạo kháng sinh chủ yếu (tới 80 % chất kháng sinh) đất có nhiều xạ khuẩn trồng bị bệnh [8] Phường Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có diện tích tự nhiên 423,9 ha, đất diện tích đất đồi (lâm nghiệp) 22,3 Đất có thành phần giới nhẹ, thường có kết cấu kết cấu, tầng đất mỏng dễ bị rửa trôi, hàm lượng mùn thấp [11] Do vậy, việc khảo sát chủng xạ khuẩn đất đồi có khả phân hủy cellulose cao việc có ý nghĩa quan trọng việc cải tạo đất bảo vệ môi trường Xuất phát từ lý trên, chọn đề tài: “Nghiên cứu số chủng xạ khuẩn có khả sinh cellulase đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc” Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu số chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose góp phần tăng độ phì nhiêu đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc Nhiệm vụ nghiên cứu 3.1 Sơ lược đặc điểm tự nhiên khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 3.2 Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn từ đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 3.3 Đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử tính chất nuôi cấy chủng Đ4, Đ12 3.4 Ảnh hƣởng số yếu tố môi trƣờng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh cellulase chủng xạ khuẩn Đ4, Đ12 4 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu Một số chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose từ đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc; thời gian nghiên cứu từ tháng năm 2012 đến tháng năm 2013 Phƣơng pháp nghiên cứu 5.1 Phương pháp lấy mẫu 5.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 5.3 Phương pháp bảo quản chủng giống 5.4 Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 5.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa xạ khuẩn 5.6 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase xạ khuẩn 5.7 Phương pháp thống kê xử lý kết Những đóng góp đề tài Đây kết nghiên cứu khảo sát có mặt số chủng xạ khuẩn có khả sinh enzyme cellulase đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc NỘI DUNG CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm phân loại xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) phân bố rộng rãi tự nhiên Chúng có đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, chí chất mà vi khuẩn, nấm mốc không phát triển Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác thảm thực vật Theo Waksman gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm - 45% tổng số VSV [32] Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường Chúng có nhiều lớp đất trung tính kiềm yếu acid yếu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn có lớp đất kiềm acid lớp đất kiềm, số lượng xạ khuẩn thay đổi theo thời gian năm Xạ khuẩn tham gia tích cực vào trình chuyển hóa nhiều hợp chất đất, nước, dùng để sản xuất nhiều enzyme protease, amylase, cellulase… số acid amin acid hữu Một số xạ khuẩn gây bệnh cho người, động vật [6] 1.1.1 Một số phương pháp phân loại xạ khuẩn Cùng với phát triển mạnh sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học … nên việc định tên chủng xạ khuẩn tiến hành tương đối nhanh chóng xác với nhiều phương pháp phân loại số, nghiên cứu chủng loại phát sinh… Song người ta chủ yếu dựa vào đặc điểm hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học sinh học phân tử 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy Đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn Để làm cho chủng xạ khuẩn cần định loại biểu đầy đủ đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng môi trường dinh dưỡng khác điều kiện nhiệt độ thời gian định Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh ghi lại đặc điểm hình thái nuôi cấy xạ khuẩn, đặc biệt quan mang bào tử, hình dạng bề mặt bào tử dựa vào đặc điểm hình thái người ta chia xạ khuẩn thành nhóm chính: Nhóm 1: Gồm xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bào tử phân hóa thành HSKS HSCC Nhóm 2: Gồm xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hướng vuông góc với tạo thành cấu trúc tương tự nang bào tử Nhóm 3: Gồm xạ khuẩn có dạng Nocardia, sinh sản cách phân đốt hệ sợi Nhóm 4: Gồm xạ khuẩn có dạng Corynebacter dạng cầu, tế bào có hình chữ V,T thường hệ sợi Dựa vào nghiên cứu xạ khuẩn môi trường khác người ta chia hình chuỗi bào tử thành kiểu: + Kiểu S (Spira): chuỗi bào tử xoắn + Kiểu SRA (Spira Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử xoắn có dạng móc câu hay xoắn không hoàn toàn + Kiểu SRF (Spira Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử xoắn, cong đến thẳng + Kiểu RA (Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử có móc có khóa + Kiểu RA – RF (Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử có móc hay xoắn không hoàn toàn + Kiểu RF (Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử thẳng lượn sóng Việc sử dụng đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy coi liệu dùng phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên, ta biết xạ khuẩn không bền vững mặt di truyền, thường xuyên xảy xếp lại trong phân tử DNA Trong loài biểu khác hình thái hay loài khác giống mặt hình thái Vì vậy, để phân loại