báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương

báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương báo cáo thí nghiệm vi sinh học đại cương

Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT

A Môi trường dinh dưỡng

I Khái niệm chung

1 Mục đích, ý nghĩa:

- Môi trường dinh dưỡng có ý nghĩa đối với sự bảo tồn và phát triển nòi giống của vi sinh vật Môi trường dinh dưỡng được sử dụng trong khâu phân lập, nhân giống, giữ giống và nghiên cứu các hoạt động sinh hóa của vi sinh vật

2 Yêu cầu đối với môi trường dinh dưỡng:

- Môi trường dinh dưỡng là một hỗn hợp thức ăn cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật Trong thành phần của môi trường dinh dưỡng cần phải có các nguyên tố tạo chất sống (Cacbon, Hydro, Oxi, Nitơ), các nguyên tố đa lượng (Phốt pho, Lưu Huỳnh, Kali, Canxi, Magie, Sắt, ), một vài nguyên tố vi lượng (Mangan, Đồng, Natri, Clo, Kẽm, Bor, Molipden, ) Những nguyên

tố trên cần thiết phải ở dạng những hợp chất dễ hấp thu đối với vi sinh vật Cacbon được các vi sinh vật dị dưỡng hấp thu dễ hơn cả ở dạng glucoza Ngoài glucoza, vi sinh vật dị dưỡng còn hấp thu đường, rượu, axit hữu cơ và các hợp chất khác Nguồn Nitơ có thể là các chất đạm, pepton, axit amin, muối amon, nitrat Các nguyên tố còn lại dưới dạng muối Môi trường dinh dưỡng còn cần phải có đủ các chất kích thích sinh trưởng như biotin, vitamin, đặc biệt là các axit amin không thay thế

- Môi trường dinh dưỡng cần phải cân đối về thành phần (đẳng trương về nồng độ các chất hòa tan) và có độ ẩm, độ nhớt, pH, áp suất thẩm thấu tối ưu

- Môi trường dinh dưỡng cần phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng

3 Cách gọi tên

Môi trường dinh dưỡng thường được gọi tên theo tên tác giả - người phát hiện ra nó Thí dụ: Môi trường Sapek, Saburo, Song đúng hơn là gọi tên theo nguồn thức ăn N và C Thí dụ môi trường thạch thịt – pepton, môi trường Xenlluloza

II Phân loại môi trường

1 Phân loại môi trường theo thành phần: Căn cứ vào thành phần môi trường, người

ta chia chúng thành các loại sau

a Môi trường tự nhiên được chế tạo từ các sản phẩm có nguồn gốc động, thực vật như thịt, trứng, sữa, nước chiết nấm men, nước quả, mạch nha, Thành phần hóa học của những môi trường này phức tạp và không được xác định cụ thể Nó phụ thuộc vào thành phần nguyên liệu

và các điều kiện tiến hành chế tạo môi trường Người ta sử dụng chúng để nuôi cấy vi sinh vật, tích lũy sinh khối, giữ các giống thuần sạch, các mục đích dự đoán, chúng không lợi cho việc nghiên cứu sinh lý hoặc các quá trình trao đổi chất

b Môi trường tống hợp được chế tạo từ các hợp chất hóa học hữu cơ và vô cơ với nồng

độ định trước một cách chính xác Tùy theo bộ các cấu tử, môi trường tông hợp có thể phức tạp (môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic) hay tương đối đơn giản (môi trường cho các vi khuẩn tự dưỡng) Người ta dùng chủng để nghiên cứu sự trao đổi chất, quy luật phát triển hay sinh tổng hợp một chất nào đó (VD: axit amin) Trong thực hành thường sử dụng môi trường tổng hợp Sapek để nuôi cấy nấm mốc

c Môi trường bán tổng hợp là môi trường chung giữa hai loại trên

2 Phân loại theo mục đích sử dụng

a Môi trường phổ dụng (môi trường cơ sở hay môi trường chuẩn) là những môi trường thích hợp để nuôi cấy nhiều loại vi sinh vật (VD: môi trường thịt pepton, môi trường nước mạch nha, )

b Môi trường riêng biệt hay môi trường chọn lọc: đảm bảo sự phát triển ưu thế của một loài hay một nhóm vi sinh vật nào đó, ít thuận lợi hoặc hoàn toàn bất lợi đối với sự phát triển của các vi sinh vật khác Các môi trường chọn lọc chủ yếu được dùng để phân lập vi sinh vật từ các môi trường sinh sống tự nhiên của chúng hoặc được dùng để nuôi cấy tích lũy VD: môi trường tinh bột – ammoniac dùng để nuôi cấy xạ khuẩn

c Môi trường chuẩn đoán phân biệt (môi trường chỉ thị) cho phép phân biệt khá nhanh chóng một loài vi sinh vật này với loài khác và xác định những giống thuần khiết trên cơ sở nghiên cứu những tính chất sinh hóa của chúng Các môi trường chỉ thị được ứng dụng trong vi khuẩn học lâm sàng, trong nghiên cứu di truyền học và trong việc định tên vi sinh vật Thông thường trong các môi trường này người ta cho vào một số thành phần chỉ thị màu và nhờ sự thay đổi của chất đó mà người ta có thể xác định được từng loài vi sinh vật

