Nghiên cứu chọn và sử dụng thảo dược thay thế kháng sinh bổ sung thức ăn cho lợn

Đặt vấn đề Các chất kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã được sử dụng từ những năm 1940 trong khẩu phần ăn của lợn nhằm tăng khả năng sinh trưởng, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn

1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Các chất kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã được sử dụng

từ những năm 1940 trong khẩu phần ăn của lợn nhằm tăng khả năng sinh trưởng, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn và phòng bệnh cho vật nuôi Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra nhiều tác hại của việc bổ sung kháng sinh trong chăn nuôi tới sức khỏe con người như: Tồn dư kháng sinh trong thịt gây hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn, gây dị ứng và gây ra ung thư cho người tiêu dùng Vì vậy, từ ngày 1/1/2006 Liên minh Châu Âu EU đã cấm hoàn toàn việc

bổ sung kháng sinh vào trong thức ăn chăn nuôi như những chất kích thích sinh trưởng Tại Việt Nam, kết quả điều tra về tình hình sử dụng kháng sinh trong thức ăn trong chăn nuôi và tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi cho thấy : Ở các mẫu thức ăn hỗn hợp cho lợn, gà cho thấy có 100 % số mẫu có

sử dụng Oxytetracyclin, 67% có Chloramphenicol, 37% có Olaquindox, 77%

có Dexamethasol Có 52,17% số mẫu thịt lợn, gà có tồn dư kháng sinh cao gấp hàng chục tới hàng ngàn lần so với tiêu chuẩn quốc tế[5] Ở nước ta từ năm 2002 Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn cũng đã có quyết định cấm

sử dụng một số kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi như: Chloramphenycol, dimetridazole, metronidazole,… Trong thời gian tới có thể thêm nhiều loại kháng sinh bị cấm và tiến tới cấm hoàn toàn các loại kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

Đã có một số nghiên cứu ban đầu về thảo dược có tính kháng khuẩn để thay thế kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho thấy các loại kháng sinh thảo dược có khả năng kích thích tăng trọng, tăng hiệu quả sử dụng thức

ăn, kích thích hệ thống miễn dịch qua đó làm giảm tỷ lệ vật nuôi mắc bệnh [19] Các hợp chất thiên nhiên trong thảo dược có khả năng tạo ra các sản phẩm thịt có chứa chất chống oxy hóa bền vững và làm tăng thời gian bảo quản thịt mà không cần sử dụng thêm kháng sinh tổng hợp [63] Vì vậy, sử

2

dụng thảo dược trong khẩu phần ăn của vật nuôi sẽ tạo ra các sản phẩm thịt an toàn, có lợi cho sức khỏe của người tiêu dùng, qua đó nâng cao giá trị của sản phẩm chăn nuôi Tuy vậy, khả năng kháng khuẩn của thảo dược phụ thuộc vào thành phần và hàm lượng của các hợp chất thiên nhiên có tính kháng khuẩn như alkaloids, carbohydrates, glycosides, flavonoids, saponin, tannin, terpenoit [33, 42] Hàm lượng các chất kháng khuẩn thường không ổn định và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bộ phận thảo dược được thu hái, phương pháp chế biến và bảo quản, dung môi chiết [13] Hơn nữa, để có thể sử dụng thảo dược bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cần có phương pháp chế biến phù hợp đảm bảo dễ sử dụng, giá thành rẻ và còn giữ được hoạt tính kháng khuẩn

Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn invitro của nhiều loại thảo dược khác nhau Các nghiên cứu ứng dụng chỉ dừng lại ở việc

sử dụng thử nhiệm các dịch chiết của các thảo dược mà chưa quan tâm đến sản xuất các chế phẩm có thể sử dụng bổ sung thay thế kháng sinh tổng hợp trong thức ăn chăn nuôi công nghiệp Các nghiên cứu về sử dụng nguồn dược liệu trên địa bàn tỉnh Phú Thọ cũng chưa quan tâm đến vấn đề này

Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm sử dụng nguồn dược liệu sẵn có giúp chủ động nguồn kháng sinh, tiết kiệm chi phí sản xuất trong chăn nuôi, nâng cao giá trị cây thuốc hiện có và

nâng cao hiệu quả sản xuất nông lâm nghiệp

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Xác định được các loài thảo dược phổ biến ở tỉnh Phú Thọ có khả năng kháng khuẩn bổ sung vào thức ăn cho lợn

- Lựa chọn một số loài thảo dược và phương pháp chế biến phù hợp với từng loại thảo dược tạo sản phẩm để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn

3

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về tài nguyên cây thuốc trên thế giới và Việt Nam

2.1.1 Tiềm năng về tài nguyên cây thuốc trên thế giới

Trong tất cả các nền văn hóa của nhân loại từ thời thượng cổ đến nay, con người vẫn luôn coi trọng cây cỏ như là một nguồn thuốc chủ yếu để chữa bệnh và bảo vệ sức khỏe,…

Theo thống kê của WHO, đến năm 1985 trên thế giới có khoảng 20.000 loài thực vật (bao gồm cả bậc cao và bậc thấp) trong số các loài đã biết, được

sử dụng trực tiếp làm thuốc hoặc là nguyên liệu để cung cấp các hoạt chất tự nhiên dùng làm thuốc Hiện nay, số loài cây thuốc được sử dụng trên thế giới ước tính từ 30.000 đến 70.000 loài Các vùng nhiệt đới trên thế giới, bao gồm lưu vực sông Amazon của châu Mỹ, Đông Nam Á, Ấn Độ, Tây Phi,… là kho tàng chứa đựng số lượng loài cây cỏ khổng lồ, cũng như giàu có về tri thức sử dụng Ở vùng nhiệt đới châu Á có khoảng 6.500 loài thực vật có hoa được dùng làm thuốc, riêng ở Ấn Độ có 6.000 loài, ở Trung Quốc là 5.136 loài [2]

Nghiên cứu tác dụng chữa bệnh của từng loài cây thuốc và bản chất hoá học của dược liệu được quan tâm trên quy mô rộng lớn Nhiều nghiên cứu đã khẳng định các cây cỏ không chỉ có tính kháng sinh mà còn là một trong những yếu tố miễn dịch tự nhiên Tác dụng kháng khuẩn của thảo dược là do các hợp

chất như: Sulfur, saponin (Allium odium); becberin (Coptis chinensis Franch.); tanin (Zizyphusjụuba Miller); Mỗi loài cây với từng công năng tác dụng, ở mỗi

địa phương lại được sử dụng theo bản sắc dân tộc riêng [17]

Nhận thức rõ giá trị chữa bệnh của các cây thuốc chính là các hợp chất

tự nhiên có hoạt tính sinh học chứa trong nguyên liệu Vì vậy, nghiên cứu cây thuốc theo các nhóm hợp chất được tiến hành và đã thu được nhiều kết quả khả quan Tuy nhiên, hướng nghiên cứu này đòi hỏi kinh phí lớn, trang thiết

bị hiện đại và đội ngũ chuyên gia có trình độ cao Do vậy, đây là các nghiên

4

cứu được triển khai ở các nước phát triển và một số các nước đang phát triển Các cây thuốc chứa các nhóm hoạt chất: Alkaloid, flavonoid, coumarin,… hiện đang được quan tâm nhiều

Như vậy, những công trình nghiên cứu về dược liệu đã có từ lâu đời, hình thành và phát triển cùng với tiến trình lịch sử của nhân loại Tuy nhiên, do

sự hạn chế của trình độ khoa học đương thời nên những công trình này chỉ dừng lại ở mức độ mô tả, thống kê và chỉ ra công dụng của chúng, chưa có cơ

sở khoa học để chứng minh thành phần hoá học của chúng có tồn tại trong đó

và tham gia vào việc chữa bệnh như thế nào Chỉ đến khi khoa học - kỹ thuật phát triển thì vấn đề này mới được làm sáng tỏ, tạo độ tin cậy đối với người bệnh khi sử dụng

2.1.2 Tiềm năng về tài nguyên cây thuốc ở Việt Nam

Việt Nam nằm dọc trên bán đảo Đông Dương, kéo dài theo hướng Bắc Nam với hơn 1.600km trên đất liền, từ 8o30’ vĩ độ Bắc ở mũi Cà Mau - tỉnh

Cà Mau đến hang Lũng Cú - tỉnh Hà Giang Tổng diện tích phần đất liền là 325.360km2 Sự chia cắt mạnh và phức tạp của bề mặt địa hình là nhân tố quan trọng tạo nên sự đa dạng cao trong bản đồ sinh khí hậu ở Việt Nam Nằm ở khu vực Đông Nam Á, Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm Trong

đó, tính nhiệt đới gió mùa điển hình thấy rõ ở các vùng núi thấp phía Nam và chuyển dần sang khí hậu nhiệt đới gió mùa vùng núi hay gần như á nhiệt đới ở các vùng núi cao phía Bắc [4]

Tất cả những nhân tố về địa lý, địa hình và khí hậu kể trên,… đã góp phần tạo nên ở Việt Nam có nguồn tài nguyên động - thực vật phong phú, đa dạng Theo ước tính có cơ sở của các nhà khoa học, về thực vật bậc cao có mạch có tới 12.000 loài Bên cạnh đó còn 800 loài Rêu, 600 loài Nấm và hơn 2.000 loài Tảo Trong đó, có rất nhiều loài đã và đang có triển vọng được sử dụng làm thuốc [6]

5

Viện Dược liệu cùng với hệ thống trạm nghiên cứu dược liệu, điều tra ở 2.795 xã, phường, thuộc 351 Huyện, thị xã của 47 tỉnh, thành phố trong cả nước, đã có những đóng góp đáng kể trong các điều tra sưu tầm nguồn tài nguyên cây thuốc và kinh nghiệm sử dụng cây thuốc trong Y học cổ truyền dân

gian Kết quả được đúc kết trong “Danh lục cây thuốc miền Bắc Việt Nam”,

“Danh lục cây thuốc Việt Nam”, tập “Atlas (bản đồ) cây thuốc” Quá trình

điều tra đã xác định ở Việt Nam hiện có 3.948 loài cây thuốc, thuộc 307 họ,

của 9 ngành và nhóm thực vật bậc cao cũng như bậc thấp kể cả nấm và tảo [7]

2.2 Tổng quan về khả năng kháng khuẩn của thảo dược

2.2.1 Cơ chế kháng khuẩn của các hợp chất thiên nhiên

Đặc tính kháng khuẩn của chất chiết thực vật và tinh dầu được mô tả bởi nhiều tác giả trong quá khứ nhưng đến nay mới xác định được thành phần hoạt chất chính, các hoạt chất sinh học cơ bản và mối liên quan giữa hàm lượng các chất, cấu trúc hóa học, chức năng và cơ chế tác động của các nhóm chất có trong chất chiết thực vật và tinh dầu [72]

