M pRE112 Δcrp 4 Pr12 Pr34 Δcrp
3.5.TẠO CHỦNG S.choleraesuis 539 MANG GEN ASD ĐỘT BIẾN
Chúng tôi cũng sử dụng phương pháp tiếp hợp để chuyển gen Δasd từ plasmid pRE112/Δasd vào chủng S.choleraesuis 539.
Chủng E.coli χ7213/pRE112/Δasd-1 được lựa chọn làm chủng cho sẽ được tiếp hợp với chủng nhận là S.choleraesuis 539. Kết quả có khoảng 100-300 khuẩn lạc trên mỗi đĩa và không xuất hiện khuẩn lạc trên các đĩa đối chứng cấy từng chủng riêng rẽ. Kết quả này cho thấy quá trình tiếp hợp đã diễn ra.
Hình 3.15. Hình khuẩn lạc chủng S.choleraesuis 539sau khi tiếp hợp với chủng E.coli χ7213/pRE112/Δasd-1 trên môi trường chọn lọc
tinh sạch trên môi trường LB chứa Cm. Chọn khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa cấy tinh sạch, cấy vào môi trường lỏng NB không kháng sinh có bổ sung DAP để diễn ra quá trình trao đổi chéo giữa gen asd đột biến và gen asd gốc, nuôi trong 6 giờ, pha loãng đến 10-5 và cấy trải lên môi trường NA chứa DAP, không kháng sinh có chứa và không chứa sucrose 5% để chọn lọc những khuẩn lạc có khả năng sinh trưởng trên môi trường có chứa sucrose.
Sàng lọc những dòng kháng sucrose trên môi trường LB chứa DAP chứa và không chứa Cm, sau đó sàng lọc trên môi trường LB có chứa và không chứa DAP để loại bỏ những dòng kháng Sucrose do gen sacB1 bị đột biến. Do đột biến ở gen asd nên trong môi trường nuôi cấy bắt buộc phải bổ sung DAP [30, 31, 53]
Cuối cùng các chủng chọn lọc được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi Pa5F-Pa6R và Pa6R-Pa7F.
Hình 3.16: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của các chủng
S.choleraesuis với cặp mồi Pa5F-Pa6R (A) và Pa6R-Pa7F (B)
Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR cho thấy gen asd của các chủng
S.choleraesuis chọn lọc đều bị mất đi một đoạn gen khoảng 1500 bp so với chủng
S.choleraesuis Smith, phù hợp với những nghiên cứu trước [30, 31, 79]. Điều này chứng tỏ, chúng tôi đã gây đột biến thành công gen asd trên chủng S.choleraesuis
539. Chúng tôi chọn lựa 1 chủng trong số các chủng gây đột biến thành công trên và
M asd 539 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 539 asd 1 2 3 4 5 6 7 8 9500bp 500bp 500bp 1500bp 1500bp A B
kí hiệu là S.choleraesuis 179 để kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học và giải trình tự gen.