TRUONG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THUC PHAM THÀNH PHĨ HỊ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KĨ THUẬT MƠI TRƯỜNG
-==#»s& L@»s@
Bio edo: TH NGHIEM
Trang 2
PHAN 1: DUNG CU VÀ THIẾT BỊ, -22-°©E+++#E++E£+EEE++etEEEEEttEEEExeetrEExretrrrxrrrrrrrrrrrrrrrree 1
1 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn hỌC:: - - + + + E*E*EEk£E Event tr 1 LL nh 1
TA: an 5
PHAN 2: MỘT SÓ KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG PHÂN TÍCH VI SINH -s2 10
2.2.1 Kỹ thuật tiêu bản tạm thời
2.2.2 Kỹ thuật pha môi trường - + + 52+ vvvvrrxgvrrrrrkrrrrrrrkrkrrrrrkrrrrrrrkrererrrre 11 2.2.3 Kỹ thuật làm ống thạch nghiêng : . 2222+2222E222v+222E2E2EE.222E1111 2 1 rrrrrrer 12
2.2.4 Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật -c:+ 5222222cct22222 2E 22211111 1 2111111 1111 1xee 13
2.2.5 Kỹ thuật phân lập vi sinh vật - +22 ss+xveverrtrrkrrrrrrrrrrkrrrrrrrrkrrrrrrrrrrerrrrrre 15
2.2.6 Kỹ thuật pha lỗng mẫu -©2222+222E++2EEEEErtEEEErtttErtrrrttrrrtrtrrrrrrrrrrrrrierrer 18 2.2.7 Phương pháp hộp đổ -ccc+++222Vc+2+++t2EEEE2 E227 xe 19
2.2.8 Phương pháp hộp trải . ¿-5- 5-5-5252 St xxx 20 2.2.9 Phương pháp nhuộm đơn - 2-55 StS*S*‡*+E#E#EEEvExrxexererrertrtrrrrrrrrrrrrrrrrrrrerrree 2 2.2.10 Phương pháp nhuộm kép (nhuộm gram) - + 55+ 5+ S+S*2*+E+£e£ezexexerersrersrrrree 23 2.2.11 Kỹ thuật sử dụng kính Win View eeccccccssssseesscccesssssessccessssnssesccesssssseeseceessntssseseesssneeeeseessnnneess 26
PHAN 3: KET QUA PHAN TICH VI SINH MÔI TRƯỜNG 2-+£+Eez+2++ez+crzxe 28
Trang 4PHAN 1: DUNG CU VA THIET BI
1 Dụng cụ, thiết bị sử dụng trong môn học: 11 Dụng cụ Dụng cụ Hình ảnh Công dụng Dia petri Chứa môi trường nuôi cấy VSV Dùng để chứa đựng dung dịch với thể tích nhỏ, nuôi cấy vi
sinh vật trong môi
trường lỏng hay môi trường thạch Ống nghiệm
Trang 5
Lá kính : dung đê đậy lên giọt VSV trên phiến kính để quan sát trạng thái sống của tế bào VSV Dùng đê chứa côn, hóa „ chat
Coc thiy tinh
Trải giọt ` sinh khôi
'VSV lên bê mặt thạch Que trang
Que cay vong Ria trén bé mat thach
Trang 6Đèn côn Tao khong gian vô trùng, khử trùng các loại que cây Micropipette Định lượng một thê tích chính xác VSV,
môi trường nuôi cấy
Trang 7Nghiền nhỏ mẫu đất Cối
Bình tam giác có nút Dùng đề chứa côn =
mài hoặc các loại hóa chât
dé bay hoi trong không khí
Chậu thủy tỉnh Chứa rác như giấy
báo,gang tay, khâu trang đã sử dụng
Đê ông nghiệm tránh
Trang 8
- Dung dé dé pipet, dia
Gia dé pipet thuy tinh
Binh tia Chứa nước cât Bóp cao su Sử dụng hơi đề hút hóa chât thông qua pipet 1.2 Thiết bị Thiết bị Cách vận hành Hình ảnh - Mở nắp nổi hấp, lấy
va hai giỏ inox ra ngồi `
Nơi hâp " Cho nước cât vào nôi