Cấu trúc của màng tế bào vi khuẩn được cho là mục tiêu của các hợp chất thiên nhiên Nguyên lý hoạt động của các hợp chất thiên nhiên liên quan tới sự phá hủy màng tế bào chất, làm mất ổn định của kênh vận chuyển proton (Proton motive force PMF), dòng chảy electron, hoạt động vận chuyển và đông tụ của tế bào chất Không phải tất cả các loại thảo dược đều hoạt động theo một nguyên lý chung cho các mục tiêu cụ thể, một số trường hợp chịu ảnh hưởng của các nguyên lý khác [57]

Một đặc tính có vai trò quan trọng tới khả năng kháng khuẩn của một

số tinh dầu đó là việc chứa các hợp chất hydrophobic cho phép tham gia cấu trúc lipid từ màng tế bào, làm nhiễu động màng tế bào và làm cho chúng dễ bị thấm qua hơn

Thành phần hóa học từ tinh dầu cũng tác động vào protein màng tế bào Hydrocarbon tuần hoàn tác động vào ATPases, một enzyme trên màng tế bào

6

chất và được bao quanh bởi phân tử lipit Hơn nữa, hydrocarbon lipid có thể làm méo mó mối liên kết lipid – protein và cũng có thể hướng mối liên kết của lipophilic với một phần hydrophobic của protein Một số loại tinh dầu kích thích sự phát triển của pseudo – mycelia Các loại tinh dầu này ảnh hưởng tới enzyme liên quan tới sinh tổng hợp các hợp chất cấu trúc nên vi khuẩn [57]

Nhóm hydroxyl (-OH) hiện diện trong thành phần phenolic đóng vai trò quan trọng liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn [64] và bất cứ sự thay đổi vị trí nào của chúng ở bên trong phân tử sẽ tạo ra sự khác biệt rõ rệt trong hiệu lực kháng khuẩn [72] Tinh dầu là những thành phần thu được từ phương pháp chưng cất bằng hơi nước, do đặc tính kỵ nước nên chúng không hòa tan trong nước mà hòa tan trong dung môi hữu cơ Tinh dầu bao gồm một số lượng lớn những thành phần riêng biệt, những thành phần này có thể đạt đến 80 – 85% sản phẩm sau chưng cất Trong khi đó, thành phần thiết yếu có thể chỉ hiện diện ở một số lượng rất nhỏ, đây chính là phần liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu [27]

Tuy thành phần trong tinh dầu thì không thay đổi nhưng hàm lượng của

nó có thể thay đổi do điều kiện địa lý hoặc mùa vụ thu hoạch, tinh dầu được thu hoạch vào mùa hè sau khi ra hoa sẽ có khả năng kháng khuẩn cao hơn khi thu hoạch vào mùa vụ khác trong năm Thành phần của tinh dầu còn ảnh hưởng đến những thành phần khác của thực vật khi đưa vào chiết [13]

Nhiều tác giả cho rằng, tinh dầu có hoạt chất kháng khuẩn thông qua 2

7

Từ cơ chế phá vỡ màng tế bào vi khuẩn đã làm thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào gây ra sự mất ion từ bên trong tế bào ra môi trường bên ngoài Việc mất ion thường dẫn đến việc mất các thành phần khác của tế bào chất, từ đó làm mất khả năng chống đỡ và cuối cùng là tế bào bị phá hủy Nhóm hydroxyl hiện diện trong thành phần của nhóm phenolic (thymol và carvacrol) tạo ra hoạt lực kháng khuẩn mạnh nhất [72] Ngoài ra tinh dầu còn

có tác động lên liên kết protein trong màng tế bào chất Điều này được giải thích qua cơ chế tác động của phenol lên protein Đầu tiên những hydrocarbon

có thể tích lũy bên trong màng phospholipid và cản trở sự kết hợp lipid với protein ; trên khía cạnh khác carbohydrate hòa tan trong chất béo có thể tác động trực tiếp với phần kỵ nước của protein [13] Những tác giả khác cũng cho rằng, hoạt tính của tinh dầu là làm cản trở enzyme của tế bào hoạt động Tinh dầu đóng vai trò kiểm soát năng lượng hoặc quá trình tổng hợp cấu trúc của tế bào vi khuẩn [27]

Silva đã mô tả một vài hợp chất và cơ chế kháng khuẩn của chúng như sau [57]:

Carvacrol và Thymol: Thymol có cấu trúc hóa học đơn giản hơn carvacrol Tuy nhiên, chúng khác nhau bởi vị trí nhóm hydroxyl trên vòng phenolic Cả hai hợp chất này đều làm cho màng tế bào dễ bị thấm qua Cấu trúc hóa học của chúng làm tan rã màng ngoại bào của vi khuẩn gram (-), giải phóng lipopolysaccharides (LPS) và tăng khả năng thấm của màng tế bào chất

và ATP Sự có mặt của magie chloride không ảnh hưởng tới hoạt động này Eugenol: nồng độ eugenol khác nhau ngăn cản sản sinh men amylase

và protease ở B.cereus Hơn nữa, cũng ghi nhận hiện tượng phân hủy và tiêu

biến tế bào

p-Cymece là tiền chất của carvacrol, hợp chất hydrophobic này kích thích mạnh hơn tới màng tế chất so với carvacrol

Cinnamaldehyde được biết đến như là chất kháng E.coli và

S.typhimurium ở nồng độ thấp hơn cả carvanol và thymol Tuy nhiên, hợp

chất này không hòa tan màng tế bào cũng như làm suy yếu ATP dịch nội bào Nhóm carbonyl có ái lực với protein, ngăn cản hoạt động của men decarboxyl

amino acid trong vi khuẩn E.aerogenes

2.2.2 Các hợp chất thiên nhiên có tính kháng khuẩn có trong thảo dược

Đến ngày nay, nhiều loại hợp chất thiên nhiên có hoạt tính kháng vi sinh vật đã được phân lập và được sử dụng làm thuốc hoặc chuyển hóa thành các dẫn xuất khác có hoạt tính cao hơn Các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính kháng vi sinh vật điển hình là alkaloid, acetylene, coumarin, flavonoid và isoflavonoid, terpenoid, [64] Tùy theo cấu trúc hóa học mà các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính khác nhau Thông thường, các hợp chất thiên nhiên được coi là có hoạt tính kháng vi sinh vật một cách hiệu quả khi nồng độ kiềm khuẩn tối thiểu từ 0,02 – 10 µg/mL [51]

2.2.2.1 Các hợp chất alkaloid

Hợp chất alkaloid đầu tiên được phân lập từ cây anh túc (Papver

somniferum) và được sử dụng làm thuốc giảm đau, ức chế thần kinh trung

ương là morphine (2) Đến nay nhiều hợp chất alkaloid khác đã được phân lập

và có nhiều hoạt tính kháng vi sinh vật khác nhau Điển hình là canthin-6-one

(3) được biết đến các loài Allium neapolitanum, Zanthoxylum chiloperone có khả năng kháng nhiều chủng vi sinh vật như Aspergillus niger, Candida

albicans với giá trị MIC từ 1,66 đến 10,12 mg/mL Hợp chất canthin-6-one

(3) và 8-hydroxycanthin-6-one (4) từ loài Allium neapolitanum có khả năng

9

kháng vi sinh vật kiểm định Staphylococcus aureus 1199B và S aureus

XU212 với giá trị MIC 8,0 mg/mL [51]

hoạt tính kháng khuẩn đối với vi nấm Candida albicans và Aspergillus

fumigates [51]

2.2.2.3 Coumarin

10

(10)

Coumarin là nhóm các hợp chất điển hình có trong các loài thuộc họ Rutaceae Đây không phải là nhóm các hợp chất kháng khuẩn điển hình, tuy nhiên hợp chất amino-coumarin, 7-amino-4-methylcoumarin (10) được phân

lập từ loài Ginkgo biloba có khả năng kháng vi khuẩn và vi nấm in vitro đối với chủng Staphylococcus aureus, Escherichia coli (với giá trị MIC 10 µg/mL), kháng chủng Salmonella typhimurium (MIC 15 µg/mL), Salmonella

enteritidis (MIC 8,5 µg/mL), Aeromonas hydrophila (MIC 4 µg/mL), và vi

nấm Candida albicans (MIC 15 µg/mL) [51]

2.2.2.4 Flavonoid và isoflavonoid

Flavonoid là một trong nhóm các hợp chất thiên nhiên thứ cấp phổ biến nhất và được tìm thấy trong nhiều loài thực vật khác nhau có tác dụng ngăn cản tia UV và thể hiện hoạt tính chống oxi hóa rất tốt Bên cạnh đó, nhiều hợp chất flavonoid còn có hoạt tính kháng khuẩn Apigenin (11) từ loài

Scutellaria barbata (Lamiaceae), có khả năng chống lại 20 loài MRSA Hợp

chất dimer hóa của (11), amentoflavone (12) từ loài Selaginella tamariscina

có hoạt tính kháng khuẩn tốt đối với các chủng vi nấm C albicans, S

cerevisiae và T beigelii với giá trị MIC 5 µg/mL Một hợp chất khác là

11

kaempferol (13) được phân lập từ dịch chiết methanol của loài Vismia

laurentii, có khả năng ức chế hai chủng vi khuẩn Gram (-) và bốn chủng vi

khuẩn Gram (+) với giá trị MIC 2,4 µg/mLvà còn có hoạt tính kháng nấm Candida glabrata với giá trị MIC 4,8–9,7 µg/mL [51]

2.2.2.5 Terpenoid

Terpenoid là nhóm các hợp chất thiên nhiên thứ cấp được cấu tạo bởi các đơn vị isoprene Các hợp chất mono-, diterpenoid thường có trong các loại tinh dầu và có nhiều hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

  (16) (17) Hợp chất sesquiterpene xanthorrhizol (14), được phân lập từ dịch chiết

ethanol của loài Curcuma xanthorrhiza, có khả năng kháng khuẩn Bacillus

cereus, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, và Vibrio parahaemolyticus với giá trị MIC

8,0–16,0 µg/mL Cinnamodial (15), là một diterpenoid được phân lập từ lá

và vỏ của loài Pleodendron costaricense, có hoạt tính mạnh đối với chủng

Alternaria alternata (MIC 3,9 µg/mL) Từ loài Plectranthus saccatus đã phân

lập được Coleon U (16) có hoạt tính đối với chủng B subtilis và

Pseudomonas syringae với giá trị MIC tương  ứng 3,13; 6.25 µg/mL và

coleon U quinone (17) có hoạt tính cao đối với chủng P syringae với giá trị

MIC 3,13 µg/mL [51]