VD: Trong quá trình sống, vi sinh vật thường tiết ra một loại enzyme nhất định Dưới tác dụng của các enzyme này các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong môi trường bị phân hủy thành các dạng đơn giản hơn như axit và muối của chúng Các chất này làm thay đổi độ pH của môi trường, do đó dẫn đến sự thay đổi màu của chất chỉ thị màu

3 Phân loại theo tính chất lý học

Tùy theo độ chắc cứng của môi trường người ta phân biệt môi trường lỏng, đặc, xốp

a Môi trường lỏng là môi trường thức ăn dưới dạng dung dịch Nó được ứng dụng để phát hiện các đặc điểm sinh lý – sinh hóa của vi sinh vật, để tích lũy sinh khối hoặc các sản phẩm trao đổi chất, để giữ và bảo quản nhiều loại vi sinh vật không phát triển trên các môi trường đặc

b Môi trường đặc là môi trường lỏng có thêm các chất đông dính, được ứng dụng để tách các giống thuần khiết (nhận từng khuẩn lạc riêng biệt, nghiên cứu định tên, xác định hình thái khuẩn lạc, đặc điểm sinh trưởng), để giữ giống

Để làm đông môi trường người ta dụng thạch, gelatine và silica-gel Các chất này không làm thay đổi thành phần môi trường, đồng thời đảm bảo độ trong suet của môi trường

- Thạch là một loại polysaccarit phức tạp có độ bền vững cao, nhận từ một số loại tảo biển

hộ Floridae Hầu hết vi sinh vật không sử dụng nó làm cơ chất dinh dưỡng Trong nước, thạch tạo thành dạng gel, chảy ở 100OC và đông ở gần 40OC Thạch có tính trung tính, không làm thay đổi pH của môi trường song nó bị ảnh hưởng pH môi trường ở những môi trường có độ axit

pH thấp thạch khó đông đặc hơn hơn bởi nó bị thủy phân từng phần Thạch thường được bổ sung vào môi trường với số lượng 1,5 – 2% Trong trường hợp cần thiết có thể nâng nồng độ thạch lên 3%

- Gelatin là loại protein nhận được khi ninh xương và sụn của động vật dễ bị vi sinh vật sử dụng nên dễ vữa hơn so với thạch Mặt khác gelatine dễ làm ảnh hưởng tới pH môi trường nên ít được sử dụng hơn thạch, Nhiệt độ nóng chảy của gelatine 25-27OC và đông đặc ở 18-20OC Thường để thu nhận những khuẩn lạc lớn trong phân loại nấm men

- Bản silica-gel được dùng làm chất nền đặc cho các môi trường tổng hợp có thành phần xác định chặt chẽ bởi vì nó có bản chất vô cơ

- Môi trường xốp được ứng dụng trong vi sinh vật học công nghiệp Thuộc loại này có kê nấu nhừ, cám, cát thạch anh thấm dung dịch dinh dưỡng

III Cách làm môi trường

Quá trình tiến hành gồm các bước sau:

1 Pha chế

Cân đong chính xác theo đơn

Cho vào bình sạch đã sấy khô 1/3 lượng nước cần thiết, hòa tan trước các chất có khối lượng nhỏ hơn các chất có khối lượng lớn hơn rồi sau cùng là các chất đông dính Thử pH môi trường

Dùng lượng nước còn lại tráng rửa cổ bình, phễu, Thể tích môi trường phải nhỏ hơn 1/2 thể tích bình

Đóng miệng bình bằng nút bông rồi bọc giấy để tránh bị ướt lúc thanh trùng

Dán nhãn, ghi tên lên môi trường, pH, ngày và người chuẩn bị

Thanh trùng xong kiểm tra pH và chỉnh lại nếu cân bằng NaOH 20% hoặc HCL 20% Dùng nước máy, ấm

3 Phân phối môi trường

Môi trường được phân phối vào bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm, sau thanh trùng vào ống nghiệm hoặc hộp petri

b Phương pháp Tinđan

Tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ cao liên tục trong 3-4 ngày liền, mỗi ngày một lần, mỗi lần cách nhau 24 giờ Trong thời gian giữa hai lần hấp cần để môi trường ở nhiệt độ thích hợp cho các bào tử còn sống sót có thể phát triển thành dàng tế bào dinh dưỡng Trong lần thanh trùng tiếp theo các tế bào dinh dưỡng này sẽ bị tiêu diệt Phương pháp này cho hiệu suất vô trùng cao hơn phương pháp Pasteur

c Phương pháp thanh trùng bằng hơi nước bão hòa áp suất

Phương pháp này dựa trên nguyên tắc làm gia nhiệt các vật bằng hơi nước bão hòa dưới một áp suất lớn hơn áp suất của khí quyển Khi áp suất hơi nước tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo

- Giới thiệu cách vận hành nồi hấp áp lực

5 Bảo quản và kiểm tra môi trường

Giữ môi trường ở nhiệt độ thấp 0-5OC tránh quá khô, nóng, nhiều ánh sáng Kiểm tra bằng cách

để môi trường vào tủ ấm có nhiệt độ 30-32OC trong vài ngày Nếu thấy môi trường bị vẩn đục hoặc có khuẩn lạc phát triển thì loại bỏ

B Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật

1 Định nghĩa: Gieo cấy là quá trình đưa các vật liệu nghiên cứu vào môi trường thức ăn với mục đích phát hiện các loại vi sinh vật có mặt trong đó và thu nhận các canh trường cần thiết cho nghiên cứu Cấy chuyền là quá trình chuyển các canh trường vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác với mục đích nhận giống và giữ giống

Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối

Dụng cụ: Que cấy nhọn hoặc vòng, pipet, que trang,

2 Một số phương pháp gieo cấy

a Cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác

Tiến hành từ canh trường đặc (hoặc lỏng) sang môi trường đặc (hoặc lỏng)

b Gieo cấy trên mặt thạch nghiêng

- Theo hình chữ chi

- Theo hình vòng xoắn

- Theo những đường song song

- Theo một đường thẳng

- Theo từng chem

c Dùng que cấy đâm sâu trên thạch đứng

d Cấy trên thạch hộp

Hình chữ chi trên toàn mặt thạch

Theo bốn đường zich-zac ở bốn góc hộp

Theo các đường song song

Chấm điểm

e Dùng pipet Pasteur hay pipet chia độ

- Dung pipet lấy một lượng canh trường thả trên mặt thạch rồi dung que trang dàn đều giọt canh trường trên mặt thạch

- Cấy bề sau

Giống – ống nghiệm – hộp thạch

Giống – hộp thạch – ống nghiệm môi trường

Bài 2 : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

A PHÂN LẬP VI SINH VẬT

Vi sinh vật thường tồn tại trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu dưới dạng một hỗn hợp gồm nhiều loại khác nhau Muốn nghiên cứu hoặc sử dụng vào thực tế bất kỳ loài nào ta phải phân lập để thu được canh trường chỉ chứa loài đó Quá trình tách một vi sinh vật ra khỏi hỗn hợp gọi là phân lập Tùy mức độ thuần khiết mà người ta phân biệt canh trường tập trung hay canh trường thuần khiết

I Canh trường tập trung

2 Phương pháp phân lập canh trường tập trung

Sử dụng môi trường chọn lọc hoặc là điều kiện chọn lọc, tức môi trường hoặc điều kiện chỉ thích hợp cho một loài vi sinh vật nhất định, còn các loài khác thì không thể hoặc khó phát triển

Để có môi trường chọn lọc, ta có thể thay đổi thành phần, nguồn các bon, nitơ, độ pH Ví dụ,

để tách nấm men, ta dùng môi trường chứa nhiều đường và pH thấp

Về các điều kiện chọn lọc, ta thay đổi nhiệt độ môi trường, lưu lượng khí được cấp và các điều kiện khác Ví dụ: tách vi sinh vật ưa nóng hoặc lạnh bằng cách nuôi ở nhiệt độ 50-600C hoặc 10-150C, để tách các vi sinh vật yếm khí khỏi các vi sinh vật hiếu khí, ta nuôi trong điều kiện yếm khí

Nói chung, tuỳ đặc tính sinh lý của từng loài mà ta có những môi trường và điều kiện chọn lọc khác nhau

II Canh trường thuần khiết

1 Định nghĩa

Canh trường thuần khiết là canh trường mà tất cả các vi sinh vật trong đó đều sinh ra từ một tế bào ban đầu Việc phân lập canh trường thuần khiết thường thực hiện từ canh trường tập trung

2 Các phương pháp phân lập canh trường thuần khiết

a Phương pháp pha loãng môi trường lỏng

Phương pháp này do Pasteur đưa ra đầu tiên, tiến hành như sau:

- Lấy một số ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã vô khuẩn

- Dùng que cấy hoặc pipette cấy vật phẩm nghiên cứu vào ống nghiệm thứ nhất

- Đánh tan và lắc đều rồi cấy chuyển tiếp sang ống nghiệm thứ hai

- Lặp lại như vậy với ống nghiệm thứ hai, ba, bốn

Cuối cùng ta có thể thu được ống nghiệm chỉ chứa 1 tế bào duy nhất Tế bào này sẽ là tổ tiên cho canh trường thuần khiết

