Nền kinh tế phát triển, cùng với hội nhập kinh tế toàn cầu, mức sống của người dân được nâng cao, vai trò của ngành chăn nuôi trở lên quan trọng, đặc biệt là ngành chăn nuôi lợn. Ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứng nhu cầu thực phẩm trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ. Theo CIRAD - Trung tâm hợp tác quốc tế về nghiên cứu nông nghiệp vì phát triển , thịt lợn chiếm 77% tổng lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam [26]. Mục tiêu của kế hoạch phát triển chăn nuôi lợn của Việt Nam theo chiến lược phát triển chăn nuôi đến 2020: đàn lợn từ 29,9 triệu con năm 2010, lên 32,9 triệu con năm 2015 và lên 34,7 triệu con năm 2020. Sản lượng thịt hơi từ 3,1 triệu tấn năm 2010, lên 3,9 triệu tấn năm 2015 và 4,8 triệu tấn năm 2020; sản lượng thịt xẻ từ 2191,3 ngàn tấn năm 2010; 2794,7 ngàn tấn năm 2015 và 3493,1 ngàn tấn năm 2020. Trong đó đàn lợn nuôi công nghiệp 5,8 triệu con (chiếm 19,3%) năm 2010, lên 8,9 triệu con (chiếm 27,0%) năm 2015 và lên 12,9 triệu con (chiếm 37,0%) năm 2020. Sản phẩm thịt hơi nuôi công nghiệp từ 1135,2 ngàn tấn (chiếm 36,5%) năm 2010; 1851,5 ngàn tấn (chiếm 47,2%) năm 2015 và 2866 ngàn tấn (chiếm 59,%) năm 2020 [7]. Để đạt được những mục tiêu có tính chiến lược đó, việc đầu tư cho công tác giống, quan tâm đến vấn đề thức ăn, các chương trình quản lý; đặc biệt nhiệm vụ của công tác chăn nuôi – thú y càng nặng nề hơn, tăng cường áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật cho công tác phòng, chống dịch bệnh ở vật nuôi có hiệu quả là điều hết sức quan trọng. Một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôi lợn là dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra trên các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm giảm năng suất, giảm chất lượng con giống. Sản phẩm thịt lợn nhiễm bệnh làm tăng nguy cơ mất an toàn vệ sinh thực phẩm. Một trong những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh phó thương hàn và phù đầu do vi khuẩn Salmonella và Escherichia coli (E.coli) gây ra. Bệnh do vi khuẩn Salmonella và E.coli xảy ra ở hầu hết các loại hình chăn nuôi và gây ra thiệt hại rất lớn về kinh tế cho các nhà chăn nuôi. Việc sử dụng kháng sinh tràn lan đã dẫn đến tỷ lệ rất lớn các chủng vi khuẩn kháng lại kháng sinh, do vậy việc điều trị bệnh gặp rất nhiều khó khăn. Các loại vắc-xin thú y ngoài việc bảo vệ sức khỏe cho động vật nuôi còn có tác dụng bảo vệ sức khỏe cộng đồng, bởi vì việc sử dụng vắc-xin làm giảm đi đáng kể sử dụng các loại kháng sinh và các loại kích thích tố trong chăn nuôi, dẫn đến giảm đi sự tồn đọng của chúng trong quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm cho người [59, 74]. Sử dụng vắc-xin phòng bệnh vẫn là một lựa chọn số 1 đối với các nhà chăn nuôi. Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại vắc-xin vi trùng, trong đó hai loại vắc-xin vô hoạt và vắc-xin nhược độc được sử dụng nhiều nhất. Vắc-xin vô hoạt ít hiệu quả hơn so với các loại vắc-xin sống nhược độc [35]. Những năm gần đây có rất nhiều nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắc-xin sống nhược độc. Tuy nhiên các loại vắc-xin sống nhược độc tạo ra qua tác dụng lý hóa hoặc bằng phương pháp tiếp truyền truyền thống chỉ giới hạn ở một số loại mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắc-xin nhược độc quay trở lại độc lực cao là rất lớn [52, 69]. Để khắc phục những mặt hạn chế trên, loại vắc-xin thế hệ mới ra đời, một trong số đó là vắc-xin tái tổ hợp. Quá trình tạo vắc-xin tái tổ hợp bắt đầu bằng việc tạo chủng vi khuẩn nhược độc. Sử dụng kỹ thuật gen để loại bỏ những gen gây bệnh của vi khuẩn nhưng vẫn giữ nguyên các đặc tính sinh học, sinh trưởng và phát triển như vi khuẩn ban đầu [24, 45, 63]. Sau đó tổ hợp gen biểu hiện kháng nguyên ngoại lai cùng với hệ thống khởi động được thiết kế và ghép vào chủng vi khuẩn nhược độc. Chủng này mang plasmid tái tổ hợp mang kháng nguyên ngoại lai. Vì vậy trên chủng vắc-xin mang đồng thời 2 loại kháng nguyên, kháng nguyên của vi khuẩn và kháng nguyên ngoại lai. Hiện nay, tại Việt Nam có hai loại vắc-xin phòng bệnh phó thương hàn lợn đó là vắc-xin vô hoạt và vắc-xin nhược độc. Đối với bệnh phù đầu trên lợn do E.coli gây ra, hiện nay có một số cơ sở sản xuất vắc-xin phòng bệnh phù đầu ở dạng bacterin. Đến nay, vẫn chưa có vắc-xin kép phòng hai bệnh trên. Vì vậy, để phòng cả hai bệnh trên thì phải tiêm hai mũi vắc-xin khác nhau gây stress lớn cho lợn, ảnh hưởng tốc độ tăng trưởng của lợn. Việc áp dụng những kỹ thuật tiên tiến của Mỹ để nghiên cứu chế tạo vắc-xin tái tổ hợp đa giá chất lượng cao, giá thành hạ với một lần tiêm có thể phòng được nhiều bệnh là việc làm cần thiết góp phần hạn chế những thiệt hại do bệnh gây ra. Từ yêu cầu thực tế và những tìm hiểu về tình hình nghiên cứu chế tạo vắc-xin thế hệ mới đang được thực hiện tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, việc nghiên cứu tạo chủng vắc xin Salmonella choleraesuis (S.choleraesuis) nhược độc mang gen crp (cAMP receptor protein), gen asd (aspartic semialdehyde dehydrogenase) đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp mang plasmid ngoại lai của E.coli để phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn được đặt ra có ý nghĩa về khoa học và thực tiễn cao. Để góp phần đi tới đích chung nêu ra ở trên trong luận văn này tôi thực hiện các nghiên cứu ở công đoạn đầu với nội dung: ”Nghiên cứu tạo chủng vắc-xin S.choleraesuis nhược độc làm chủng vi khuẩn biến nạp”.
ĐẶT VẤN ĐỀ Nền kinh tế phát triển, cùng với hội nhập kinh tế toàn cầu, mức sống của người dân được nâng cao, vai trò của ngành chăn nuôi trở lên quan trọng, đặc biệt là ngành chăn nuôi lợn. Ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứng nhu cầu thực phẩm trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ. Theo CIRAD - Trung tâm hợp tác quốc tế về nghiên cứu nông nghiệp vì phát triển , thịt lợn chiếm 77% tổng lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam [26]. Mục tiêu của kế hoạch phát triển chăn nuôi lợn của Việt Nam theo chiến lược phát triển chăn nuôi đến 2020: đàn lợn từ 29,9 triệu con năm 2010, lên 32,9 triệu con năm 2015 và lên 34,7 triệu con năm 2020. Sản lượng thịt hơi từ 3,1 triệu tấn năm 2010, lên 3,9 triệu tấn năm 2015 và 4,8 triệu tấn năm 2020; sản lượng thịt xẻ từ 2191,3 ngàn tấn năm 2010; 2794,7 ngàn tấn năm 2015 và 3493,1 ngàn tấn năm 2020. Trong đó đàn lợn nuôi công nghiệp 5,8 triệu con (chiếm 19,3%) năm 2010, lên 8,9 triệu con (chiếm 27,0%) năm 2015 và lên 12,9 triệu con (chiếm 37,0%) năm 2020. Sản phẩm thịt hơi nuôi công nghiệp từ 1135,2 ngàn tấn (chiếm 36,5%) năm 2010; 1851,5 ngàn tấn (chiếm 47,2%) năm 2015 và 2866 ngàn tấn (chiếm 59,%) năm 2020 [7]. Để đạt được những mục tiêu có tính chiến lược đó, việc đầu tư cho công tác giống, quan tâm đến vấn đề thức ăn, các chương trình quản lý; đặc biệt nhiệm vụ của công tác chăn nuôi – thú y càng nặng nề hơn, tăng cường áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật cho công tác phòng, chống dịch bệnh ở vật nuôi có hiệu quả là điều hết sức quan trọng. Một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôi lợn là dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra trên các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm giảm năng suất, giảm chất lượng con giống. Sản phẩm thịt lợn nhiễm bệnh làm tăng nguy cơ mất an toàn vệ sinh thực phẩm. Một trong những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh phó thương hàn và phù đầu do vi khuẩn Salmonella và Escherichia coli (E.coli) gây ra. Bệnh do vi khuẩn Salmonella và E.coli xảy ra ở hầu hết các loại hình chăn nuôi và gây ra thiệt hại rất lớn về kinh tế cho các nhà chăn nuôi. Việc sử dụng kháng sinh tràn lan đã dẫn đến tỷ lệ rất lớn các chủng vi khuẩn kháng lại kháng 1 sinh, do vậy việc điều trị bệnh gặp rất nhiều khó khăn. Các loại vắc-xin thú y ngoài việc bảo vệ sức khỏe cho động vật nuôi còn có tác dụng bảo vệ sức khỏe cộng đồng, bởi vì việc sử dụng vắc-xin làm giảm đi đáng kể sử dụng các loại kháng sinh và các loại kích thích tố trong chăn nuôi, dẫn đến giảm đi sự tồn đọng của chúng trong quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm cho người [59, 74]. Sử dụng vắc-xin phòng bệnh vẫn là một lựa chọn số 1 đối với các nhà chăn nuôi. Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại vắc-xin vi trùng, trong đó hai loại vắc-xin vô hoạt và vắc-xin nhược độc được sử dụng nhiều nhất. Vắc-xin vô hoạt ít hiệu quả hơn so với các loại vắc-xin sống nhược độc [35]. Những năm gần đây có rất nhiều nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắc-xin sống nhược độc. Tuy nhiên các loại vắc-xin sống nhược độc tạo ra qua tác dụng lý hóa hoặc bằng phương pháp tiếp truyền truyền thống chỉ giới hạn ở một số loại mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắc-xin nhược độc quay trở lại độc lực cao là rất lớn [52, 69]. Để khắc phục những mặt hạn chế trên, loại vắc-xin thế hệ mới ra đời, một trong số đó là vắc-xin tái tổ hợp. Quá trình tạo vắc-xin tái tổ hợp bắt đầu bằng việc tạo chủng vi khuẩn nhược độc. Sử dụng kỹ thuật gen để loại bỏ những gen gây bệnh của vi khuẩn nhưng vẫn giữ nguyên các đặc tính sinh học, sinh trưởng và phát triển như vi khuẩn ban đầu [24, 45, 63]. Sau đó tổ hợp gen biểu hiện kháng nguyên ngoại lai cùng với hệ thống khởi động được thiết kế và ghép vào chủng vi khuẩn nhược độc. Chủng này mang plasmid tái tổ hợp mang kháng nguyên ngoại lai. Vì vậy trên chủng vắc-xin mang đồng thời 2 loại kháng nguyên, kháng nguyên của vi khuẩn và kháng nguyên ngoại lai. Hiện nay, tại Việt Nam có hai loại vắc-xin phòng bệnh phó thương hàn lợn đó là vắc-xin vô hoạt và vắc-xin nhược độc. Đối với bệnh phù đầu trên lợn do E.coli gây ra, hiện nay có một số cơ sở sản xuất vắc-xin phòng bệnh phù đầu ở dạng bacterin. Đến nay, vẫn chưa có vắc-xin kép phòng hai bệnh trên. Vì vậy, để phòng cả hai bệnh trên thì phải tiêm hai mũi vắc-xin khác nhau gây stress lớn cho lợn, ảnh hưởng tốc độ tăng trưởng của lợn. Việc áp dụng những kỹ thuật tiên tiến của Mỹ để nghiên cứu chế tạo vắc-xin tái tổ hợp đa giá chất lượng cao, giá thành hạ với một 2 lần tiêm có thể phòng được nhiều bệnh là việc làm cần thiết góp phần hạn chế những thiệt hại do bệnh gây ra. Từ yêu cầu thực tế và những tìm hiểu về tình hình nghiên cứu chế tạo vắc-xin thế hệ mới đang được thực hiện tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, việc nghiên cứu tạo chủng vắc xin Salmonella choleraesuis (S.choleraesuis) nhược độc mang gen crp (cAMP receptor protein), gen asd (aspartic semialdehyde dehydrogenase) đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp mang plasmid ngoại lai của E.coli để phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn được đặt ra có ý nghĩa về khoa học và thực tiễn cao. Để góp phần đi tới đích chung nêu ra ở trên trong luận văn này tôi thực hiện các nghiên cứu ở công đoạn đầu với nội dung: ”Nghiên cứu tạo chủng vắc-xin S.choleraesuis nhược độc làm chủng vi khuẩn biến nạp”. Mục đích: Tạo được chủng vắc-xin S.choleraesuis nhược độc mang hai gen crp, asd đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp. Để đạt được những mục đích trên, các nội dung nghiên cứu bao gồm: - Tạo dòng plasmid pRE112 mang gen crp đột biến (pRE112/Δcrp). Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid pRE112/Δcrp. - Chuyển nạp plasmid pRE112/Δcrp vào chủng S.choleraesuis nhược độc gây đột biến gen crp. Kiểm tra kết quả gây đột biến gen crp. - Kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học của chủng S.choleraesuis mang gen crp đã bị đột biến (S.choleraesuis Δcrp). - Tạo dòng plasmid pRE112 mang gen asd đột biến (pRE112/Δasd). Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid pRE112/Δasd. - Chuyển nạp plasmid pRE112/Δasd vào chủng S.choleraesuis Δcrp. Kiểm tra kết quả gây đột biến gen asd. - Kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học của chủng S.choleraesuis mang hai gen crp, asd đột biến. Đối tượng nghiên cứu: chủng S.choleraesuis nhược độc (S.choleraesuis Smith) do Phân viện Thú y miền Trung cung cấp. 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN VÀ PHÙ ĐẦU LỢN 1.1.1. Bệnh phó thương hàn [80] Bệnh phó thương hàn lợn (Salmonellosis of Swine typhoid - Swine Entoritis Swine paratyphoid) là một bệnh truyền nhiễm xảy ra trên lợn ở mọi lứa tuổi, thường gặp ở lợn con đặc biệt là lợn sau cai sữa từ 2 - 4 tháng tuổi, ở lợn trưởng thành thì ít thấy. Hầu như không thấy trường hợp lợn đang bú sữa mắc bệnh (do lợn con có kháng thể truyền từ sữa mẹ). Bệnh có đặc điểm gây bại huyết, viêm dạ dày, ruột, tiêu chảy, mụn loét ở ruột già, viêm phổi, viêm gan, viêm màng não. Các đàn lợn bị nhiễm bệnh không những gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi mà còn là nguồn tàng trữ mầm bệnh gây hại đối với con người [66, 75]. 1.1.1.1. Nguyên nhân gây bệnh Bệnh phó thương hàn lợn gây ra chủ yếu do 2 loài vi khuẩn là S.choleraesuis chủng Kunzendorf gây thể cấp tính, S.typhisuis chủng Voldagsen gây thể mãn tính. Ngoài ra có các chủng khác như S.enteritidis, S.typhimurium, S.dublin. Vi khuẩn có thể tồn tại nhiều ngày, hàng tuần, thậm chí cả năm trong những điều kiện thích hợp, nhưng dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ cao và các loại hoá chất sát trùng như Glutaraldehyde, Benzalkonium chloride, Formaldehyde. Ở lợn bệnh, vi khuẩn có ở trong máu, phủ tạng, các chất tiết (nhiều nhất ở trong phân); ở lợn nái có nhiều trong dịch tiết đường sinh dục, thai bị sẩy. Những lợn khoẻ mang trùng có ý nghĩa rất quan trọng đối với lưu hành dịch bệnh và nguy cơ đối với sức khoẻ cộng đồng. Một vài yếu tố gây stress như: cai sữa, vận chuyển, thay đổi thời tiết đột ngột làm giảm sức đề kháng của heo, có thể là những nguyên nhân làm dịch bệnh bộc phát. 1.1.1.2. Triệu chứng – Bệnh tích Thời kỳ nung bệnh từ 3 - 6 ngày có khi kéo dài đến 1 tuần lễ hay 1 tháng tùy thuộc số lượng vi khuẩn xâm nhập, độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cơ thể con vật. 4 Thể cấp tính: con vật sốt cao 41,5 0 C - 42 0 C, kém ăn hoặc không ăn, không bú. Con vật táo bón, phân có màu đen có màng giả, bí đại tiện, nôn mửa, tiêu chảy, phân thối có màu vàng, da tụ máu thành từng nốt, đỏ ửng rồi chuyển thành màu tím xanh ở tai, bụng, mặt trong đùi, ngực. Bệnh thường kéo dài 2 - 4 ngày, con vật gầy còm, còi cọc, tiêu chảy nhiều rồi chết. Tỷ lệ chết có thể từ 25 - 95%, có khi bệnh chuyển sang thể mãn tính. Một số bệnh tích có thể thấy như: lá lách sưng to do dai như cao su, màu xanh thẫm; hạch lâm ba sưng, mềm, đỏ; thận có những nốt hoại tử ở vỏ thận; gan tụ máu, có nốt hoại tử; niêm mạc dạ dày và ruột viêm đỏ, có điểm xuất huyết, có khi có vết loét nhỏ như hạt đậu, hoại tử ở dạ dày (trên đỉnh các nếp nhăn), ở ruột non và từng đoạn dài biến thành khối vàng bột như cám; phổi tụ máu và có các ổ viêm. Thể mãn tính: bệnh phát ra lúc đầu không rõ triệu chứng. Con vật sốt nhẹ, gầy yếu dần, ăn uống giảm sút, chậm lớn, da xanh, trên da có những mảng đỏ hoặc xám tím bầm. Con vật tiêu chảy, phân lỏng, có màu vàng rất thối. Bệnh tiến triển trong vài tuần. Tỉ lệ chết từ 25 - 75%. Một số có thể khỏi bệnh nhưng tiêu hoá thức ăn kém, chậm lớn. Bệnh tích chủ yếu