12

2.3 Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của thảo dược

2.3.1 Phương pháp tách chiết các hợp chất thiên nhiên trong thảo dược

Tất cả cơ thể sống cần chuyển đổi và chuyển hóa qua lại một số lượng lớn các hợp chất hữu cơ để sống, phát triển và sinh sản Nhóm các hợp chất carbohydrate, protein, chất béo và acid nucleic cần thiết cho sự sống của tất cả

các sinh vật gọi là hợp chất trao đổi sơ cấp (primary metabolite) Nhóm các

hợp chất hữu cơ có phân tử khối nhỏ hơn (M < 2000 u) có trong các loài riêng biệt, thường có hoạt tính sinh học, đặc trưng về sinh thái học và không cần thiết cho sự sống, sự phát triển của sinh vật gọi là hợp chất trao đổi thứ cấp

(secondary metabolite) [48, 61]

Các hợp chất thứ cấp với nhiều loại nhóm chức khác nhau và có độ phân cực khác nhau Thường gặp trong thực vật là sáp, acid béo, polyacetylene, terpenoid, steroid, các loại tinh dầu, hợp chất phenol, alkaloid và các dẫn xuất glycosid [54] Nhiều hợp chất thứ cấp từ thực vật có hoạt tính sinh học quý giá như hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào, chống khối u, chống oxi hóa, làm chất dẫn dụ giới tính, đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu Tuy nhiên nhóm các hợp chất này với đặc điểm phân tử khối nhỏ, tính chất hóa học đa dạng, khác biệt nên cần có các phương pháp khác nhau để chiết tách chúng trong các điều kiện nhiệt độ, dung môi phù hợp

2.3.1.1 Xử lý mẫu thực vật sau khi thu hái

Việc thu hái mẫu thực vật cần căn cứ theo mục đích nghiên cứu và đặc điểm thực vật của cây trên cơ sở các tài liệu tham khảo đã công bố nếu có về

họ, chi hoặc loài nghiên cứu để lựa chọn các bộ phận của cây như lá, vỏ, thân cây, quả, hạt, rễ, … Thông thường thực vật được thu hái phải có độ tuổi nhất định, đủ độ già để có hàm lượng chất cao nhất trong các bộ phận của cây Mẫu thực vật sau khi thu hái được rửa sạch nếu cần và thường được làm khô bằng cách sấy ở nhiệt độ không quá 60oC nhằm diệt các nấm, men có

13

trong cây [12] Việc sấy khô mẫu thực vật cũng cần phải đảm bảo không làm biến đổi các thành phần hóa học trong cây; tránh sấy ở nhiệt độ quá cao có thể dẫn đến làm thăng hoa một số loại chất hoặc biến đổi một số hợp chất trong cây thành các hợp chất khác Tránh phơi khô mẫu thực vật dưới ánh sáng mặt trời vì tia tử ngoại có thể kích thích một số phản ứng hóa học dẫn đến làm thay đổi thành phần hóa học của cây Trong một số trường hợp mẫu cây được làm khô bằng cách đưa vào các phòng hút ẩm trong thời gian khoảng 1 tuần ở điều kiện nhiệt độ phòng Mẫu cây sau khi làm khô được nghiền nhỏ thành bột rồi ngâm chiết với dung môi thích hợp hoặc bảo quản trong túi nilon kín ở điều kiện nhiệt độ thấp Việc nghiền nhỏ mẫu thực vật làm phá vỡ màng tế bào thực vật (cellulose) giúp cho dung môi dễ thấm vào bột cây từ đó có thể chiết tách tối đa các hợp chất thứ cấp trong cây

Trong một số trường hợp cần khảo sát mẫu cây tươi hoặc khi hàm lượng nước trong cây rất lớn, khó có thể làm khô mẫu cây thì mẫu cây tươi được nghiền nhỏ rồi ngâm chiết với dung môi MeOH, EtOH, … hoặc cũng có thể đưa luôn dung môi ngâm chiết vào hỗn hợp mẫu cây khi say nghiền nhỏ mẫu Khi cần thu lấy tinh dầu từ mẫu thực vật nên tiến hành với mẫu cây tươi

vì tinh dầu dễ bay hơi khi tiến hành sấy mẫu ở nhiệt độ cao

2.3.1.2 Lựa chọn dung môi thích hợp để chiết tách

Phương pháp truyền thống chủ yếu dựa vào việc sử dụng nước nóng/lạnh, cồn và hỗn hợp cồn-nước để chiết tách mẫu thực vật Dung môi có thể được đun sôi rồi đổ vào nguyên liệu hoặc đun trực tiếp nguyên liệu với dung môi (giống như sắc thuốc) Dung môi được lựa chọn để chiết tách phải đảm bảo yêu cầu có độ độc thấp, khả năng cháy nổ thấp, giá thành không quá cao và đặc biệt phải thu hồi lại được bằng quá trình chưng cất

Quá trình chiết tách có thể một phần hoặc toàn bộ Việc lựa chọn dung môi thường được quan tâm tới khả năng có khả năng chọn lọc đối với chất

14

cần chiết tách Trong quá trình chiết tách chọn lọc, dung môi được lựa chọn với độ phân cực thích hợp theo nguyên tắc “chất giống nhau dễ tan vào nhau” Theo nguyên tắc này, các dung môi kém phân cực được sử dụng để chiết tách hầu hết các hợp chất ưa dầu như alkane, acid béo, chất màu, sáp, sterol, và một số terpenoid, alkaloid, coumarin Các dung môi có độ phân cực trung bình được sử dụng để chiết tách nhóm chất có độ phân cực trung gian như một số alkaloid, flavonoid; các dung môi có độ phân cực cao hơn được sử dụng để chiết tách các hợp chất có tính phân cực cao như các flavonoid glycoside, tannin, và một số alkaloid Nước thường ít được sử dụng ban đầu

để chiết tách các hợp chất tan được trong nước như tannin, glycoside, alkaloid bậc 4, … do nước khó chưng cất để làm khô cặn chiết Trong quá trình chiết tách từng phần cũng có thể sử dụng lần lượt các dung môi với độ phân cực

tăng dần như chiết ban đầu với n-hexane, rồi tiếp với dichlomethane,

methanol, …[54]

Trong quá trình chiết tổng, dung môi hữu cơ phân cực như methanol, ethanol hoặc hỗn hợp alcohol-nước được sử dụng để chiết tách phần lớn các hợp chất thiên nhiên Điều này dựa trên khả năng dung môi alcohol làm tăng tính thấm của màng tế bào từ đó cho phép chiết tách phần lớn các hợp chất có

độ phân cực từ cao đến thấp [54]

Bên cạnh việc sử dụng các dung môi có độ phân cực khác nhau, một số nhóm chất như alkaloid có thể được phân tách ra khỏi nhóm hợp chất không phải alkaloid bằng cách dùng dung dịch acid HCl để chuyển hóa alkaloid thành muối amoni hòa tan trong nước rồi kiềm hóa phần dung dịch nước để thu lại các hợp chất alkaloid

2.3.1.3 Các phương pháp chiết tách hợp chất thiên nhiên từ thực vật

* Phương pháp chiết rắn – lỏng

15

Đây là phương pháp phổ biến được sử dụng để chiết tách hợp chất thiên nhiên từ thực vật, gồm có chiết ngâm dầm, chiết ngấm kiệt, chiết bằng máy Soxhlet, …

* Phương pháp chiết ngâm dầm

Đây là phương pháp phổ biến nhất trong việc chiết tách hợp chất thiên nhiên Mẫu thực vật được nghiền nhỏ rồi đưa vào bình thủy tinh hoặc bình thép không gỉ Tránh dùng bình nhựa vì dung môi ngâm chiết có thể hòa tan một số thành phần trong nhựa lẫn vào dịch chiết Dung môi được đưa vào bình ngâm chiết sao cho toàn bộ mẫu thực vật chìm trong dung môi Để yên trong thời gian khoảng 24 h hoặc kết hợp với đưa bình ngâm chiết vào hệ thống siêu âm Sau đó cho hỗn hợp ngâm chiết qua phễu lọc có giấy lọc hoặc vải, lọc lấy phần dung dịch Mẫu thực vật lại tiếp tục được ngâm chiết với dung môi Quá trình ngâm chiết này thường được thực hiện khoảng 4-5 lần Chưng cất dịch chiết dưới áp suất giảm thu được các cặn dịch chiết tương ứng Dung môi ngâm chiết được thu hồi để thực hiện quá trình ngâm chiết tiếp theo

Phương pháp chiết ngấm kiệt

Trong phương pháp này, mẫu thực vật đã nghiền nhỏ được đưa vào bình thủy tinh hình trụ đứng (bình ngấm kiệt) có khóa van để điều chỉnh tốc độ dung dịch chảy ra Phía dưới bình ngấm kiệt là bình hứng dung dịch chiết và phía trên bình ngấm kiệt là bình dựng dung môi ngâm chiết

Dung môi ngâm chiết được đưa từ từ vào bình ngấm kiệt sao cho mẫu thực vật được ngấm đều dung môi (nóng hoặc nguội) Để yên một thời gian khoảng 24h Sau đó mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra, đồng thời mở khóa van bình đựng dung môi ngâm chiết sao cho tốc độ dung dịch chảy ra bằng tốc độ dung môi ngâm chiết đưa vào Ưu điểm của phương pháp này là ít tốn công hơn, là quá trình chiết liên tục nên hiệu quả chiết cao

16

* Phương pháp chiết bằng máy Soxhlet

Phương pháp chiết này được thực hiện bằng máy Soxhlet gồm có 3 bộ phận chính là bình cầu chứa dung môi chiết, hệ thống chứa mẫu thực vật phía trên bình cầu có đường dẫn hơi dung môi từ bình cầu lên và đưa dung dịch chiết xuống bình cầu, phía trên cùng là hệ thống sinh hàn làm lạnh tránh dung môi thoát ra bên ngoài Khi đun nóng bình cầu, dung môi bay hơi lên bình ngưng chứa mẫu chất, hòa tan chất cần chiết rồi chuyển xuống bình cầu Hơi dung môi từ bình cầu lại bay lên tiếp tục quá trình chiết tách Khi quá trình chiết tách hoàn thành, cô cạn dung dịch ở bình cầu thu được cặn chiết tương ứng [12]

Ưu điểm của phương pháp này là tốn rất ít dung môi cần ngâm chiết Không tốn công ngâm chiết và lọc dung dịch chiết như phương pháp ngâm dầm và ngấm kiệt Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là mẫu thực vật thực hiện mỗi lần chiết tách là nhỏ Trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ thực vật lưu trữ lại trong bình cầu, khi đun nóng có thể bị phân hủy bởi nhiệt