Phương pháp này đơn giản dễ làm nhưng không phải bao giờ cũng bảo đảm, vì vậy nó thường được dùng như giai đoạn đầu của các phương pháp phân lập khác

b Phương pháp gieo cấy trên môi trường đặc

Nguyên tắc của phương pháp này là tách từng khuẩn lạc mọc riêng lẻ trên môi trường đặc Cách tiến hành như sau:

- Đem vật phẩm nghiên cứu nghiền nhỏ, hoà tan và pha loãng dần đến mức độ nhất định trong các ống nghiệm chứa nước cất hoặc nước muối sinh lý (0.85%) đã vô trùng Tuỳ trường hợp mà pha loãng nhiều hay ít hoặc không pha loãng Nói chung nên pha loãng để các tế bào tách rời nhau và khi gieo cấy các khuẩn lạc mọc tách biệt

Hình 1: Sơ đồ quy trình pha loãng Pasteur

Sơ đồ phân lập trên môi trường đặc (có pha loãng trước)

Đem vật phẩm đã pha loãng cấy trên môi trường thạch hộp đã vô khuẩn theo một trong các cách sau:

- Dùng que cấy vòng cấy theo vết cạn dần - cấy thưa và đưa nhanh

Hình 2: Các phương pháp cấy theo vết cấy cạn dần

- Dùng pipet đưa một lượng canh trường nhất định vào hộp petri, sau đó dùng que trang dàn đều

vật gieo cấy trên mặt thạch hộp

- Trộn vật gieo cấy vào ống thạch đã vô trùng và làm nguội đến 450C, sau đó đổ vào hộp petri

Trong ba cách trên thì hai cách sau hay dùng vì nó thường cho các khuẩn lạc riêng biệt

Gieo cấy xong, nuôi ở điều kiện thích hợp nhất cho loài vi sinh vật định phân lập Sau 1 - 2 ngày,

đem quan sát và chọn những khuẩn lạc đứng riêng biệt, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vậty ở

khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyền lên ống thạch Mỗi khuẩn lạc cấy lên một ống Sau đó nuôi ở

nhiệt độ thích hợp ta sẽ được canh trường thuần khiết

Chú ý nếu sau hai ngày, vi sinh vật chưa phát triển thì có thể để lâu hơn Phải chọn các khuẩn lạc

riêng biệt

- Ưu điểm: Phổ biến, dễ làm, kết quả tương đối đảm bảo

- Nhược điểm và cách khắc phục: Khuẩn lạc có thể không phải phát sinh từ một tế bào ban đầu

mà nhiều tế bào đã dính với nhau từ lúc đầu Các khuẩn lạc lúc mới mọc thì riêng lẻ nhưng để để

quá thời gian chúng lại dính liền nhau có thể khắc phục bằng cách phân lập như trên vài lần,

đồng thời làm tiêu bản để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc đã tách

c Phương pháp tách từng tế bào

Thường dùng để tách các vi sinh vật mà tế bào có kích thước tương đối lớn như nấm men, bào tử nấm mốc Có thể thực hiện theo hai cách sau:

+ Tách từng giọt chỉ chứa một tế bào có kiểm tra bằng kính hiển vi:

- Pha loãng canh trường vi sinh vật bằng các ống nghiệm chứa môi trường lỏng vô khuẩn Pha loãng đến mức là trong mỗi giọt nhỏ chỉ có một hoặc hai tế bào vi sinh vật

- Dùng que cấy nhọn hoặc ngòi bút nhỏ (đã vô khuẩn) chấm từng giọt nhỏ canh trường đã pha loãng lên lá kính vô khuẩn Chấm thành ba bốn hàng và các giọt cách xa nhau vừa phải để dễ quan sát

- Nhanh chóng xoay lá kính cho các giọt xuống dưới rồi đặt lên phiến kính lõm, bôi vazơlin quanh mép lá kính, giữ không cho các giọt bị khô

- Quan sát dưới kính hiển vi và đánh dấu những giọt chỉ có một tế bào

- Quan sát xong, đặt các phiến kính vào hộp petri có lót bông hoặc giấy lọc tẩm nước (tránh cho các giọt không bị khô đi) rồi đem nuôi ở nhiệt độ thích hợp

- Sau 1 - 2 ngày, các tế bào trong giọt sẽ hình thành khuẩn lạc, ta lấy ra và quan sát những giọt đã đánh dấu xem tế bào co sinh sản, phát triển không Nếu có ta cấy chuyền các khuẩn lạc lên môi trường thích hợp Cách cấy truyền như sau: Dùng kẹp cặp một mảnh giấy lọc hình tam giác (tất

cả đã được vô trùng) thấm giọt có khuẩn lạc định tách rồi nhanh chóng đặt vào ống nghiệm chứa môi trường thích hợp; để ống nghiệm vào tủ ấm, sau 1 - 2 ngày người ta được canh trường thuần khiết