ở dạ dày và ruột. Thành ruột dày và có nhiều chỗ bị hoại tử, có bã đậu (casein hoá), xuất huyết, vết loét liền nhau thành mảng, hạch ruột xuất huyết, có khi có mủ, gan, lách sưng, mềm, có những đốm hoại tử, xoang bụng tích nước viêm. Hình 1.1: Lợn mắc bệnh gầy còm và những vết loét ở ruột già lợn mắc bệnh 5 1.1.1.3. Chẩn đoán Chẩn đoán lâm sàng Ở thể cấp tính: lợn sốt cao, chết nhanh, viêm cata dạ dày, ruột, lách sưng to, đàn hồi, dai như cao su, có màu xanh sẫm, gan sưng, có ổ hoại tử, xuất huyết ở thận, tương mạc. Ở thể mãn tính: lợn bị tiêu chảy dai dẳng, gầy còm, suy nhược, chết do kiệt sức, viêm ruột, gan, phổi. Chẩn đoán phân biệt Cần chẩn đoán phân biệt với các bệnh dịch tả lợn, tụ huyết trùng, đóng dấu… vv. Để xác định chắc chăn nguyên nhân bệnh cần thiết phải lấy mẫu để làm các xét nghiệm tại phòng thí nghiệm. 1.1.1.4. Phòng và trị bệnh Phòng bệnh Mua lợn từ nơi không có dịch, cách ly theo dõi ít nhất 10 ngày trước khi nhập đàn. Khi có lợn bệnh phải cách ly ngay để theo dõi và điều trị, kịp thời báo cho chung quanh biết để cùng nhau phòng chống dịch. Không bán chạy lợn bệnh, không mổ thịt ở ao, hồ, sông; phân và nước rửa phủ tạng phải chôn. Tiêu độc chuồng trại và dụng cụ chăn nuôi. Dùng vắc-xin phó thương hàn keo phèn tiêm liều 2ml/con, miễn dịch 6 tháng, 4 tháng tiêm lại. Kháng huyết thanh điều chế từ ngựa, tiêm liều 30, 40ml/con. Điều trị Chưa có biện pháp đìều trị có hiệu quả cao. Chỉ nên điều trị những trường hợp nhẹ, tiến triển chậm. Chloramphenicol 10%, chlotetrasone, oxycaf, biocortyl O.P.C, T.P.C, tylo P.C, tylo D.C liều: 1 – 1,5ml/10 kg thể trọng (20 mg/ kg); gentamycine: 250 mg, 2 lần/ngày; các loại sulfamid: sulfadiazin, sulmet, sulfaprim, septotryl 24% dùng 1 ml/5, 10 kg thể trọng. 6 1.1.2. Bệnh phù đầu (Edema Disease) [81] Bệnh phù đầu ở lợn được Shanks mô tả lần đầu tiên vào năm 1938 và đặc biệt phổ biến ở Châu Âu vào sau Thế chiến thứ II. Tại Việt Nam, bệnh phù đầu và tiêu chảy ở lợn con gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi; từ rất sớm các tác giả Nguyễn Thị Nội và cộng sự đã nghiên cứu về bệnh này; bệnh xảy ra ở tất cả ba miền Nam, Trung và Bắc [5]. Tại miền Nam, bệnh xảy ra ở các tình đồng bằng sông Cửu Long [4], các tỉnh phía Bắc [1, 3, 6] và các tỉnh miền Trung [6] với tỷ lệ nhiễm dao động 15,72 – 58,78% . Bệnh thường xảy ra đột ngột ở lợn con cai sữa với các dấu hiệu điển hình của bệnh sưng mí mắt, mặt phù thũng, đi lảo đảo. 1.1.2.1. Nguyên nhân gây bệnh Bệnh phù đầu lợn do vi khuẩn E.coli mang kháng nguyên bám dính F18ab và sản xuất độc tố shiga biến thể 2e (Stx2e) gây ra cho lợn con trước và sau cai sữa. Các chủng vi khuẩn E.coli này có đặc điểm gây dung huyết khi cấy trên thạch máu. Vi khuẩn E.coli dung huyết gây bệnh phù đầu thường xuyên có mặt trong đường ruột lợn với số lượng rất ít. Khi xuất hiện các yếu tố bất lợi làm giảm sức đề kháng cơ thể lợn như cai sữa, thay đổi thời tiết hoặc thức ăn, quần thể E.coli gây bệnh sẽ phát triển nhanh, lây lan gây thành dịch. Nguyễn Viết Không và cộng sự khi nghiên cứu về kháng thể kháng E.coli phù đầu ở lợn chăn nuôi công nghiệp cho thấy chỉ có 6,25% lợn con theo mẹ có kháng thể này [2]. Gần đây, khi phân tích kháng nguyên bám dính F4 và F18 trên 184 chủng E.coli phân lập từ lợn con bị phù đầu ở các tỉnh Nam Trung bộ và Tây Nguyên. Võ Thành Thìn và cộng sự tìm thấy 27/184 chủng mang kháng nguyên bám dính F18ab [9]. Cù Hữu Phú và cộng sự đã chọn một số chủng E.coli phân lập từ lợn bị bệnh phù đầu tại Hà Tây và Bình Định để sản xuất vắc-xin dưới dạng vô hoạt có bổ trợ keo phèn để phòng bệnh phù đầu [6]. Gần đây, bộ môn Vi Trùng Phân viện Thú y miền Trung cũng đã nghiên cứu chế tạo vắc-xin phòng bệnh phù đầu dưới dạng bacterin có bổ trợ keo phèn. 1.1.2.2. Triệu chứng – Bệnh tích Thường xảy ra