* Phương pháp chiết bằng lôi cuốn hơi nước

Phương pháp này được sử dụng để chiết các hợp chất dễ bay hơi như tinh dầu Trong phương pháp này, mẫu thực vật thường ở dạng tươi, được nghiền nhỏ rồi cho vào bình cầu có đun nóng và có đường dẫn ống hơi nước sục vào bình Đun nóng đồng thời bình cầu chứa mẫu thực vật và nồi cung cấp hơi nước Các hợp chất tinh dầu sẽ bị cuốn theo hơi nước qua ống dẫn hơi ngưng tụ ở bên ngoài (ống gạn) Tinh dầu thường kém tan trong nước, tạo phân lớp có thể tách riêng ra khỏi lớp nước được bằng cách chiết Thường thêm diethyl ether để chiết hết cả phần nhỏ tinh dầu tan trong lớp nước Làm khan dịch chiết ether rồi chưng cất đuổi ether thu được tinh dầu

17

* Phương pháp chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn

Đây là phương pháp chiết hiện đại, sử dụng một số chất có khả năng ở trạng thái siêu tới hạn khi hợp chất đó có nhiệt độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn mà ở đó chất tồn tại ở trạng thái khí và lỏng với nồng độ như nhau Chất lỏng siêu tới hạn thường được sử dụng là CO2 do chất này có áp suất và nhiệt độ tới hạn thấp (304,1 K; 73,8 bar), giá tiền rẻ, không độc hại và thân thiện với môi trường Khi chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn CO2, giảm áp suất thì dung môi bay hơi và thu được cặn chiết tương đối sạch Cách này cho phép chiết các hợp chất nhạy cảm với nhiệt độ như hoa bia Hợp chất taxol là

một diterpene phức tạp từ loài thông đỏ (Taxus brevifolia) được sử dụng làm

thuốc chữa trị nhiều loại bệnh ung thư như ung thư vú, ung thử cổ tử cung cũng đã được chiết tách bằng chất lỏng siêu tới hạn CO2 (thu được khoảng 25% từ vỏ cây thông đỏ) và cho phép thu tới 50% khi sử dụng chất lỏng siêu tới hạn CO2 có thêm ethanol [54]

Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là cần thiết bị tạo chất lỏng siêu tới hạn hiện đại, đắt tiền, chi phí cao

Phương pháp chiết lỏng – lỏng

Phương pháp này thường được sử dụng để phân bố cặn chiết với các dung môi có độ phân cực khác nhau Thường cặn chiết methanol của mẫu thực vật ở dạng sền sệt được hòa tan vào một lượng lớn nước rồi sử dụng các

dung môi không hòa tan trong nước có độ phân cực tăng dần như n-hexane,

dichlomethane, ethyl acetate, … để phân tách cặn chiết tổng ban đầu thành các phân đoạn có chứa các lớp chất có độ phân cực khác nhau

Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là phải lắc hỗn hợp chiết nhiều lần nên có hiện tượng tạo nhũ tương, khó phân tách thành hai lớp riêng biệt

18

2.3.2 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch chiết thảo dược

2.3.2.1 Phương pháp khuếch tán trên thạch

* Phương pháp sử dụng khoanh giấy

Việc sử dụng khoanh giấy kháng sinh trên bề mặt đĩa thạch để đánh giá khả năng kháng khuẩn được sử dụng từ những năm 40 của thế kỷ trước và đã được cải tiến nhiều Hiện nay kỹ thuật này vẫn được sử dụng nhiều để đánh giá khả năng kháng khuẩn của dịch chiết thảo dược Phương pháp này bao gồm các bước: đĩa thạch được cấy vi khuẩn sau đó đặt khoanh giấy thấm dịch chiết lên bề mặt đĩa thạch Lượng vi khuẩn được cấy ở nồng độ 106 CFU/ml (CFU: Colony Forming Unit, hay đơn vị khuẩn lạc) Đường kính khoanh giấy thấm khoảng 6 mm được thấm dịch chiết trước hoặc sau khi đặt lên môi trường thạch Muller Hinton Sau đó đĩa thạch được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ

và thời gian thích hợp ( từ 25 đến 37 độ C và từ 18 đến 48 giờ) Đánh giá khả năng kháng khuẩn qua đường kính vô khuẩn xung quanh khoanh giấy Đường kính vô khuẩn được đo trên vùng xung quanh khoanh giấy nơi lượng vi khuẩn mọc giảm 80% so với khu vực xa khoanh giấy và có thể phân biệt được bằng mắt thường [69]

* Phương pháp đục lỗ thạch

Phương pháp này cơ bản giống với phương pháp sử dụng khoanh giấy Điểm khác duy nhất là thay bằng dùng khoanh giấy thấm dịch chiết, người ta đục một lỗ trên đĩa thạch đường kính khoảng 6-8 mm để cho dịch chiết vào, mỗi lỗ có thể chứa từ 0,05 đến 0,1 ml dịch chiết

2.3.2.2 Phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng

Đây là phương pháp quan trọng, cho phép đánh giá định lượng nồng độ

ức chế tối thiểu (MIC) của kháng sinh hay dịch chiết đối với vi khuẩn Trong phương pháp này, kháng sinh hoặc dịch chiết được pha loãng theo cơ số 2

19

bằng môi trường nuôi cấy vi khuẩn Vi khuẩn giống được pha sẵn ở nồng độ

106 CFU/ml và được cho một lượng đồng đều vào môi trường nuôi cấy có kháng sinh hay dịch chiết ở các nồng độ khác nhau Phương pháp này có thể thực hiện trên phiến có nhiều giếng nuôi cấy hoặc trên ống nghiệm Với phương pháp sử dụng phiến nuôi cấy dung tích 0,2 ml/giếng thường kết hợp với máy đọc độ cản quang và dùng thuốc thử như INT (một dạng muối của tetrazolium) để đọc kết quả Còn phương pháp sử dụng ống nghiệm thì có thể kiểm tra độ đục của môi trường nuôi cấy và đọc kết quả bằng mắt thường, tuy nhiên phương pháp này cần nhiều môi trường nuôi cấy hơn Ở nồng độ kháng sinh hay dịch chiết thấp nhất nào bắt đầu có sự suy giảm mạnh sự mọc của vi khuẩn thì được xác định là nồng độc ức chế tối thiểu [69]

2.3.2.3 Phương pháp pha loãng trong môi trường thạch

Phương pháp pha loãng trong môi trường thạch được tiến hành trên đĩa thạch với nồng độ dịch chiết khác nhau Để chuẩn bị các đĩa thạch này, thạch chứa môi trường nuôi cấy được làm tan chảy và hấp khử trùng, hạ nhiệt độ xuống và giữ trong nước nóng 50 độ C Dịch chiết được bổ sung vào môi trường thạch ở các nồng độ khác nhau bằng cách sử dụng chính môi trường thạch còn tan chảy để pha loãng theo cơ số 2 sau đó đổ ra đĩa Các đĩa thạch nuôi cấy chứa dịch chiết ở nồng độ khác nhau được để đông cứng và khô bề mặt sau đó cấy vi khuẩn trải đều trên bề mặt thạch MIC được xác định ở nồng độ dịch chiết thấp nhất trong môi trường thạch mà ở đó ức chế hoàn toàn sự hình thành khuẩn lạc hoặc có số khuẩn lạc rất ít hơn 4 trên một đĩa thạch đường kính 90 mm [11]

2.4 Tổng quan vể khả năng kháng khuẩn của một số loại thảo dược trong nghiên cứu

2.4.1 Khả năng kháng khuẩn của tỏi

20

Tỏi có tên khoa học là Allium sativum L Theo Đỗ Tất Lợi (2006),

thành phần hóa học chủ yếu của tỏi là chất kháng sinh có lên là alixin (C6H10OS2) có tác dụng diệt khuẩn mạnh đối với vi khuẩn Staphyllococcus, thương hàn, phó thương hàn, lỵ, tả, trực khuẩn sinh bệnh bạch hầu và vi khuẩn gây thối Trong tỏi không có chất alixin ngay mà có axit amin allin Khi chịu các tác động vật lý như thái, băm, nghiền thì aliin bị men alinaza

phân giải mới tạ ra alixin trong tỏi

Alixin tinh khiết là một chất dầu không màu, hòa tan trong cồn, benzene, ete, dịch nước không ổn định dễ bị thủy phân, có mùi như tỏi, kích ứng da nhưng không có mùi hôi như tỏi Chất alixin nhanh chóng bị nhiệt làm mất tác dụng, gặp kiềm bị mất tác dụng, axit nhẹ ít bị ảnh hưởng

Alixin dễ mất oxy và do đó mất tác dụng kháng sinh, vì vậy người ta cho rằng tác dụng kháng sinh của alixin là do nguyên tử oxy trong phân tử Alixin cũng dễ kết hợp với một axit amin có gốc SH là xystein để cho một hợp chất mới Gốc SH được coi là nguyên nhân gây kích thích sinh sản của vi khuẩn Do vậy, tỏi ức chế khả năng sinh sản của vi khuẩn bằng cách phá hoạt khâu SH của xystein

Đã có nhiều báo cáo khẳng định khả năng kháng khuẩn của tỏi với vi khuẩn, virut và nấm [47] Nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Loan cho biết,

allicin trong cao tỏi có MIC đối với S.aureus lần lượt là 0,21 µg/ml và 0,39 µg/ml khi không hoặc có gia nhiệt với bột tỏi ; tương tự MIC với E.coli lần

lượt là 0,28 và 0,47 µg/ml Sử dụng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch

cho thấy, cao tỏi có đường kính vòng vô khuẩn đối với S.aureus lần lượt là

34,5 mm và 14,2 mm khi không gia công và có gia công nhiệt với bột nghệ

Tương tự, khi thử với vi khuẩn E.coli có đường kính vòng vô khuẩn lần lượt

là 27,67 mm và 10,46 mm khi không gia công và có gia công nhiệt với bột tỏi

[9] Dịch ép từ củ tỏi có khả năng kháng được vi khuẩn Vibrio vulnificus gây

bệnh lở loét trên cá bống bớp Dịch ép từ củ tỏi với tỉ lệ 1: 1 (1 g tỏi : 1 ml

21

nước) có hoạt tính kháng khuẩn lớn hơn erythomycin và tetracylin [3] Dịch chiết tỏi cho thấy, 1mg allicin từ dịch chiết tỏi có hoạt tính tương đương 16