xác, ngày người ta cần nghiên cứu thêm tiêu khác bổ sung đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử [24] 1.1.1.2 Đặc điểm hóa phân loại( Chemotaxonomy) Đặc điểm hóa phân loại sử dụng rộng rãi hiệu vòng 20 năm trở lại Đây phương pháp có hiệu thông qua việc định tính định lượng thành phần hóa học tế bào VSV Hóa phân loại chủ yếu dựa vào đặc điểm sau: Type thành phần tế bào dựa sở phân tích acid amin thành phần pettide đường thành phần tế bào hay polysaccaride gắn vào thành tế bào Type peptidoglycan (PG) dựa vào thông tin thành phần cấu trúc mạch tetrapeptide PG cầu nối peptide liên kết mắt xích PG Acid mycolic phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium Cornebacter Đây đặc điểm phân loại cho chi Acid béo thường sử dụng phân loại acid béo bão hòa mạch thẳng không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso enteiso metyl hóa nguyên tử cacbon thứ 10 Sự có mặt acid 10 – metylloctade canoit (acid tubereulostearinoic) đặc điểm để phân loại đến chi [8] Phospholipid có type (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng, có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn Trong phân loại xạ khuẩn type thành tế bào đặc điểm quan trọng Khi muốn đưa loài mô tả loài có ý nghĩa đó, người ta không xác định thành tế bào 1.1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác khả đồng hóa nguồn cacbon nitơ, nhu cầu chất kích thích sinh trưởng, khả biến đổi chất khác nhờ hệ thống ezyme Nhu cầu oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả chịu muối yếu tố khác môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng phát triển khác nhau, tính chất đối kháng nhạy cảm với chất kháng sinh, khả tạo thành chất kháng sinh sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác xạ khuẩn Hopwood (1997) khẳng định phần lớn đặc điểm sinh lý, sinh hóa đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động có giá trị thấp mặt phân loại Do đó, tính không ổn định biến dị cao xạ khuẩn mà ngày nguyên tắc sử dụng đặc điểm sinh lý, sinh hoá để phân loại xạ khuẩn phải thay đổi [25] 1.1.1.4 Phân loại số (Numerical taxonony) Để phát loài sở khác đặc điểm sinh lý, sinh hóa người ta sử dụng kết dựa phân loại số Phương pháp dưạ đánh giá số lượng mức độ giống VSV theo số lớn đặc điểm chủ yếu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Để so sánh chủng xạ khuẩn với nhau, người ta vào hệ số giống (hệ số S – Similarity) có công thức tính hệ số S hay sử dụng Công thức Sokal Michener (SSM) SSM (AB)= (Ns + + Ns-)* 100/ (Ns + + Ns- + Nd) Trong đó: SSM (AB) : Mức độ giống hai cá thể A, B (%) Ns + : Số tính trạng giống Nd : Số tính trạng khác Ns- : Số tính trạng đối lập Công thức Jacard (SJ) SJ(AB)= Ns * 100/ (Ns + Nd) Trong đó: SJ(AB) : mức độ giống hai chủng A, B (%) Ns : Tổng số đặc điểm dương tính (giống nhau) hai chủng so sánh Nd : Tổng số đặc điểm khác (tổng số đặc điểm dương tính chủng âm tính chủng kia) Kết phân loại số vẽ sơ đồ phân nhánh (kiểu “rễ cây”) thông số Dựa vào sơ đồ chủng giống nhiều xếp vào nhóm Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ 13 cụm với đại diện định [33] 1.1.1.5 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces Chi Streptomyces giống xạ khuẩn bậc cao Waksman Hernici đặt tên năm 1943 [32] Đây chi có số lượng loài mô tả lớn Các đại diện chi có HSKS HSCC phát triển phân nhánh Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính khoảng – mm Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào chất Bề 10 mặt khuẩn lạc thường phủ KTKS dạng nhung, dày chất, có kỵ nước Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bào tử đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có hình dạng khác tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng… Bào tử hình thành cuống sinh bào tử hai phương pháp phân đoạn cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình nhăn… tùy thuộc vào loài xạ khuẩn môi trường nuôi cấy Thường môi trường có nguồn đạm vô glucose, bào tử biểu đặc điểm rõ Màu sắc khuẩn lạc hệ sợi khí sinh khác tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc biến đổi nuôi cấy môi trường khác Vì vậy, Ủy ban Quốc tế phân loại xạ khuẩn ISP nêu môi trường phương pháp chung để phân loại nhóm VSV Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gr+, hiếu khí, dị dưỡng chất hữu Nhiệt độ tối ưu thường 25 - 30oC, pH tối ưu 6,5 – 8,0 Một số loài phát triển nhiệt độ cao thấp (xạ khuẩn ưa nhiệt ưa lạnh) Xạ khuẩn chi có khả tạo thành số lượng lớn chất kháng sinh ức chế vi khuẩn, nấm sợi, tế bào ung thư, virus nguyên sinh động vật Cho đến để xác định cho thành phần loài chi Streptomyces, nhà phân loại sử dụng hàng loạt điều kiện khóa phân loại khác [32] 1.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 1.1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn * Khuẩn lạc 48 Bảng 3.7 Hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn phân lập Hoạt tính Số chủng Rất mạnh Mạnh CMC BG CMC Yếu Trung bình BG CMC BG CMC BG Số lượng chủng 0 13 12 Tỷ lệ (%) 0 17.6 11.8 76.5 70.6 5.9 17.6 Mức độ hoạt tính: Rất mạnh D – d ≥ 30mm Mạnh 20mm ≤ D – d < 30mm Trung bình 10mm ≤ D – d < 20mm Yếu D – d