M pRE112 Δcrp 4 Pr12 Pr34 Δcrp
3.3.6.Kiểm tra tính ổn định của gen Δcrp trong chủng S.choleraesuis
Genome của chủng S.choleraesuis 539 tại các đời 1, 5, 10, 15, 20 được tiến hành tách chiết, PCR với cặp mồi Pr5F-Pr6R, Pr7F-Pr6R kiểm tra tính ổn định của gen crp đột biến đã cài vào được trước đó.
1 5 10 15 20 M 1 5 10 15 20 M 1 5 10 15 20 1500bp 500bp 1 2 3 4 5 M 1 2 3 4 5
Hình 3.10: Sản phẩm PCR từ genome của S.choleraesuis 539 các đời 1, 5, 10, 15, 20 với cặp mồi Pr5F-Pr6R (trắng), và Pr7F-Pr6R (trắng)
Kết quả cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi Pr5F-Pr6R thu được từ genome của chủng S.choleraesuis 539 tại tất cả các đời đều có kích thước khoảng 600bp, với cặp mồi Pr7F-Pr6R sản phẩm có kích thước khoảng 1400 bp. Điều đó chứng tỏ gen Δcrp ổn định trong genome của chủng S.choleraesuis 539 đã chọn lọc được.
Tất cả những kiểm tra trên, chứng tỏ chúng tôi đã tạo thành công chủng
S.choleraesuis 539 có gen crp đột biến. Chủng S.choleraesuis 539 đã được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu và giải trình tự gen cho thấy sự xuất hiện của gen crp mất 322bp so với gen crp chủng gốc gen crp. Các thí nghiệm kiểm tra đặc tính sinh vật hoá học cho thấy, đột biến gen crp ở chủng S.choleraesuis 539 không làm thay đổi hình thái khuẩn lạc cũng như kiểu kháng nguyên O, H của tế bào S.choleraesuis. Tuy nhiên, chủng S.choleraesuis 539 có kích thước khuẩn lạc nhỏ hơn, sinh trưởng chậm hơn, và mất khả năng lên men hầu hết các đường, trừ glucose so với chủng S.choleraesuis Smith. Những thay đổi này được cho là đều liên quan đến đột biến gen crp vì gen này có vai trò chính trong việc điểu khiển các quá trình trao đổi năng lượng của tế bào [21, 24, 44] và hoàn toàn phù hợp với nhiều kết quả nghiên cứu trước đây khi gây đột biến gen crp [25, 71].
Kiểm tra qua các đời cấy chuyển cho thấy tính ổn định của gen Δcrp
trong chủng S.choleraesuis 539. Từ các kết quả thu được, chúng tôi khẳng định gen crp đã được gây đột biến trong chủng S.choleraesuis 539 và có tính ổn định. Vì vậy,
chúng tôi tiếp tục sử dụng chủng này để thực hiện thí nghiệm tạo chủng
S.choleraesuis nhược độc mang đồng thời hai gen crp, asd đột biến.