UI penicillin Dịch chiết tỏi cũng cho thấy khả năng kháng với nhiều loại vi

khuẩn khác nhau như: Helicobacter pylori, Bacillus subtilis, E.coli,

Flavobacterium sp., Listeria moonocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, S Typhimurium, S.aureus và Vibrio parahaemolyticus Tuy nhiên báo cáo cũng

cho biết, hoạt tính của dịch chiết cũng tùy thuộc và phương pháp chiết [43] Chu Mạnh Thắng cho biết, các giống tỏi khác nhau có độ nhạy cảm với vi

khuẩn S.aureus và E.coli khác nhau Tỏi trắng Trung Quốc có độ nhạy cảm lớn nhất với vi khuẩn S.aureus nhưng ít nhạy cảm nhất với vi khuẩn E.coli Ngược lại, tỏi tía kháng mạnh nhất với vi khuẩn E.coli và yếu nhất với

S.aureus[14]

2.4.2 Khả năng kháng khuẩn của hành

Hành ta có tên khoa học là Allium fistulosum Theo Đỗ Tất Lợi (2006),

trong hành có axit maclic, phytin và alylsunfit Trong hành có chứa tinh dầu, trong đó kháng sinh alixin là thành phần chủ yếu của tinh dầu hành Hành được dùng để kích thích thần kinh, tăng bài tiết dịch tiêu hóa Tinh dầu hành

có tác dụng sát khuẩn mạnh, dùng ngoài để chữa mụn nhọt, dịch hành dùng chữa ngạt mũi cấp tính và mãn tính, viêm niêm mạc mũi Parmar và Rawat cho biết, các thành phần hóa học có trong hành được cho là có khả năng kháng viêm, chống cholesterol, ung thư, oxi hóa…Tăng cường sử dụng hành trong khẩu phần ăn làm giảm nguy cơ bị bệnh tim mạch và ung thư vòm

họng[47] Hành có hoạt tính kháng khuẩn mạnh với S.aureus và E.coli Hoạt

tính kháng khuẩn của hành yếu hơn tỏi [14]

2.4.3 Khả năng kháng khuẩn của riềng

Riềng có tên khoa học là Alpinia officinarum Hance Trong riềng có từ

0,5 – 1,5% tinh dầu, lỏng sền sệt, màu vàng xanh có mùi long não trong đó chủ yếu có xineola và metylxinnamat Ngoài tinh dầu, trong riềng còn có một

22

số hợp chất như: galangola – chất dầu có vị cay, ba chất có tinh thể là dẫn xuất của flavon không có vị chiếm khoảng 0,1% là: galangin C15H10O5, alpinin C17H16O6 và kaempferit C16H12O6 (1-3 dioxy-4-metoxyflavonon) Trong thân rễ riềng có 49 hợp chất, chiếm 99,21% dầu riềng đã được nhận diện Trong đó, một số hợp chất quan trọng là 1,8-cineole (55,39%), ∆3-carene (8,96%), β-pinene (4,29%), camphene (2,81%), limonene (2,8%), isocaryphyllene (2,52%), camphor (2,35%), α-pinene (2,27%), γ-terpinene (2,23%) và γ-cadinene (2,17%) [73] Nghiên cứu cũng cho biết, dầu riềng có

khả năng kháng mạnh với các loại vi khuẩn Gram dương S.aureus và Bacillus

subtilis, vi khuẩn Gram âm là E.coli, Klebsiella pneumoniace và S typhi,

nấm Zhang đã tìm thấy 3 hợp chất thuộc nhóm diarylheptanoids có khả năng

kháng mạnh với vi khuẩn Helicobactor pylori (Hp): với dòng Sydney MIC là

9-12 µg/ml, dòng Hp-F44 có giá trị MIC là 25-30 µg/ml [71] Nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của dịch chiết của riềng trong methanol 95% và n-butanol cho biết dịch chiết của riềng có sức kháng mạnh nhất với vi khuẩn

E.coli và thấp nhất với các vi khuẩn Bacillus subtilis, S.aureus, Micrococcus roseus MIC của dịch chiết thân rễ riềng với các loại vi khuẩn đều đạt mức 75

µg/ml Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết riềng trong các dung môi đều mạnh hơn so với kháng sinh đối chứng là ampicillin Ngoài ra, dịch chiết

riềng cũng có tính kháng mạnh với nấm là Candida albicans, Candida

trobicals, Creptococcus neoformans, Alternerria solani, Fusarium oxosporium, Aspergillus niger Dịch chiết thân dễ riềng có tính kháng nấm

mạnh hơn chất kháng nấm là Amphotericin B [37]

2.4.4 Khả năng kháng khuẩn của gừng

Gừng có tên khoa học là Zingiber offcinale Rose được trồng phổ biến ở

nước ta Theo Đỗ Tất Lợi, gừng có từ 2-3% tinh dầu, nhựa dầu (5%), chất béo (3,7%), tinh bột và các chất cay như zingeron, zingerola và shogaola Tinh dầu gừng có tỷ trọng 0,878, độ sôi từ 150 đến 2000C Tinh dầu gừng có α

23

camphen, β phelandren, zingiberen C15H24, rượu sesquitecpen, xitrala bocneola và geraniola Dựa vào hiểu biết về cấu tạo hóa học của gừng nên dễ thấy gừng có vị cay [10]

Gừng có nhiều tác dụng dược lý khác nhau như chống ung thư, chống nôn, chống đông máu, chống nhiễm trùng, chống oxi hóa, giảm đau, kháng khuẩn, tốt cho tim mạch, dạ dày, tăng cường miễn dịch, chống viêm khớp, tăng cường miễn dịch… Trong đó, gừng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và nhạy cảm với nhiều loại vi khuẩn khác nhau[50] Gừng có khả năng kháng

mạnh với các loại vi khuẩn Klebsiella pneumoniae , Proteus vulgaris,

Streptococcus pyogenes và Staphylococcus aureus [58] Dịch chiết của gừng

trong nước có khả năng kháng khuẩn mạnh hơn các loại kháng sinh thông thường như Chloromphenicol, Gentamicin Dịch chiết của gừng trong các dung môi khác nhau có khả năng kháng khuẩn khác nhau với vi khuẩn gây

bệnh [21] Dịch chiết trong cồn của gừng kháng với E.coli ở nồng độ từ 5,0

đến 20 mg/ml-1, với Pseudomonas aeruginosa ở nồng độ từ 1,25 đến 20

mg/ml-1 [24] Dịch chiết của gừng có khả năng kháng được các loại vi khuẩn

kháng đa thuốc như Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,

Escherichia coli và Salmonella typhi [18] Dịch chiết của gừng trong dung

môi cồn methanol và dung môi n-hexane có khả năng kháng khác nhau với các vi khuẩn gram (-) và gram (+), trong đó dịch chiết trong dung môi methanol có khả năng kháng khuẩn mạnh hơn trong dung môi n-hexane Gừng có khả năng kháng với vi khuẩn gram dương mạnh hơn với vi khuẩn gram âm [31]

2.4.5 Khả năng kháng khuẩn của nghệ

Nghệ có tên khoa học là Curcuma longa L (Curcuma domestica Lour) thuộc họ Gừng Zingiberaceace Trong nghệ gồm một số hợp chất như: (1)

Chất màu curcumin chiếm 0,3%, tinh thể nâu đỏ, ánh tím, không tan trong nước, tan trong rượu, ete, clorofoc, dung dịch có huỳnh quang màu xanh lục

24

Curcumin tan trong axit màu đỏ tươi, trong kiềm màu đỏ máu rồi ngả tím, tan trong chất béo Curcumin chính thức (còn gọi là curcumin I) chiếm 60% , là một dãy dixeton đối xứng không no, có thể coi là diferuloyl-metan (axit ferulic) Curcumin II hay monodesmotoxy-curcumin chiếm 24% và curcumin III hay didesmetoxy – curcumin chiếm 14% trong đó 1 hay 2 axit hydroxycinamic thay cho axit ferulic (2) Tinh dầu chiếm 1-5% màu vàng nhạt, thơm Trong tinh dầu có curcumen C15H24 một cacbon không no, 5% paratolylmetyl cacbinol và 1% long não hữu tuyến [10]

Nghệ được cho là có nhiều tác dụng dược lý khác nhau như kháng nấm, kháng khuẩn, tăng co bóp túi mật, tăng co bóp tử cung, giải độc gan, giảm galactoza niệu, giảm urobilin niệu, có khả năng kháng viêm và chống ung thư

ở người [56] Nghệ có nhiều tác dụng làm tăng tiết muxin trong dạ dày nhằm bảo vệ niêm mạc dạ dày ở thỏ, chống co thắt hồi tràng, bảo vệ tế bào gan chống lại carbon tetrachloride, D-galactosamine, peroxide và ionophore-induced toxicity; giảm các bệnh lý và bảo vệ hệ tuần hoàn; bảo vệ hệ thần kinh chống lại các hoạt động của gốc tự do; chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư, chống đột biến gen, hạn chế hoạt động của tinh trùng, giảm ảnh hưởng của đái tháo đường, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, kháng nọc độc [32]

Cao thô của nghệ kháng mạnh với nhiều loại vi khuẩn khác nhau như

S.aureus, S.faecalis, E.coli, P.aeruginosa, Sal.spp., A.hydrophila, E.ictaluri,

E.tarda Trong đó, cao nghệ có khả năng kháng mạnh nhất với E.ictaluri và S.aureus Các dòng nghệ khác nhau được thu hái tại đồng bằng sông Cửu

Long đều cho thấy hoạt tính kháng khuẩn [1] Curcumin trong cao nghệ có

MIC đối với S.aureus lần lượt là 222,5 µg/ml và 236 µg/ml khi không hoặc

có gia nhiệt với bột nghệ Sử dụng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch

cho thấy, cao nghệ có đường kính vòng vô khuẩn đối với S.aureus lần lượt là

25

14,8 mm và 13,02 mm khi không gia công và có gia công nhiệt với bột nghệ, với vi khuẩn E.coli không phát hiện vòng vô khuẩn khi thử [8]

Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết tới khả năng kháng vi khuẩn

E.coli ATCC 25922 và B subtilis DMS 3256, kết quả cho thấy, dịch chiết của

nghệ trong cồn có khả năng kháng vi khuẩn B.subtilis DMS 3256 tốt hơn dịch

chiết trong nước [52] Dịch chiết của nghệ có khả năng kháng mạnh với các loại vi khuẩn kháng thuốc từ đường niệu của bệnh nhân đái tháo đường như

E.faecalis, S.aurues, E.coli, P.aeruginosa Tuy nhiên, nồng độ dịch chiết nghệ

khác nhau có khả năng kháng khác nhau tới vi khuẩn [39] Dịch chiết nghệ

trong cồn với hàm lượng 500mg có khả năng kháng các loại vi khuẩn E.coli,

S.typhi, B.subtilis và S aureus tương đương với 100mg kháng sinh

Amoxicillin nhưng kém hơn 100mg Ciprofroxacin [49]