một cách đột ngột với các triệu chứng ban đầu là bỏ ăn và rất 7 khát nước, sau đó xuất hiện các triệu chứng thần kinh như run rẩy, nằm đạp chân kiểu bơi chèo hoặc chạy quanh, liệt hoặc nằm úp trên 4 chân. Đa số lợn con sẽ chết trong vòng 24 giờ sau khi xuất hiện các triệu chứng thần kinh. Kiểm tra kỹ, thấy phù ở mí mắt, xung huyết kết mạc mắt, phù đầu. Ngoài ra còn thấy khó thở, táo bón hoặc tiêu chảy trước khi xuất hiện triệu chứng thần kinh. Đa số không thấy thân nhiệt tăng cao. 1.1.2.3. Chẩn đoán Chẩn đoán dễ dàng trên cơ sở dựa vào các đặc điểm là chỉ xảy ra sau khi cai sữa 1 – 2 tuần với các triệu chứng thần kinh, phù nề ở niêm mạc mặt và dạ dày. 1.1.2.4. Phòng và trị bệnh Phòng bệnh - Chuồng trại khô ráo, thoáng mát, định kỳ sát trùng tẩy uế chuồng trại. - Khi cai sữa nên giữ heo con ở lại chuồng và chuyển heo mẹ sang chuồng khác. Trong những ngày đầu cai sữa không cho ăn quá nhiều, giảm chất bột, đạm và tăng chất xơ trong khẩu phần. - Tiêm vaccin E.coli phòng bệnh, tiêm bắp hoặc dưới da, liều 2ml/con. Điều trị - Khi độc tố của E.coli đã nhiễm vào máu và heo đã sưng phù đầu thì việc điều trị sẽ không hiệu quả. - Thường điều trị dự phòng bằng cánh sử dụng 1 trong các loại kháng sinh sau: Sodibio, Mycofloxacine 10%, Bio+B12, Clamoxyl L.A, Multibio : 1ml/10kg thể trọng, tiêm bắp 1lần/ngày liên tục trong 3 - 5 ngày. 1.2. VẮC-XIN THÚ Y VÀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC-XIN TỪ VI KHUẨN Salmonella NHƯỢC ĐỘC 1.2.1. Vắc-xin thú y Việc phát triển vắc-xin thú y có nhiều mục đích như ngăn ngừa và kiểm soát bệnh truyền nhiễm trên động vật, bảo vệ sức khỏe cho động vật nuôi, giảm giá thành thức ăn cho vật nuôi [60, 74]. Mặt khác, khi tiêm phòng vắc-xin cho vật nuôi cũng ngăn chặn được khả năng lây lan bệnh truyền nhiễm từ động vật sang người. Ngoài ra các chương trình tiêm chủng vắc-xin đại trà cho vật nuôi, sẽ làm giảm đáng kể sử dụng thuốc thú y, dẫn đến hạn chế tác dụng phụ của thuốc thú y đối với 8 môi trường cũng như hạn chế được sự tồn đọng thuốc thú y trong động vật nuôi [60]. Tóm lại, các loại vắc-xin sử dụng trong thú y, ngoài việc cải thiện sức khỏe cho động vật nuôi còn có tác dụng nâng cao sức khỏe cộng đồng. Mặc dù các loại vắc-xin dùng trong thú y chỉ chiếm khoảng 23% trên tổng số các loại sinh phẩm bảo vệ động vật nuôi trên thị trường toàn cầu, nhưng những nghiên cứu về các loại vắc-xin ngày một tăng do việc áp dụng những tiến bộ khoa học để nghiên cứu và phát triển vắc-xin, do số lượng rất lớn các loại vi khuẩn kháng lại kháng sinh, và do sự xuất hiện các loại dịch bệnh mới. Các loại vắc-xin thú y ngoài việc bảo vệ sức khỏe cho động vật nuôi còn có tác dụng bảo vệ sức khỏe cộng đồng, bởi vì việc sử dụng vắc-xin làm giảm đi đáng kể sử dụng các loại kháng sinh và các loại kích thích tố trong chăn nuôi, dẫn đến giảm đi sự tồn đọng của chúng trong quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm cho người. Điều này sẽ thúc đẩy làm tăng các hoạt động của cơ quan soạn thảo luật nhằm bảo vệ quyền lợi của người tiêu dùng thực phẩm tại thị trường lớn như Mỹ và liên minh Châu Âu [68]. Các loại vắc-xin thú y được cấp phép sử dụng bao gồm các loại vắc-xin vô hoạt và vắc-xin sống nhược độc. Mặc dù các loại vắc-xin này đã và đang được sử dụng rộng rãi và góp phần đáng kể bảo vệ sức khỏe cho vật nuôi cũng như cộng đồng trên toàn cầu, nhưng vẫn còn một số hạn chế nhất định. Các loại vắc-xin truyền thống thường giá thành sản xuất cao, đòi hỏi phải có chất bổ trợ và phải tiêm chủng nhiều lần mới tạo được miễn dịch tốt, hơn nữa các loại vắc-xin này có thể ảnh hưởng đến việc tạo kháng thể trên gia súc mẹ dẫn tới khả năng bảo hộ thấp hoặc không có khả năng bảo hộ đối với gia súc non [20, 60]. Các loại vắc-xin độc tố có thể tạo miễn dịch dịch thể tốt, tuy nhiên không