Ưu điểm: Phương pháp này cho kết quả bảo đảm vì có kiểm tra bằng kính hiển vi

+ Tách từng tế bào nhờ dụng cụ vi thao tác (micromanipulateur)

Micromanipulateur là một dụng cụ tương đối phức tạp, làm việc dưới sự kiểm tra trực tiếp qua kính hiển vi Nó bao gồm các kim nhỏ, micropipet, giá đỡ và các bộ phận cơ học tinh vi có thể di chuyển các kim và pipet để lấy riêng ra từng tế bào vi sinh vật trong giọt canh trường rồi đem nuôi cấy riêng biệt ta sẽ được canh trường thuần khiết

Ưu điểm: Phương pháp này tương đối nhanh chóng, chính xác nhưng đòi hỏi cẩn thận, khéo léo

III Phân lập vi sinh vật yếm khí

Nói chung có thể phân lập theo các phương pháp trên rồi nuôi ở điều kiện yếm khí Nếu khó tạo điều kiện yếm khí thì phân lập như sau:

1 Dùng pipet Pasteur

- Pha loãng vật phẩm nghiên cứu đến mức độ nhất định

- Lấy một giọt của canh trường pha loãng cuối cùng cho vào ống thạch (đã đun chảy trước và làm nguội đến 45 - 50OC) lắc đều

- Hút một ít môi trường đã trộn vi sinh vật nói trên vào pipet Pasteur rồi dùng đèn cồn hàn kín đầu nhỏ của pipet, để vào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp

- Sau 1 - 2 ngày các khuẩn lạc của vi sinh vật sẽ mọc trong ống thạch

- Lấy pipet ra, đánh vỡ và lấy các cục thạch có khuẩn lạc riêng biệt cho vào môi trường nuôi cấy thích hợp

Động tác này phải tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng, ngoài ra, để nhận biết vùng có vi sinh vật yếm khí phát triển người ta thêm vào ống thạch 0,2% indigocacmin Những vùng có vi sinh vật phát triển indigocacmin bị khử và chuyển thành màu vàng

2 Dùng hộp petri lộn ngược

- Pha loãng rồi cho vào ống thạch như trên

- Lắc đều rồi đổ ra hộp petri và đậy ngược đáy nhỏ của hộp lên lớp thạch, sau đó dùng paraphin bôi xung quanh mép hộp (Hộp petri đã vô trùng và đặt lộn ngược trước)

- Đặt vào tủ ấm, sau 1 - 2 ngày lấy ra và tách thạch có khuẩn lạc đem cấy vào môi trường thích hợp

Nhược điểm: Kém chính xác vì khi đếm nhữ vậy ta đếm cả những tế bào đã chết trước lúc làm tiêu bản

Các phương pháp định lượng trực tiếp

1 Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu

+ Phạm vi sử dụng: thường dùng để đếm vi sinh vật mà tế bào có kích thước lớn như nấm men, bào tử nấm mốc

+ Mô tả buồng đếm hồng cầu: Đó là một phiến kính dày có đục bốn rãnh chia thành ba khoang ngang, khoang giữa thấp hơn hai khoang bên 0,1 mm và được chia thành hai khoang nhỏ nhờ một rãnh dọc; trên mỗi khoang nhỏ này có kẻ một lưới đếm gồm nhiều ô vuông lớn, một số ô vuông lớn lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là 16) có cạnh dài 1/20 mm diện tích 1/400 mm2; nếu chiều cao 0,1 mm thì thể tích là 1/4000 mm3 Mỗi buồng đếm có kèm theo một

- dùng bông thấm nước, tẩm nước cất và phết nhẹ lên hai khoang bên của buồng đếm, đặt lá kính lên rồi dùng ngón tay ấn nhẹ cho lá kính dính chặt vào phiến kính

- Dùng pipet lấy canh trường đã pha loãng cho canh trường chảy từ từ vào khoảng trống giữa lưới đếm và lá kính (nên bỏ đi vài giọt đầu)

Chú ý không để canh trường tràn ra ngoài khoang đếm, rơi xuống các rãnh và tránh tạo thành bọt khí

- Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên trong 3 - 5 phút rồi tiến hành đếm trong 5 ô lớn chéo nhau tức là 80 ô vuông nhỏ Hoặc có thể đếm 4 ô vuông lớn tức là 100 ô vuông nhỏ (chú ý chọn mỗi ô ở vị trí khác nhau) Tính số tế bào trung bình trong mỗi ô

Chú ý:

- Cần làm lặp lại 3-4 lần

- Với những tế bào nằm trên đường gạch thì chỉ đếm những tế bào có hơn 1/2 phần nằm trong ô đang đếm.- Trước và sau khi dùng, buồng đếm và lá kính phải được rửa kỹ bằng nước cất rồi dùng bông lau sạch để khô

- Khi số tế bào trong một ô quá 16 thì nên pha loãng canh trường thêm

Tính toán:

Nếu dùng buồng đếm có bề sâu h = 0,1 mm và diện tích 1ô S = 1/25 mm2

thì số tế bào trong 1 ml canh trường là: =

S h

f a





trong đó: a là số tế bào trung bình có trong 1 ô

f là hệ số pha loãng của canh trường

h là bề sâu của lưới đếm

+ Cách tiến hành:

- Đo đường kính kính trường của hệ thống kính định dùng khi quan sát

- Dùng micropipet đã vô trùng lấy chính xác 0,01 ml vật phẩm nghiên cứu Cho dàn đều lên phiến kính sạch với diện tích nhất định (2 - 4 cm2)

- Để khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh metylen

- Để khô và quan sát dưới kính hiển vi Đếm số tế bào trong 5 - 10 kính trường, lấy trung bình rồi suy ra số tế bào trên một đơn vị diện tích vết bôi và cuối cùng là số tế bào trong một đơn vị vật phẩm nghiên cứu

3 Phương pháp Vinogratxki - Sungina

+ Phạm vi sử dụng: Phương pháp này thường dùng để định lượng vi sinh vật trong đất hay vật phẩm đặc, rắn

+ Cách tiến hành:

- Cân một lượng nhất định (1g hay 5g) vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ trong cối thủy tinh rồi chuyển tất cả vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch Lắc đều trong 5 phút và để yên trong 1 - 2 giây

- Dùng micropipet đã vô trùng lấy chính xác 0,01 ml hỗn dịch đã chuẩn bị dàn đều trên một diện tích nhất định của phiến kính sạch (4 - 8 cm2) để tránh vi sinh vật dồn lại đầu pipet, động tác này phải làm nhanh, lượng hỗn dịch hút vào pipet không nên nhiều quá và lúc chưa dàn kịp thì phải giữ pipet ở vị trí nằm ngang

- Để khô rồi đổ lên vết bôi một lớp thạch mỏng, loãng (0,1%) Lại để khô và cố định bằng cồn tuyệt đối trong 5 phút

- Nhuộm bằng dung dịch eritrozinphenol từ 0,5 - 3 giờ Trong quá trình nhuộm phải theo dõi để thuốc nhuộm trên vết bôi không bị khô đi

- Rửa sạch, để khô và đem quan sát bằng vật kính dầu Cách đếm và tính kết quả gần giống như phương pháp Brit

2 Định lượng gián tiếp

Định nghĩa: Định lượng gián tiếp là những phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách gieo cấy một lượng nhất định vật phẩm nghiên cứu lên môi trường thức ăn thích hợp, nuôi trong 36 -

48 giờ, sau đó đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào có trong một đơn vị vật phẩm ban đầu

Ưu điểm: Chỉ đếm những tế bào vi sinh vật còn sống nên kết quả chính xác hơn

Nhược điểm:

- Tốn thời gian, công sức

- Khi cấy từ các vật phẩm pha loãng chênh nhau 10 lần không bao giờ thấy số khuẩn lạc chênh nhau 10 lần; vì thế để kết quả kiểm tra vi sinh vật có giá trị so sánh tốt nên sử dụng một độ pha loãng thống nhất đối với từng loại vật phẩm

- Đối với những vi sinh vật mà bào tử thường dính chặt với nhau thành từng chuỗi, từng đôi, từng khối thì khi phát triển trên môi trường, mỗi chuỗi, mỗi khối đó chỉ tạo thành một khuẩn lạc

Vì thế, số khuẩn lạc chưa phản ánh được chính xác số tế bào vi sinh vật có trong vật phẩm nghiên cớu

- Không có loại môi trường dinh dưỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển Phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch

Nguyên tắc: Gieo cấy một lượng vật phẩm nhất định lên môi trường đặc trong hộp petri, nuôi ở nhiệt độ thích hợp Sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên rồi suy ra kết quả

- Nếu số khuẩn lạc không nhiều lắm ta đếm trực tiếp tất cả các khuẩn lạc có trong hộp

- Nếu số khuẩn lạc nhiều quá ta dùng kính đếm Lafa đó là một tấm kính hình vuông có kích thước 15 x 15 cm Mặt kính được chia ra thành những ô có diện tích bằng nhau (1 cm2) Đếm số

khuẩn lạc trên 5 - 10 ô Lấy trung bình cho 1 ô (ký hiệu là a tế bào) Đếm xong đo đường kính trong của đáy hộp (ký hiệu là D) Suy ra số khuẩn lạc trong toàn hộp là a x D2/4

Định lượng vi sinh vật trong không khí

Phương pháp lắng của Omelianxki

Nguyên tắc: Theo Omelianxki ước tính: trên một diện tích rộng 100 cm2, mở ra trong 5 phút thì lượng vi sinh vật rơI xuống tương đương với lượng vi sinh vật có trong 10 lít không khí

Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất thường dùng

Nhược điểm: Không thật chính xác vì dựa trên cách ước tính

Cách tiến hành: Đặt hộp petri có môi trường đặc đã vô trùng ra chỗ không khí định nghiên cứu

Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút) rồi đậy nắp hộp và để vào tủ ấm Sau 24 – 48 giờ đem ra, đếm số khuẩn lạc

Tính toán: Đo đường kính hộp petri (d cm) để tính điện tích (D2/4) rồi suy ra lượng vi sinh vật tong 1 lít hay 1 m3 không khí theo ước tính của Omelianxki

Ngoài ra còn có thể ước tính như sau: Hộp petri có diện tích 60 cm2 Sau 1 giờ sẽ có một lượng

vi sinh vật lắng xuống bằng lượng vi sinh vật có trong 6 lít không khí

Bài 3 : KÍNH HIỂN VI CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT

VI SINH VẬT SỐNG QUAN SÁT NẤM MEN

A KÍNH HIỂN VI

Kính hiển vi là một hệ thống quang học dùng để phóng đại ảnh của vật cần quan sát Kính hiển

vi có nhiều loại tùy thuộc vào ánh sáng mà người ta sử dụng như: kính hiển vi quang học, kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi điện tử

I Cấu tạo kính hiển vi quang học

Kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận chức năng: cơ học và quang học

Hình 4: Cấu tạo kính hiển vi điện tử

1 Bộ phận cơ học: có cấu tạo khá đơn giản gồm giá kính, ống kính và khay kính

- Giá kính: có cấu tạo vững chắc để trên đó lắp các bộ phận khác của kính Nó gồm đế kính và thân kính

- Khay kính: hình tròn hoặc hình vuông là nơi đặt tiêu bản Hai bên có ốc để chuyển dịch theo hai chiều khác nhau có hai kẹp bằng thép để giữ tiêu bản

Hình 5: Các loại khay kính thường dùng ở kính hiển vi

- Ống kính: là một ống tròn (kính một mắt) hay hai ống tròn (kính hai mắt) Nhờ ốc cố định bên cạnh ta có thể xoay ống kính theo hướng thuận với người quan sát người quan sát Đầu trên của ống kính lắp thị kính, đầu dưới gắn với bàn xoay có lắp nhiều vật kính khác nhau và có thể xoay quanh trục của giá kính Ống kính có thể di chuyển lên, xuống nhờ các ốc điều chỉnh quay

tự do theo hai chiều ngược nhau Ốc di chuyển nhanh (ốc điều chỉnh thô) dùng để tìm ảnh của vật còn ốc di chuyển chậm (ou ốc điều chỉnh tinh) dùng để điều chỉnh cho ảnh của vật rõ nét

đó giữa thủy tinh và dầu tạo thành một môi trường tương đối đồng nhất nên ánh sáng đi qua không bị khúc xạ mà rọi thẳng vào vật kính Mỗi vật kính có một khoảng làm việc (khoảng cách

từ tiêu bản tới vật kính cho phép thấy rõ nhất ảnh của mẫu vật) nhất định, cụ thể là: đối với vật kính 8x - 8,53 mm; 40x - 0,4 mm; 90x - 0,1mm

(a) (b)

Hình 6: (a) Các loại vật kính, (b) Vị trí của vật kính trong kính hiển vi

- Thị kính: lắp ở đầu ống kính, cấu tạo từ hai thấu kính Mỗi loại thị kính cũng có độ phóng đại khác nhau và ghi ở mặt ngoài thị kính (7x, 10x, 15x )

Hình 7: Các loại thị kính khác nhau

Khi quan sát ta được một ảnh ảo, ngược với vật và có độ phóng đại bằng tích số giữa độ phóng đại của vật kính, thị kính được sử dụng và phóng đại của bộ phận truyền quang (ở một số loại kính hệ thống truyền quang cũng có tác dụng phóng đại)

- Kính tụ quang: lắp dưới khay kính, gồm một hệ thống thấu kính ghép lại, có tác dụng tập trung ánh sáng để chiếu vào tiêu bản Kính tụ quang có thể di chuyển lên, xuống nhờ ốc điều chỉnh bên cạnh

Dưới kính tụ quang là hệ thống chắn sáng cho phép điều chỉnh lượng ánh sáng đi vào nhiều hay

- Điều chỉnh kính tụ quang: Muốn chiếu sáng vừa hoặc ít thì hạ kính tụ quang, mở chắn sáng vừa phải Muốn chiếu sáng nhiều thì nâng tụ quang lên, mở rộng chắn sáng

2 Quan sát tiêu bản

- Dùng ốc di chuyển nhanh làm xa khoảng cách giữa vật kính và khay kính

- Xoay vật kính định sử dụng vào trục giữa Đặt tiêu bản lên khay kính và nhìn vào thị kính, điều chỉnh tiêu bản để chọn được vùng định quan sát

- Nếu dùng vật kính dầu thì nhỏ một giọt dầu lên tiêu bản Từ từ đưa vật kính lại gần sát tiêu bản Không làm nhanh quá, tránh vỡ tiêu bản hoặc vật kính

- Nhìn qua thị kính, dùng ốc di chuyển nhanh từ từ đưa vật kính đến khoảng làm việc tương ứng, khi thấy ảnh của vật thì dừng lại và dùng ốc di chuyển chậm điều chỉnh cho ảnh rõ nét

III Cách bảo quản

1 Bảo quản sau khi sử dụng kính

- Nâng vật kính lên, lấy tiêu bản ra, đưa khay kính về vị trí cũ

- Nếu dùng vật kính dầu thì dùng bông tẩm dung môi hữu cơ như xilen hay toluen lau nhẹ đầu vật kính cho thật sạch

- Hạ kính tụ quang, xoay gương phản chiếu

- Xoay điểm giữa của hai vật kính gần nhau vào trục Xếp khăn lại, đặt lên khay kính rồi hạ vật kính chạm sát khăn

- Cho kính vào hộp hoặc phủ kính bằng bao nilon Chuyển kính vào tủcó hệ thống đèn bật thường xuyên để chống mốc và bụi bẩn

2 Bảo quản thông thường và định kỳ

- Giữ kính sạch sẽ ở nơi khô ráo

- Trong thời gian không dùng có thể tháo thị kính ra và đậy nắp ống kính

- Làm sạch kính trên của thị kính bằng khăn mềm, chổi lông

- Hàng năm cần định kỳ mời thợ chuyên môn tu chỉnh, lau chùi để bảo quản kính

- Chỉ di chuyển kính khi thật cần thiết và thao tác di chuyển phải thận trọng: một tay cầm thân kính, một tay đỡ đế kính

B CÁC LOẠI TIÊU BẢN QUAN SÁT VI SINH VẬT SỐNG

Các loại tiêu bản quan sát vi sinh vật sống là loại tiêu bản tạm thời, có những đặc điểm sau:

- Thao tác làm tiêu bản đơn giản, tiến hành nhanh

- Quan sát được các trạng thái sống của tế bào như: sự chuyển động của tiên mao, sự sinh sản, sự hình thành bào tử

- Tiêu bản loại này chỉ sử dụng một lần rồi bỏ đi

Cách lấy giống vi sinh vật:

Muốn làm bất kỳ một loại tiêu bản nào về vi sinh vật cũng đều phải thực hiện các thao tác lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi trên tiêu bản Các thao tác này diễn ra theo trình tự sau:

- Đốt đèn cồn lên

- Tay trái cầm ống nghiệm có canh trường vi sinh vật (ngửa lòng bàn tay lên, đặt ống nghiệm giữa ngón trỏ và ngón cái sao cho ống canh trường hơi nghiêng) Nhất thiết không để canh trường chạm nút bông (nếu là canh trường lỏng)

- Dùng tay phải xoay nhẹ nút bông một vòng để dễ rút ra

- Tay phải cầm que cấy, nung nóng đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn, lướt thân que cấy qua đèn cồn sao cho toàn bộ que cấy được thanh trùng hoàn toàn

- Kẹp nút bông giữa ngón út và lòng bàn tay phải hay giữa ngón út và ngón đeo nhẫn của bàn tay phải, rút nhẹ nút bông và giưỡ nguyên như vậy suốt quá trình lấy mẫu tuyệt đối không để nút bông lên bất kỳ một vật nào khác

- Đốt miệng ống nghiệm trên đèn cồn

- Khéo léo đưa đầu que cấy (đã nguội) vào ống giống để lấy canh trường và nhẹ nhàng đưa que cấy ra

+ Nếu ống giống là canh trường lỏng thì chỉ cần nhúng đầu que cấy vào canh trường rồi rút ra + Nếu ống giống là canh trường đặc thì dùng que cấy lấy một chút sinh khối vi sinh vật trên mặt thạch Chú ý thao tác hết sức nhẹ nhàng để lấy giống mà không cầy mặt thạch lên

- Đốt miệng ống nghiệm một lần nữa rồi nút bông lại Đặt ống nghiệm lên giá

- Đưa giọt canh trường (hoặc sinh khối) vi sinh vật ở đầu que cấy đặt lên phiến kính để làm vết bôi

- Sát trùng lại que cấy rồi đặt lên giá

I Tiêu bản giọt ép

1 Phạm vi sử dụng

Tiêu bản giọt ép cho phép quan sát hình dạng, xác định kích thước của tế bào vi sinh vật

2 Cách làm