2.4.6 Khả năng kháng khuẩn của cây cỏ xước

Cỏ xước còn có tên là ngưu tất, có tên khoa học Euphorbia thymifolia

Burm Theo Đỗ Tất Lợi, cỏ xước có chứa tinh dầu gồm cymol, carvacrol,

limonen-sesquiterpen và acid salicylic Lá và thân chứa flavonoid cosmosiin (5,7,4-trihydroxyflavon-7-glucosid) Rễ chứa taraxerol, tirucallol và myrixyl alcohol Cỏ xước có các tác dụng dược lý như lợi tiểu, kích thích co bóp tủ cung, ức chế sự co bóp của tá tràng Cỏ xước có tác dụng ức chế các chủng tụ cầu vàng và được sử dụng như là một loại thuốc kháng tụ cầu vàng [10]

2.4.7 Khả năng kháng khuẩn của cây cỏ sữa lá nhỏ

Cỏ sữa lá nhỏ có tên khoa học là Achyranthes aspera mọc phổ biến các

khu vực nhiều sỏi, đá, khe gạch, sân xi măng Thành phần hóa học toàn thân có alkaloid, thân và lá có 0,37% cosmosiin C21H20O10, rễ có taraxerol, tirucllol và myrixylalcohol Dung dịch 1/20 đến 1/40 của cây cỏ sữa có khả năng ức chế sự sinh sản của các loại vi trùng lị Sonner, Flexne và Shiga Ngoài ra, loài cây này còn được sử dụng làm thuốc chữa các bệnh ngoài ra và vết thương [10]

26

2.4.8 Khả năng kháng khuẩn của cây rẻ quạt

Rẻ quạt còn có tên khác là xạ xan, có tên khoa học của cây rẻ quat:

Belamcanda chinensis

Thành phần hóa học: lớp chất iridal-tritecpenoid, flavonoid và isoflavonoid có trong thân rễ, các phenol, benzoquinon và benzofural có trong hạt Theo đông y, rẻ quạt có Tác dụng dược lí gồm: Kháng khuẩn tiêu viêm, giảm ho; chữa viêm thanh quản, amidan, viêm họng, hen suyễn; chữa các triệu chứng báng bụng [10]

Trên cơ sở các nghiên cứu trên thế giới, cùng với mục tiêu làm sáng tỏ tác dụng chữa bệnh của cây rẻ quạt trong dân gian Nhờ các hợp chất tectorigenin và tectoridin từ thân rễ cây rẻ quạt có tác dụng kháng viêm, giảm

ho, trừ đờm của các hợp chất này trên động vật thực nghiệm [10]

2.4.9 Khả năng kháng khuẩn của rau sam

Rau sam có tên khoa học là Portulacea oleracea Thành phần hóa học

trong rau sam chưa được làm rõ Các nghiên cứu trước đây cho thấy, rau sam

có khả năng ức chế khả năng sinh sản của vi khuẩn lỵ Trên lâm sàng, người

ta sử dụng rau sam để chữa cho người bị lỵ trực tràng cấp tính Ngoài ra, cây này còn có tác dụng chữa ho lâu ngày; dùng ngoài và uống chữa mụn nhọt, sưng đau và trĩ Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cho thấy chiết xuất

P.Oleracea có tác dụng diệt được các loại vi khuẩn [10]

2.5 Tổng quan tình hình sử dụng thảo dược trong chăn nuôi

2.5.1 Sử dụng thảo dược trong phòng và điều trị bệnh cho vật nuôi

Thảo dược có khả năng kháng khuẩn được nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu Đã có nhiều công bố về khả năng phòng trị bệnh cho nhiều đối tượng vật nuôi khác nhau của nhiều loại thảo dược khác nhau Tác dụng dược lý của thảo dược sử dụng trong phòng và trị bệnh còn phụ thuộc vào phần sử dụng và phương pháp chiết các hợp chất trong thảo dược Tùy thuộc và thành phần hóa học của thảo dược có thể hòa tan trong

27

các dung môi khác nhau Hiệu quả của thảo dược cũng phụ thuộc vào dịch chiết là tinh khiết hay dịch chiết thô Các nghiên cứu đều chứng minh được hiệu quả phòng và trị bệnh của thảo dược trong chăn nuôi

Thảo dược có tính kháng khuẩn bổ sung vào thức ăn chăn nuôi làm tăng cường hoạt động của hệ vi sinh vật có lợi ở đường ruột bằng cách hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh Sức khỏe của vật nuôi được tăng cường do giảm thiểu được các chất độc gây ra do vi khuẩn có hại Năng suất của vật nuôi cũng được nâng cao do tăng cường được sức kháng stress và tăng hấp thu các chất dinh dưỡng thiết yếu [62]

Di Pasqua tìm thấy sự thay đổi trong chuỗi dài axit béo ở màng tế bào

E.coli nuôi cấy trong điều kiện bổ sung cinnamaldehyde [65] Kết quả tương

tự cũng được phát hiện thấy khi nuôi cấy vi khuẩn Salomonella enterice trong carvarol, eugenol và Bronchotrix thermophacta trong mimonene,

cinnamaldehyle, carvarol, eugenol Cơ chế chủ yếu về khả năng kháng khuẩn của thảo dược là do các hợp chất hóa học trong thảo dược đã thay đổi đặc điểm của màng tế bào, tạo ra các lỗ thủng trên màng tế bào Bên cạnh việc hạn chế sự phát triển của vi khuẩn gây hại Thảo dược còn làm tăng số lượng

vi khuẩn có lợi Bổ sung hỗn hợp cinnamaldelhyde, capsicum oleoresim và carvacrol kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactobacilli, do vậy làm tăng tỷ

lệ lactobacilli so với vi khuẩn đường ruột

Nghiên cứu tác dụng của thảo dược trong việc bảo vệ sức khỏe của từng đối tượng vật nuôi có nhiều báo cáo được công bố Nghiên cứu khả năng

phòng và trị bệnh do Aeromonas hydrophila gây ra trên ếch Thái Lan (Rana

tigerina) cho thấy, bổ sung 30g tỏi và 40g tỏi vào khẩu phần ăn của ếch trong

14 ngày đã làm giảm đáng kể tỷ lệ chết (giảm lần lượt là 26,7% và 22,2%)

của ếch được gây nhiễm Aeromonas hydrophila [15]

28

2.5.2 Sử dụng thảo dược nhằm nâng cao năng suất sản xuất của vật nuôi

2.5.2.1 Bổ sung thảo dược nhằm nâng cao sức sản xuất trong chăn nuôi gia cầm

Seyed đã so sánh khả năng sản xuất thịt của gà thịt sử dụng các khẩu

phần bổ sung cây thì là (Cuminum cyminum), bạc hà (Mentha piperita), cỏ thi (Achillea milleforium) và Teucrium polium vào khẩu phần ăn của gà thịt từ 0

đến 42 ngày tuổi so sánh với gà sử dụng khẩu phần ăn bổ sung kháng sinh flavomycin Kết quả cho thấy, các loại thảo dược đã ảnh hưởng tích cực đến khả năng sinh trưởng, chất lượng thân thịt và các chỉ tiêu sinh lý hóa máu của

gà thịt [55] Tuy nhiên, khả năng thu nhận thức ăn (FI) của gà ở các khẩu phần là tương đương nhau; FCR của gà trong khẩu phần bổ sung thảo dược tương đương hoặc cao hơn trong khẩu phần đối chứng và khẩu phần có kháng sinh Bổ sung thảo dược đã làm giảm đáng kế số lượng vi khuẩn

Bifidobacterium, Clostridium trong ruột kết của gà so với đối chứng Số

lượng vi khuẩn Lactobacillus và Colifrom của vi khuẩn trong ruột kết của gà

ở các lô không có sai khác có ý nghĩa thống kê Như vậy, các loại thảo dược

bổ sung vào khẩu phần ăn của gà đã không ảnh hưởng đến thu nhận thức ăn, FCR của gà thí nghiệm nhưng đã làm giảm số lượng vi khuẩn gây hại trong đường ruột của gà

Al-Sultan nghiên cứu ảnh hưởng của bột nghệ đến khả năng sản xuất của gà thịt với mức bổ sung 0,25% trong khẩu phần ăn đã làm tăng khả năng tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn cho kg tăng trọng (FCR) của gà; trong đó mức 0,5% bột nghệ cho hiệu quả tốt nhất Bột nghệ trong khẩu phần cũng ảnh hưởng đến chất lượng của thịt gà Bổ sung 0,25% và 0,5% làm giảm tỷ lệ chất béo trong thịt gà Mùi vị, độ mềm của thịt gà được cải thiện đáng kể khi bổ sung 0,5 và 1% nghệ trong khẩu phần ăn Hơn nữa, bổ sung bột nghệ đã không làm thay đổi thành phần hữu hình trong máu như số lượng hồng cầu và bạch cầu [22]

29

Kích thước bột gừng (ở các kích thước 300, 149, 75, 37 và 8,4 µm) bổ sung trong khẩu phần ăn đã ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và chống oxy hóa của gà thịt Giảm kích thước của hạt gừng bổ sung trong thức ăn làm giảm cholesterol, tăng glutathione peroxidase và superoxide dismutase tổng

số và protein tổng số trong huyết thanh Bổ sung 5g/kg bột gừng trong thức ăn

đã cải thiện khả năng chống oxi hóa của gà Kích thước hạt gừng càng giảm thì khả năng chống oxi hóa càng tăng [71]

Bổ sung bột gừng trong khẩu phần ăn của gà thịt có ảnh hưởng đến đến khối lượng giết thịt và chất lượng thân thịt Khẩu phần có bổ sung bột gừng ở các mức khác nhau (0,5%, 1%, 1,5% và 2%) đều làm tăng khối lượng giết thịt,

tỷ lệ thân thịt của gà và giảm hiệu quả sử dụng thức ăn, khối lượng mỡ và tỷ lệ

mỡ của thân thịt Bột gừng không có những ảnh hưởng rõ ràng tới chất lượng thân thịt của gà, ngoại trừ làm tăng mùi vị trong thịt gà pH của thịt gà cũng tăng nhẹ khỉ bổ sung bột gừng và làm giảm tỷ lệ mất nước trong chế biến của thịt gà so với đối chứng Bổ sung bột gừng vào thức ăn của gà thịt ở mức 1,0 và 1,5% là thích hợp nhất Bột gừng làm tăng năng suất sản xuất và chất lượng thân thịt của gà [30]

Có thể bổ sung 0,25 % bột gừng hoặc hỗn hợp gồm 0,25% bột gừng và 0,25% bột tỏi trong khẩu phần ăn của gà thịt cũng Khả năng tăng trọng của gà tăng lên đáng kể trong khi hiệu quả chuyển hóa thức ăn giảm rõ rệt Sử dụng hỗn hợp bột gừng và tỏi cho hiệu quả chăn nuôi tốt hơn bột gừng [44]

