M pRE112 Δcrp 4 Pr12 Pr34 Δcrp
3.4.2.Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Δasd
Đoạn gen Pa12, Pa34 và plasmid pBSIIK+ sau khi thực hiện phản ứng phân cắt tương ứng bằng enzyme BamHI/XbaI và BamHI/KpnI lần lượt được đưa vào plasmid pBSIIK+ tại các vị trí nhận biết của enzyme giới hạn BamHI/XbaI và
BamHI/KpnI để tạo được gen asd đột biến mất đoạn so với gen asd ban đầu của chủng S.choleraesuis Smith.
Phổ điện di kiểm tra sản phẩm cắt ADN plasmid của các dòng bằng enzyme giới hạn BamHI/XbaI (hình 3.11A) có 2 dòng xuất hiện 2 băng: băng 1 tương đương với kích thước của plasmid pBSIIK+ (3kb) và 1 băng tương đương với kích thước đoạn gen Pa12 (2kb). Điều này cho thấy chúng tôi đã tạo thành công plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Pa12.
Hình 3.12: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt 6 dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Pa12 với BamHI/XbaI (A) và 6 dòng pBSIIK(+)/Δasd
với BamHI/KpnI (B)
Tiếp theo dòng E.coli mang pBSIIK+/Pa12 được sử dụng để tách chiết ADN plasmid làm nguyên liệu cho thí nghiệm tạo dòng plasmid tái tổ hợp mang 2 gen Pa12 và Pa34. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt ADN plasmid của 6 dòng tái tổ hơp pBSIIK+/Pa12/Pa34 được sàng lọc (hình 3.11B) đều thấy xuất hiện 2 băng, băng 1 có kích thước tương ứng kích thước pBSIIK+/Pa12 và 1 băng có kích thước
1 2 3 4 5 6 Pa34 Pa34 pBSIIK+/Pa12 pBSIIK+ Pa12 A B
tương ứng kích thước Pa34. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã thực hiện được việc tạo plasmid pBSIIK+/Δasd.
3.4.3. TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP pRE112/Δasd
Không giống như tạo plasmid pRE112/Δcrp, gen Δcrp từ pBSIIK+/Δcrp được khuếch đại bằng phản ứng PCR. Gen Δasd từ pBSIIK+/Δasd được chúng tôi tách ra bằng enzyme cắt giới hạn giống như những nghiên cứu trước [25, 63, 71, 79]. Để thu được gen Δasd chúng tôi tiến hành tách chiết lượng lớn (200µl) ADN plasmid pBSIIK+/Δasd của dòng mang pBSIIK+/Δasd cắt với enzyme giới hạn XbaI/KpnI làm nguyên liệu cho thí nghiệm tạo dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/Δasd.
Hình 3.13: Điện di sản phẩm cắt pBSIIK+/Δasd bằng cặp enzyme XbaI-KpnI
Đoạn gen Δasd có kích thước xấp xỉ 4kb sẽ ở phía trên đối với đoạn gen pBSIIK+ (kích thước 3kb). Do đó chúng tôi sẽ cắt, tách chiết và tinh sạch phần ADN ở phía trên.
Đoạn gen Δasd sau khi được tinh sạch, thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme
XbaI/KpnI được đem lai với plasmid pRE112 và biến nạp vào tế bào E.coli χ7213 khả biến, sàng lọc trên môi trường LB chứa Cm 30 µg/ml và DAP 50µg/ml. Cắt kiểm tra 3 dòng được sàng lọc bằng cặp enzyme XbaI/KpnI.
Kết quả cho thấy cả 3 dòng đều xuất hiện 2 băng phù hợp với kích thước plasmid pRE112 và Δasd. Kết quả, chứng tỏ chúng tôi đã tạo thành công plasmid tái tổ hợp pRE112/Δasd. M asd pRE112 1 2 3 pRE112 Δasd M Δasd (Pa1234) pBSIIK+
Hình 3.14: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt của 3 dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/Δasd bằng cặp enzyme XbaI/KpnI