có tác dụng hoặc tác dụng ít trong việc tạo miễn dịch trung gian tế bào. Các loại vắc-xin vô hoạt toàn khuẩn thường chứa cơ chất kháng nguyên và không kháng nguyên, các đáp ứng miễn dịch chống lại cơ chất không kháng nguyên hoàn toàn trái ngược với sự ngăn chặn nhiễm trùng và có thể làm ảnh hưởng hoặc làm giảm đáp ứng miễn dịch đối với cơ chất kháng nguyên. Chúng có thể tạo ra phản ứng phụ có hại do các cơ chất ngoài mong muốn như các loại nội độc tố [75]. Các loại vắc-xin sống nhược độc có khả năng tạo ra hai 9 loại miễn dịch, miễn dịch dịch thể và miễn dịch trung gian tế bào. Những năm gần đây có rất nhiều nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắc- xin sống nhược độc. Tuy nhiên các loại vắc-xin sống nhược độc chỉ giới hạn ở một số loại mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắc-xin nhược độc quay trở lại độc lực cao là rất lớn [53, 70]. Để khắc phục những nhược điểm của các loại vắc-xin trên, vắc-xin thế hệ mới ra đời dựa trên kỹ thuật gen, một trong số đó là vắc-xin tái tổ hợp. Có nhiều đối tượng vi sinh vật có thể sử dụng làm chủng vi khuẩn biến nạp trong vắc-xin tái tổ hợp như vi khuẩn Salmonella, vi khuẩn Lao, E.coli, hoặc một số loại virus như virus đậu, virus adeno, Ưu thế của vắc-xin tái tổ hợp sử dụng vi khuẩn Salmonella là dễ dàng thao tác, dễ sử dụng, dễ nhân lên và dễ phân phối kháng nguyên cho cơ thể. Việc nuôi cấy chủng vi khuẩn tái tổ hợp không phức tạp do đó đảm bảo việc tiếp giống, nhân giống và sản xuất vắc-xin để ứng dụng. Salmonella hiện đang được sử dụng làm chủng vi khuẩn biến nạp mang các loại gen kháng nguyên của virus cúm, HBV, virus sốt xuất huyết, vi khuẩn gây bệnh đường ruột, vi khuẩn tả, liên cầu khuẩn, ký sinh trùng sốt rét, 1.2.2. Một số nghiên cứu sản xuất vắc-xin từ vi khuẩn Salmonella nhược độc Các chủng vi khuẩn Salmonella nhược độc đầu tiên được sử dụng làm vắc-xin phòng các bệnh do vi khuẩn Salmonella gây trên người và động vật [33, 34]. Hiện nay, việc sử dụng các chủng Salmonella nhược độc mang một số gen đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp mang các plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên ngoại lai để tạo thành các chủng sản xuất vắc-xin phòng nhiều bệnh đang là hướng nghiên cứu thu hút nhiều sự tham gia của các nhà khoa học [24, 45, 55]. Những vắc-xin tái tổ hợp này tạo miễn dịch do các kháng nguyên ngoại lai đồng thời tạo miễn dịch do các kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella. Các chủng vắc-xin Salmonella đã được loại bỏ gen asd nhưng mang plasmid asd+ tái tổ hợp đã chủng hóa các gen kháng nguyên ngoại lai nên mang trên mình đồng thời hai hoại kháng nguyên đó là kháng nguyên của Salmonella và kháng nguyên ngoại lai [31, 53]. 10 [...]... vào chủng Salmonella nhược độc Chủng này tiếp nhận gen kháng nguyên tạo thành chủng vi khuẩn tái tổ hợp Chủng vi khuẩn tái tổ hợp được nuôi cấy và tạo vắc-xin Trong những thập kỷ qua, một loạt chủng S.choleraesuis sống giảm độc lực đột biến đã được phát triển để sản xuất vắc-xin Chúng bao gồm các chủng có đột biến trong các gen tham gia vào tổng hợp purine (pur), tổng hợp thymidine (thy), the cAMP-reception... dụng đột biến gen asd như một điểm lựa chọn vị trí đánh dấu kháng kháng sinh [31] Như vậy, có thể nói S.choleraesuis đột biến ở gen crp và asd có nhiều suy giảm trong tính độc hại Vì vậy, chúng tôi nghiên cứu tạo ra chủng vắc-xin S.choleraesuis nhược độc mang hai gen crp, asd đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp 1.5 PLASMID SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT TẠO DÒNG Các plasmid sử dụng trong kỹ thuật tạo dòng... Salmonella typhimurium làm vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa gen của kháng nguyên protein bề mặt A của Streptococcus pneumoniae gây bệnh vi m phổi, vi m màng não trên người; khi thử nghiệm trên chuột, vắc-xin có tác dụng tạo miễn dịch tốt [70] Branger và cộng sự khi nghiên cứu vắc-xin tái tổ hợp phòng bệnh do Yersinia gây ra trên người, chủng vi khuẩn vắc-xin nhược độc Salmonella typhimurium... Campylobacter làm vắc-xin phòng bệnh do Campylobacter jejuni gây ra trên gia cầm [13] Zekarias và cộng sự đã dùng chủng Salmonella typhimurium nhược độc làm vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa gen Alpha tốc xin của Clostridium perfingens làm vắc-xin phòng bệnh vi m ruột hoại tử trên gà Gà tiêm vắc-xin được bảo hộ tốt khi công cường độc với chủng Clostridium perfringens cường độc [76] Tương... [16] 1.2.3 Vắc-xin phòng bệnh phó thương hàn và phù đầu ở lợn Hiện nay, tại Vi t nam có hai loại vắc-xin phòng bệnh phó thương hàn lợn đó là vắc-xin vô hoạt và vắc-xin nhược độc Vắc-xin Phó thương hàn vô hoạt được sản xuất dưới dạng nước có bổ sung các chất bổ trợ làm tăng cường và kéo dài khả năng miễn dịch Vắc-xin nhược độc được sản xuất dạng đông khô kết hợp với Pasteurella Mutocida nhược độc phòng... sự nghiên cứu vắc-xin tái tổ hợp phòng bệnh đốm trắng trên tôm trong đó kháng nguyên protein vỏ V28 được dòng 11 hóa trên plasmid pcADN3,1-VP28 và biến nạp vào chủng Salmonella nhược độc SV4089; vắc-xin có tác dụng bảo hộ cao trên tôm [54] Plasmid tái tổ hợp mang gen ngoại lai đã được chứng minh là ổn định trong tế bào chủ trong điều kiện invitro Garmory và cộng sự khi nghiên cứu về các chủng vắc-xin. .. cao khi thử nghiệm trên chuột [78] Các chủng vắc-xin Salmonella nhược độc không những là tế bào chủ mang các plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên vi khuẩn mà còn là vật mang cho các plasmid tái tổ hợp dòng hóa các kháng nguyên vi rút và ký sinh trùng Benitez và cộng sự đã sử dụng chủng vắc-xin Salmonella typhimurium nhược độc SL3261 làm vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa... ở lợn tại Phân vi n Thú y miền Trung Địa điểm: Phân vi n Thú y miền Trung – Nha Trang – Khánh Hòa Thời gian nghiên cứu: từ tháng 01/2011 – tháng 01/2012 2.2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ DÙNG CHO NGHIÊN CỨU 2.2.1 Chủng vi sinh vật + Chủng S.choleraesuis Smith là chủng nhược độc đang được sử dụng để sản xuất vắc-xin phòng bệnh phó thương hàn ở lợn tại Phân vi n Thú y miền Trung + Tế bào khả biến E.coli JM109,...Gần đây, có rất nhiều nghiên cứu sử dụng các chủng vắc-xin Salmonella nhược độc làm vi khuẩn biến nạp mang các plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên ngoại lai phòng các bệnh do Salmonella cũng như các bệnh do các kháng nguyên ngoại lai gây ra cho người và động vật Bucley và cộng sự sử dụng chủng Salmonella typhimurium DeltaaroA nhược độc làm tế bào chủ mang plasmid tái tổ hợp... typhimurium được sử dụng làm tế bào chủ mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các gen kháng nguyên Lcrv và Lcrv196 [16] Zhao và cộng sự khi nghiên cứu thử nghiệm vắc-xin phòng bệnh sảy thai truyền nhiễm, các tác giả này đã dòng hóa các gen kháng nguyên protein L7/L12 của vi khuẩn Brucella trên plasmid plasmid và biến nạp vào chủng vắc-xin nhược độc Salmonella typhirmurium; vắc-xin có hiệu lực cao khi . trong luận văn này tôi thực hiện các nghiên cứu ở công đoạn đầu với nội dung: Nghiên cứu tạo chủng vắc-xin S. choleraesuis nhược độc làm chủng vi khuẩn biến nạp . Mục đích: Tạo được chủng vắc-xin. vi sinh vật có thể s dụng làm chủng vi khuẩn biến nạp trong vắc-xin tái tổ hợp như vi khuẩn Salmonella, vi khuẩn Lao, E.coli, hoặc một s loại virus như virus đậu, virus adeno, Ưu thế của vắc-xin. giới, vi c nghiên cứu tạo chủng vắc xin Salmonella choleraesuis (S. choleraesuis) nhược độc mang gen crp (cAMP receptor protein), gen asd (aspartic semialdehyde dehydrogenase) đột biến làm chủng vi