M pRE112 Δcrp 4 Pr12 Pr34 Δcrp
3.2.TẠO CHỦNG S.choleraesuis Smith MANG GEN CRP ĐỘT BIẾN
Sau khi tạo được plasmid tái tổ hợp pRE112 mang gen crp đột biến, chúng tôi tiếp tục thực hiện chuyển gen Δcrp từ pRE112/Δcrp vào S.choleraesuis Smith. Bằng phương pháp tiếp hợp chuyển gen Δcrp trong plasmid tái tổ hợp pRE112/Δcrp từ chủng E.coli χ7213 mang tái tổ hợp pRE112/Δcrp (E.coli χ7213/pRE112/Δcrp) vào
S.choleraesuis Smith, trình tự gen tương đồng giữa đoạn gen Δcrp trong plasmid và đoạn gen crp của S.choleraesuis Smith cho phép quá trình trao đổi chéo để đưa gen Δcrp vào hệ gen của S.choleraesuis Smith xảy ra.
Thực hiện thí nghiệm tiếp hợp với chủng cho là chủng E.coli
χ7213/pRE112/Δcrp và chủng nhận là chủng S.choleraesuis Smith, nhỏ lên màng lai 0,45 µm đã được đặt sẵn trên môi trường LB chứa DAP. Sau khi ủ qua đêm ở 370C, thu sinh khối tế bào, hoàn nguyên bằng đệm PBS và cấy trang 100 µl lên môi trường chọn lọc LB chứa Cm (theo 2.3.8).
Trên các đĩa môi trường chọn lọc LB chứa Cm nuôi ủ hỗn hợp tế bào
S.choleraesuis Smith và E.coli χ7213/pRE112/Δcrp sau quá trình tiếp hợp, xuất hiện các khuẩn lạc với mật độ khá dày (khoảng trên 300 khuẩn lạc) (hình 3.5), trong khi hai đĩa đối chứng không xuất hiện khuẩn lạc nào. Phản ứng PCR với cặp mồi Pi1F-Pi2R đặc hiệu đã giúp chúng tôi khẳng định các khuẩn lạc đó là S.choleraesuis. Như vậy, quá trình tiếp hợp chuyển plasmid pRE112/crp vào S.choleraesuis Smith đã thực sự xảy ra.
Hình 3.5: Các khuẩn lạc S.choleraesuis Smith sau khi tiếp hợp với E.coli
χ7213/pRE112/Δcrp mọc trên môi trường chọn lọc LB chứa Cm
bằng phương pháp tiếp hợp diễn ra dễ dàng hơn so với phương pháp sử dụng máy xung điện mà tác giả Edward và cộng sự đã thực hiện trong nghiên cứu của mình với tỷ lệ 100µg ADN mới cho được 8 khuẩn lạc có thể mang plasmid cần chuyển [29]. Tuy nhiên, tần suất để đoạn gen Δcrp từ pRE112 có thể gắn vào hệ gen thay thế gen crp ban đầu thì thực sự thấp. Với hơn 1200 khuẩn lạc qua sàng lọc, sau thí nghiệm kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi Pr5F-Pr6R và Pr7F-Pr6R chúng tôi chỉ thu được 1 chủng S.choleraesuis duy nhất mang gen crp đột biến và kí hiệu là S.choleraesuis 539.
Hình 3.6: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của S.choleraesuis
539 (1), S.choleraesuis Smith (2), plasmid của χ7213/pRE112/Δcrp (3) với cặpmồi Pr5F-Pr6R (A) và Pr6R-Pr7F (B) mồi Pr5F-Pr6R (A) và Pr6R-Pr7F (B)
Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi Pr5F-Pr6R (hình 3.6A) cho thấy, đoạn gen crp của chủng S.choleraesuis 539 có kích thước khoảng 600bp bằng với kích thước của đoạn gen crp của chủng χ7213/pRE112/Δcrp, trong khi đó đoạn gen crp của chủng S.choleraesuis Smith có kích thước khoảng 910bp.
Với cặp mồi Pr7F-Pr6R (hình 3.6B), đoạn gen crp của chủng
S.choleraesuis 539 có kích thước khoảng 1400bp, đoạn gen crp của chủng
S.choleraesuis Smith có kích thước khoảng 1700bp. Như vậy, đoạn gen crp của chủng S.choleraesuis 539 bị mất đi một đoạn gen khoảng 300bp so với chủng
S.choleraesuis Smith. Kết quả này tương đương với kết quả ở tài liệu mà chúng tôi tham khảo [25, 79]. Điều này chứng tỏ, chúng tôi đã gây đột biến thành
M 1 2 31500bp 1500bp 500bp M 1 2 1500bp A B
công gen crp ở chủng S.choleraesuis 539.
Ngoài ra, chúng tôi cũng nhận thấy rằng gen SacB1 trong pRE112 sử dụng để nhận biết sự loại bỏ của plasmid khỏi tế bào có tần suất đột biến rất cao mặc dù đã được chúng tôi hạn chế bằng cách sử dụng môi trường NA cho các lần cấy chuyển tế bào. Điều này đã được nhiều nghiên cứu trước đây khẳng định [29], nên thí nghiệm sàng lọc lại các khuẩn lạc kháng sucrose dựa vào gen Cmr đã được thực hiện để loại bỏ những chủng kháng sucrose do gen này bị đột biến. Kết quả thu được cho thấy, từ khoảng hơn 600 khuẩn lạc mọc trên môi trường sucrose 5% chúng tôi chỉ sàng lọc được 9-10 khuẩn lạc thực sự kháng sucrose, tức là tỷ lệ đột biến của gen SacB1 lên đến 98%. Kết quả này khẳng định một lần nữa thí nghiệm sàng lọc lại bằng gen kháng kháng sinh sau bước sàng lọc dựa vào gen SacB1 là hoàn toàn cần thiết trong các thí nghiệm trao đổi gen sử dụng các suicide plasmid với hệ gen sàng lọc này.