Nghiên cứu ảnh hưởng của thảo dược tới khả năng sinh trưởng và các đặc tính sinh hóa cholesterol đối với gà đẻ hậu bị cho thấy hỗn hợp bột tỏi và gừng trong khẩu phần ăn gà mái hậu bị đã làm giảm cholesterol và LDL (Low Density Lipoprotein) ở gà hậu bị Khẩu phần với 1% tỏi + 0,5% gừng và 2% tỏi + 0,75% gừng là lý tưởng nhất để làm giảm cholesterol, LDL và tăng trọng của gà [25]

30

Bổ sung bột gừng với tỷ lệ khác nhau trong khẩu phần ăn của gà trống hậu bị từ hai tuần tuổi trong 7 tuần không ảnh hưởng tới thu nhận thức ăn, khả năng tăng trọng, hiệu quả sử dụng thức ăn, các chỉ tiêu huyết học, số lượng bạch cầu và số lượng tế bào lymphocyte của gà Tuy nhiên, tỷ lệ thành phần hữu hình, số lượng hồng cầu, ure máu, hàm lượng creatine tăng lên đáng kể (p

< 0,05) ở gà sử dụng khẩu phần có bổ sung bột gừng ngoại trừ khẩu phần bổ sung 1,5% bột gừng Bổ sung bột gừng ở các mức từ 1,5% đến 3% trong khẩu phần cho gà trống hậu bị là tối ưu nhất [35]

2.5.2.2 Bổ sung thảo dược nhằm nâng cao sức sản xuất trong chăn nuôi lợn

Nghiên cứu bổ sung thảo dược trong thức ăn của lợn như là một loại thức ăn bổ sung còn khá hạn chế Không có nhiều công bố của các nhà khoa học liên quan đến khía cạnh này Tuy nhiên, một số tác giả cũng đã đề cập đến vấn đề sử dụng các loại thảo dược nhằm làm tăng khả năng sản xuất của lợn và ảnh hưởng của các loại thảo dược tới khả năng kháng bệnh của lợn

Đặng Minh Phước đã thử nghiệm 02 chế phẩm từ thảo dược là chế phẩm

F bao gồm hồi, quế, tỏi, gừng, bách xù, hương thảo, húng tây, cỏ thi, ớt và chế phầm G bao gồm bạch chỉ, đảng sâm, kinh anh từ, địa du bổ sung ở mức 500g/tấn thức ăn lợn con và từ 150 đến 300 g/tấn thức ăn cho lợn thịt đã cải thiện đáng kể năng suất chăn nuôi lợn Khả năng tăng trọng cao hơn lợn đối chứng và lợn sử dụng khẩu phần bổ sung 40 ppm avilamycin Bổ sung thảo dược làm tăng thu nhận thức ăn của lợn trong thí nghiệm và giảm tiêu tốn thức

ăn cho mỗi kg tăng trọng của lợn Hơn nữa, tỷ lệ tiêu chảy của lợn thí nghiệm cũng giảm rõ rệt Tỷ lệ lợn nhiễm E.coli dung huyết và Salmonella cũng giảm đáng kể sau thí nghiệm Do vậy, tác giả đã kết luận, hiệu quả kinh tế từ việc sử dụng các loại thảo dược này trong khẩu phần ăn của lợn là cao hơn so với đối chứng và so với lợn sử dụng khẩu phần có bổ sung kháng sinh [13]

Bổ sung 3 kg/tấn thức ăn bột tỏi, nghệ vào thức ăn của lợn con từ 30 đến

90 ngày tuổi cho thấy sử dụng thảo dược đã cải thiện đáng kể hệ số chuyển hóa

31

thức ăn, chi phí trên một kg tăng trọng so với lợn ở các lô sử dụng kháng sinh Hỗn hợp tỏi-nghệ với mức 3kg/tấn thức ăn cho hiệu quả cao nhất (giảm 17,03% chi phí/kg tăng trọng) Nghiên cứu cũng cho thấy hiệu quả của bổ sung tỏi, nghệ tới khả năng bảo vệ sức khỏe đàn lợn Bổ sung bột tỏi nghệ đã cải thiện khả năng kháng bệnh của lợn từ 30 đến 90 ngày tuổi đã giảm 3% tỷ lệ tiêu chảy và 3% tỷ lệ ho thở ở đàn lợn Phân tích các vi khuẩn gây bệnh cơ hội trong phân (coliform và Enterococcus) cũng giảm đáng kể khi bổ sung bột tỏi nghệ vào khẩu phần ăn của lợn Bên cạnh đó, số lượng vi khuẩn sinh lactic trong phân, chiều cao nhung mao ruột lợn ở 60 ngày tuổi trong các lô sử dụng khẩu phần bổ sung thảo dược cải thiện đáng kể so với lợn sử dụng khẩu phần

bổ sung kháng sinh [8] Một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu của lợn trong thí nghiệm này cũng bị ảnh hưởng đáng kể khi bổ sung thảo dược Số lượng hồng cầu, albumin huyết thanh của lợn sử dụng khẩu phần bổ sung 3kg bột tỏi, nghệ cao hơn lợn sử dụng khẩu phần bổ sung kháng sinh

Bổ sung 5% vật chất khô (VCK) carvacrol, 3% VCK cinnamaldehyde và 2% capsicum oleoresim chiết từ cây kinh giới, thì là và hồ tiêu Mexico đã làm tăng sức chứa của dạ dày và thời gian lưu lại của thức ăn trong dạ dày do vậy cũng đồng thời làm tăng pH Dịch chiết thảo dược cũng làm giảm vi khuẩn tổng số trong hồi tràng và tăng tỷ lệ vi khuẩn lactobacilli/enterobacteria Thành phần axit béo bay hơi trong manh tràng và đại tràng cũng thay đổi đáng kể, acetate tăng lên và giảm hàm lượng butyrate và valerate Dịch chiết từ thảo dược đã ảnh hưởng đến hệ sinh thái đường ruột của lợn, sức chứa của dạ dày và

tỷ lệ rỗng của dạ dày Đây chính là điều rất quan trọng giải thích cơ chế hoạt động của loại thức ăn bổ sung này [70]

32

PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 1 năm 2013 đến tháng 12 năm 2014

- Địa điểm và thời gian nghiên cứu

+ Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn, phương pháp chế biến thảo dược, xác định số lượng vi khuẩn đường ruột được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Khoa học động vật, Trường Đại học Hùng Vương

+ Lợn thí nghiệm được nuôi tại: Trang trại chăn nuôi lợn công nghiệp của bà Nguyễn Thị Oanh, Sơn Dương, Lâm Thao; Trung tâm thực nghiệm trường Đại học Hùng Vương và Trang trại ông Trần Xuân Mỹ, Khu 1, thị trấn Phong Châu, Phù Ninh

+ Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu, tổ chức ruột, chất lượng thịt lợn được phân tích tại Học Viện Nông nghiệp Việt Nam và Bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ

3.2 Đối tượng nghiên cứu

- Thảo dược: Cỏ sữa (Euphorbia thymifolia Burm), cỏ xước

(Achyranthes aspera L), rẻ quạt (Belamcanda chinensis DC Red), rau sam

(Portulacea oleracea L), hành (Allium fistulosum L), tỏi (Allium sativum L), gừng (Zingiber offcinale Rosc), riềng (Apinia officinarum Hance), nghệ (Curcuma longa Lour)

- Vi khuẩn: E.coli, Sallmonela, Staphylococus được lưu giữ tại Phòng

thí nghiệm Khoa học động vật, Trường Đại học Hùng Vương

- Lợn thịt giống LYxPD (Landrace x Yorshire)x(Pietran x Duroc) từ sau cai sữa ở 21 ngày đến xuất chuồng

33

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Khảo sát, điều tra các loại thảo dược có tính kháng khuẩn phổ biến trên địa bàn tỉnh Phú Thọ

Lập danh mục và xác định mức độ phổ biến của các loại thảo dược có tính kháng khuẩn trên địa bàn tỉnh Phú Thọ Khảo sát kinh nghiệm sử dụng thảo dược trong chăn nuôi lợn

3.3.2 Lựa chọn và xác định phương pháp chế biến thảo dược thích hợp

+ Đánh giá khả năng kháng khuẩn invitro của dịch ép tươi trong cồn 70% các loại thảo dược để chọn 04 loại có tính kháng khuẩn cao nhất

+ Chế biến và bảo quản 04 loại thảo dược đã được lựa chọn bằng 03 phương pháp khác nhau là: sấy khô; ngâm cồn 70%; ngâm acid acetic 5% + Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các sản phẩm thảo dược được bảo quản tại các thời điểm 2, 4, 8, 16 tuần

+ Lựa chọn 03 sản phẩm để thử nghiệm bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

lợn

3.3.3 Đánh giá hiệu quả sử dụng thảo dược trong chăn nuôi

- Các chỉ tiêu đánh giá khả năng sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn

+ Tăng trọng tích lũy (kg)

+ Tăng trọng tuyệt đối (ADG g/con/ngày)

+ Khả năng thu nhận thức ăn (kg thức ăn/con)

+ Khả năng sử dụng thức ăn (FCR)

- Các chỉ tiêu đánh giá khả năng kháng bệnh của lợn trong thí nghiệm

+ Tỷ lệ ngày con tiêu chảy (%)

+ Tỷ lệ ngày con ho thở (%)

- Các chỉ tiêu huyết học của lợn

+ Các chỉ tiêu sinh lý máu (tính trên 1 lít máu): số lượng bạch cầu, số lượng hồng cầu, lượng hemoglobin, khối hồng cầu hematocrit, thể tích trung

- Chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thảo dược tới tổ chức vi thể ruột lợn

+ Chiều cao vi lông nhung ruột lợn (µm)

+ Độ sâu mào ruột (µm)

- Các chỉ tiêu đánh giá ảnh hưởng của thảo dược tới hệ vi sinh vật đường ruột của lợn

+ Số lượng vi khuẩn sinh lac tic (Lactobacilli) (log10cfu/g)

+ Coliform (log10cfu/g)

+ Tỷ lệ Lactobacilli/Coliform

- Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng thân thịt và chất lượng thịt lợn

+ Chỉ tiêu đánh giá chất lượng thân thịt lợn: Khối lượng thân thịt (kg);

Tỷ lệ thân thịt (%); Khối lượng thịt xẻ (kg); Tỷ lệ thịt xẻ (%)

+ Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng thịt lợn: pH45; pH24; Màu sắc thịt:

Độ sáng (L), màu đỏ (a), màu vàng (b); Tỷ lệ mất nước bảo quản (%); Độ dai (N); Mùi vị

