ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
2.3.8.Phương pháp tiếp hợp của Kang và cộng sự [42]
Nuôi qua đêm chủng cho và chủng nhận ở điều kiện 370C, tốc độ lắc 200 vòng/phút.
Dịch vi khuẩn được ly tâm với tốc độ 4500 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi.
Rửa cặn tế bào bằng dung dịch đệm PBS, ly tâm 4500 vòng/phút trong 5 phút, lặp lại 2 lần. Sau đó dùng PBS để điều chỉnh OD (600nm) của dịch vi khuẩn đạt khoảng 0,8.
Trộn chủng cho và chủng nhận theo tỷ lệ thể tích 1:1.
Tiếp theo nhỏ 100 µl hỗn dịch lên màng lai (nitrocellulose – 0,45 µm) được đặt sẵn trên môi trường chọn lọc, đồng thời sinh khối mỗi chủng vi khuẩn này được nhỏ trên hai màng lai khác để làm mẫu đối chứng. Ủ qua đêm ở 370C.
Sau khi ủ qua đêm để quá trình sinh trưởng và tiếp hợp xảy ra giữa hai chủng, các màng lai này được tráng rửa với đệm PBS để thu tế bào và cấy trải lên môi trường chọn lọc LB chứa kháng sinh chọn lọc để chỉ cho phép những tế bào tiếp hợp mọc trên môi trường.
thu được các khuẩn lạc riêng rẽ trước khi nuôi trong môi trường NB. Sau khoảng 6h nuôi cấy lắc, dịch nuôi được đem pha loãng đến 10-5 và cấy lên các đĩa môi trường LB chứa và không chứa đường sucrose 5% để chọn lọc những dòng vi khuẩn kháng sucrose. Những dòng kháng sucrose này được tiếp tục cấy sàng lọc trên các đĩa môi trường LB chứa và không chứa Cm để loại bỏ những dòng kháng sucrose do gen SacB1 bị đột biến. Cuối cùng, các dòng chọn lọc được kiểm tra bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu.