I. Dụng cụ đo:
b. Nhuộm phức tạp
+ Khái niệm: Trên tiêu bản sử dụng đồng thời hai hay nhiều loại thuốc nhuộm. + Ý nghĩa của phương pháp nhuộm phức tạp:
- Nhằm nghiên cứu hình thái, cấu trúc đặc biệt của tếbào làm cơ sở cho việc phân loại vi sinh vật
- Nhằm phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các tổ chức, cơ quan, của cơ thểđộng thực vật hay trong các vật phẩm nghiên cứu.
- Là biện pháp bảo quản các tiêu bản vi sinh vật lâu dài hơn, phục vụ cho công tác nghiên cứu. + Nguyên tắc của nhuộm phức tạp
Các cấu trúc khác nhau, thậm chí các phàn khác nhau của một cấu trúc thường có tính chất lý học, hóa học cũng như khảnăng bắt màu khác nhau.
Việc sử dụng đồng thời các loại thuốc nhuộm trên cùng một tiêu bản cho phép ta nghiên cứu cấu tạo và đặc tính của tế bào cũng như sự khác nhau giữa các loài vi sinh vật.
+ Các phương pháp nhuộm phức tạp thường là: nhuộm Gram, nhuộm bào tử, tiên mao, thể ẩn nhập, chất nhân, vỏ nhày v.v.
Phương pháp nhuộm Gram
Phương pháp này do Christin Gram đưa ra vào năm 1884. Đây là một phương pháp nhuộm quan trọng dùng đểđịnh loại vi sinh vật dựa trên thành phần cấu tạo của chúng.
* Nguyên tắc
Người ta cho rằng trong nguyên sinh chất tế bào của một số loài vi sinh vật có chứa phức chất
protein đặc biệt mà thành phần của nó có muối ribonucleat magie, khi nhuộm phức chất này kết hợp với loại thuốc nhuộm triphenylmêtan (như gential violet, cristal violet, metyl violet...) và iôt
sẽ cho màu tím rất bèn vững chịu được tác dụng của cồn. Những vi sinh vật có tính chất này gọi là vi sinh vật Gram dương (+) nếưu không gọi là vi sinh vật Gram âm (-).
Dựa vào khảnăng bắt màu gram người ta chia vi sinh vật thành hai nhóm:
- Gram dương (+): gồm hầu hết các loại cầu khuẩn, các trực khuẩn hiếu khí có bào tử
(Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus mycoides), nấm men, xạ khuẩn... - Gram âm (-): gồm nhóm vi khuẩn đường ruột
như Bacterium coli, Bacterium typhi,
Bacterium aerogenes, Bacterium proteus, vi khuẩn axetic...
Hình 11: Cấu tạo lớp màng của VSV Gram (-) và Gram (+)
* Các bước tiến hành
Sau khi cốđịnh vết bôi thì tiến hành nhuộm:
- Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút. - Đổ hết thuốc đi, nhỏ dung dịch lugol lên và để trong một phút.
- Rửa nước
- Rửa nước
- Nhuộm bổ sung Fuchsin trong một phút - Rửa nước
- Làm khô tiêu bản và soi dưới vật kính dầu.
- Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) có màu tím, gram (-) màu hồng.
Phương pháp nhuộm Gram không phải bao giờ cũng cho kết quảổn định, nó còn phụ thuộc trạng thái nuôi cấy, lứa tuổi sinh lý và đặc tính một số loài (nên nhuộm lúc vi sinh vật còn non). Ngoài ra lúc tẩy màu nếu làm thiếu cẩn thận thì kết quả cũng không chính xác. Đểđảm bảo kết quả nên dùng cồn có iôt thay cồn (100ml cồn + 2 - 4ml nước iôt 10%). Trong cồn có iôt, vi khuẩn gram (- ) bị mất màu sau 5 phút còn vi khuẩn gram (+) vẫn giữ màu sau 1 giờ.