- Các chỉ tiêu sơ bộ hạch toán kinh tế trong chăn nuôi lợn

+ Tổng chi phí/con (nghìn đồng)

+ Tổng thu/con (nghìn đồng)

+ Lãi tạm tính (nghìn đồng/con)

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Khảo sát, điều tra các loại thảo dược có tính kháng khuẩn phổ biến trên địa bàn tỉnh Phú Thọ

- Lập danh mục các loại thảo dược có tính kháng khuẩn: tra cứu dược điển thảo dược Việt Nam kết hợp với tìm hiểu kinh nghiệm sử dụng của người dân, lựa chọn danh mục các loại thảo dược có tính kháng khuẩn

35

- Xác định mức độ sẵn có: Chúng tôi tiến hành điều tra trên các khu vực

điều tra gồm thành phố Việt Trì, Thị xã Phú Thọ và các huyện Phù Ninh, Tam

Nông, Thanh Sơn; Lâm Thao Sử dụng phương pháp phân tích đánh giá đa

tiêu chuẩn (Multi Createria Analysis) để xây dựng mẫu phiếu điều tra, như

sau:

(1) Xác định các tiêu chuẩn về: Khả năng thu hái; Tần xuất bắt gặp theo

mùa vụ; Khả năng gieo trồng;

(2) Lượng hóa các tiêu chuẩn theo thang điểm 10: Lượng hóa các tiêu

chuẩn bằng cách cho điểm theo các tiêu chí như sau:

Tiêu chuẩn 1 Khả năng thu hái

Nhiều - Một người có thể thu hái với số lượng >10 kg/ngày 3

Trung bình - Một người có thể thu hái với số lượng 3-10

kg/ngày

2

Ít - Một người có thể thu hái với số lượng <3 kg/ngày 1

Tiêu chuẩn 2 Tần xuất bắt gặp theo mùa vụ

Tần xuất bắt gặp trong khu vực điều tra Điểm Thường xuyên - có thể thu hái quanh năm 3

Thỉnh thoảng - chỉ thu hái khi vào mùa nhất định 2

36

Tiêu chuẩn 3 Khả năng gieo trồng

Đang được gieo trồng để sử dụng thường xuyên 4

Có thể gieo trồng, tiềm năng phát triển tốt 3

Chưa được gieo trồng 1

(3) Tính điểm và xếp thứ tự

(4) Thu thập mẫu cây và giám định tên loài tại thực địa

(5) Khảo sát kinh nghiệm sử dụng thảo dược trong chăn nuôi lợn bằng

các câu hỏi mở về: bộ phận, tuổi, thời điểm thu hái của cây được sử dụng làm

thuốc, phương pháp sử dụng qua chế biến hay không qua chế biến

3.4.2 Lựa chọn và xác định phương pháp chế biến thảo dược thích hợp

a Phương pháp sơ chế thảo dược

Thảo dược được thu hái, sau đó được rửa sạch, loại bỏ phần thối hỏng,

để ráo nước, cắt ngắn hoặc thái lát

b Phương pháp chế biến, bảo quản

* Phương pháp sấy khô

Thảo dược sau khi sơ chế được sấy khô ở 500C trong từ 3-5 ngày để đạt

độ ẩm từ 8 đến 13% Sau đó, thảo dược khô được được ghi nhãn, bảo quản trong

túi nilon kín ở nhiệt độ phòng Trước khi dùng để trộn thức ăn hoặc chiết dịch

thử hoạt tính, thảo dược được nghiền nhỏ bằng máy nghiền với mắt sàng kích

thước 0,5mm

* Phương pháp ngâm cồn 70%

Thảo dược sau khi sơ chế được ngâm với cồn 70% theo tỷ lệ 1/1 (g/ml)

Dịch ngâm này được bảo quản trong các bình thủy tinh, bịt kín miệng, ghi nhãn

sản phẩm

37

* Phương pháp ngâm trong dấm ăn

Thảo dược sau khi sơ chế được ngâm với dấm ăn (acid acetic 5%) theo tỷ

lệ tỷ lệ 1/1 (g/ml) Dịch ngâm này được bảo quản trong các bình thủy tinh, bịt kín miệng, ghi nhãn sản phẩm

c Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của thảo dược

Chúng tôi sử dụng phương pháp khoang giấy trên môi trường thạch đặc

để đánh giá khả năng kháng khuẩn của thảo dược

- Chuẩn bị dịch chiết thảo dược:

+ Thảo dược tươi được nghiền nát với cồn 70% theo tỷ lệ 1/1 (g/ml)

+ Thảo dược bảo quản trong môi trường cồn hoặc acid acetic: dịch ngâm được chắt vào các thời điểm mong muốn sau đó ly tâm lấy dịch nổi để đánh giá khả năng kháng khuẩn

+ Thảo dược bảo quản ở dạng khô được nghiền nhỏ, ngâm với cồn 70% theo tỷ lệ theo tỷ lệ 1/4 (g/ml) Sau 24h chắt dịch ngâm thảo dược, ly tâm lấy dịch nổi để đánh giá khả năng kháng khuẩn

- Chuẩn bị khoanh giấy tẩm dịch chiết thảo dược hoặc kháng sinh: Các khoanh giấy lọc có đường kính 6mm được sấy khô và khử trùng ở 1500C trước khi được tẩm dịch chiết thảo dược Mỗi khoanh giấy được tẩm 0,3 ml dịch chiết thảo dược hoặc dung dịch Gentamicin ở nồng độ 50ppm và làm khô 550C trong bình hút chân không

- Chuẩn bị môi trường thạch và cấy chan các vi khuẩn thử nghiệm: vi khuẩn thử nghiệm được láng đều trên bề mặt thạch Muller Hilton (MH) với số lượng 0,15 x 106 CFU /đĩa thạch (0,15ml canh khuẩn giống ở nồng độ 106CFU /ml), sau đó để trong tủ ấm khoảng 10 phút

- Tiến hành đặt các khoanh giấy tẩm dịch chiết thảo dược lên trên bề mặt đã được láng vi khuẩn thử nghiệm, các khoanh giấy cách nhau 2cm Mỗi đĩa thạch đặt thêm một khoanh giấy đối chứng âm (không tẩm) và môt khoanh tẩm Gentamycin làm đối chứng dương Các đĩa thạch được nuôi trong

38

tủ ấm ở 370C trong 18-20 giờ Khả năng kháng khuẩn được xác định dựa trên đường kính vòng vô khuẩn

d Đọc kết quả về khả năng kháng khuẩn

- Khả năng kháng khuẩn được xác định bằng đường kính vòng vô khuẩn và cho điểm -/+ như sau:

(-) là không quan sát được vòng vô khuẩn

(+) là các vòng vô khuẩn có kích thước từ trên 8 đến 12mm

(++) là các vòng vô khuẩn có kích thước từ trên 12 đến 18mm

(+++) là các vòng vô khuẩn lớn hơn 18mm

3.4.3 Đánh giá hiệu quả của việc bổ sung thảo dược tới khả năng sản xuất

và chất lượng thịt lợn

a Bố trí thí nghiệm

- Lợn con cai sữa ở 21 ngày tuổi được chia làm 08 lô thí nghiệm Lợn thí nghiệm được theo dõi đến khi xuất chuồng Kết quả theo dõi được phân tích theo 02 giai đoạn: Giai đoạn từ sau cai sữa đến 60 ngày tuổi và giai đoạn lợn từ 61 đến 130 ngày tuổi

0,5%

Rẻ quạt

0,25%

Cỏ sữa

0,5%

Cỏ sữaN1 6 7 7 6 7 6 7 6 N2 7 7 7 7 8 7 7 7 N3 7 7 8 7 8 7 7 7 Tổng 20 21 22 20 23 20 21 20

39

KS: 50ppm chlotetracyline

N: số lượng lợn (con) thí nghiệm của từng lần lặp 1,2,3

PTB (kg): Khối lượng trung bình của lợn khi bắt đầu thí nghiệm tính bằng kg

Khối lượng lợn lúc bắt đầu vào thí nghiệm không có sự sai khác về mặt

thống kê (p =0,05)

Lợn được phân lô ngẫu nhiên, chăm sóc nuôi dưỡng theo quy trình của

trại chăn nuôi Thức ăn được phối trộn trên cơ sở khẩu phần thiết kế theo

bảng 3.1, sau đó được bổ sung như sơ đồ bố trí thí nghiệm

Bảng 3.1 Thành phần nguyên liệu và giá trị dinh dưỡng khẩu phần

ăn của lợn trong thí nghiệm

Tỷ lệ nguyên liệu trong hỗn hợp (%) Thành phần dinh dưỡng

Sắn củ đen Tuyên Quang 12.0 ME (Kcal/kg) 3100

b Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu nghiên cứu

- Các chỉ tiêu đánh giá khả năng sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức

ăn của lợn: Khối lượng lợn được cân vào các thời điểm: sau khi cai sữa, 61

ngày tuổi và 130 ngày tuổi Lợn được cân bằng cân điện tử, sai số 100g

FCR = Khối lượng tăng trọng trong thời gian thí nghiệm Thức ăn thu nhận trong thời gian thí nghiệm

- Các chỉ tiêu đánh giá khả năng kháng bệnh của lợn trong thí nghiệm:

Số lượng lợn bị tiêu chảy và ho thở được ghi chép hàng ngày

+ Tỷ lệ ngày con tiêu chảy = Tổng số ngày con bị tiêu chảy Tổng số ngày con nuôi x 100

+ Tỷ lệ ngày con ho thở = Tổng số ngày con bị ho thở Tổng số ngày con nuôi x 100

- Các chỉ tiêu huyết học của lợn: Máu lợn được lấy tại các thời điểm 70

ngày tuổi, lấy máu của 05 con lợn/lô thí nghiệm, mỗi con lợn được lấy 5ml, máu được đựng trong ống chống đông, bảo quản nhiệt độ từ 2 - 80C Các chỉ tiêu huyết học được phân tích bằng hệ thống máy xét nghiệm NIHON KOHDEN tại Phòng thí nghiệm trung tâm, khoa Chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Bệnh viện Đa khoa tỉnh Phú Thọ

+ Các chỉ tiêu sinh lý máu (tính trên 1 lít máu): số lượng bạch cầu, số lượng hồng cầu, lượng hemoglobin, khối hồng cầu hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, lượng Hemoglobin trung bình hồng cầu, nồng độ Hb trung bình hồng cầu

+ Các chỉ tiêu sinh hóa máu (tính trên 1 lít máu): Protein (g/l), Albumin (g/l), Globulin (g/l), Bilirubin (mmol/l), Ure (mmol/l), GOT (U/l), BOT (U/l)