khử trùng hâp đên khi ngập con ôc cảm
Trang 9
— _ Bật công tắt ở bên
hông, cài đặt thông số nhiệt độ,ấp suất, thời gian, bấm lần lượt các nút “set” va “start” - Khi đã có tín hiệu thì mở nồi hấp ra, chờ l phút cho bớt nóng và lấy dụng cụ
môi trường ra (nếu muốn hạ
Trang 10Tủ sấy
— Mở cửa tủ sây cho vật liệu sấy vào và đóng lại ( đây thanh tay cầm sang trái để mở, sang trái để đóng) - Cắm nguồn điện chờ 10s rồi mới bật on/off để mở may - Nhdn phim “AW” dé chon chuong trinh P3, cho 5s để xác nhận chương trình đã chọn -_ Nhấn phím X/W đề cài nhiệt độ sây( dùng phím “A Y” để cài nhiệt độ ) — _ Nhấn phím X/W để cài
thời gian sây ( dùng phím
“AW” dé cai thoi gian), nêu chạy liên tục thì để thời gian cài đặt bằng 0 — Chờ 5s máy tự động lưu thong số vừa cài ở bước 4 và 5 - Khi đạt nhiệt độ sấy màn hình nhấp nháy liên tục hai thông số đã cài đặt, khi thời gian cài đựt về 0 thì kết
Trang 12Máy dập mẫu - Dat tiêu bản „ lên bàn mẫu, dùng Kính hiển kẹp để cố định tiêu vi quang bản học - Chon vat kính: tùy theo mẫu tiêu bản và mục đích quan sát mà ta chọn vật kính thích hợp
Trang 13PHAN 2: MOT SO KY THUAT CO BAN TRONG PHAN
TICH VI SINH
2.2.1 Kỹ thuật tiêu bán tạm thời
Nội dung công
việc Hình ảnh minh họa Ghỉ chú Bước I: Rửa sạch lam và lamen o Cho lam và lamen vào chậu thủy tỉnh o Do dd HCl 10% vào và ngâm trong phút vo Rửa lại băng nước
Trang 14Bước 4: Đặt tiêu bản lên bàn mẫu, điều chỉnh kính hiển vi để quan sát 2.2.2 Kỹ thuật pha môi trường Nội dung công việc Hinh anh minh hoa Ghi chú Bước 1: Cân từng thành phân của môi trường — Cân chính xác lượng hóa chất Tắt hết thiết bị quạt Bước 2: hòa tan từng Đối với môi trường
thành phần của môi đặt như agar phải
trường trong một lượng nấu tan chảy xong
nước nhỏ Sau đó trộn lẫn mới hòa tan các tất cả các thành phần dinh thành phần khác dưỡng với nhau và thêm nước cho đủ thể tích Bước 3: Phân phối môi trường vào các dụng cụ chứa, đóng nút bông, bao gói giấy báo
Trang 16Bước 3: Làm nút bông và bịt nắp ông nghiệm Bước 4: Để các ống nghiệm nghiêng <25, phần thạch nghiêng khoảng 1/2-1/3 ông nghiệm Chờ môi trường đông lại, bảo quản ở nhiệt độ thích hợp Chú ý phần thạch cáh miệng ống nghiệm 2 cm Không di chuyển ống nghiệm khi môi trường chưa đông đặc
2.2.4 Kỹ thuật cấy chuyền vi sinh vật
Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Buéc 1: Chuan bi 1 Chuan bi mau VSV ống nghiệm thạch phải đúng và phát nghiêng có môi trường triển tốt phù hợp và 1 ống mẫu chứa VSV ©_ Sử dụng khâu trang trong suôt quá trình cây co Khử trùng sạch tay và bàn làm việc
Bước 3: ` Đốt que cấy trên
o Tay trai cam 2 ngọn lửa đèn côn đên
ông nghiệm (ông chứa khi đỏ
Trang 17
mẫu và ông cây)
o Tay phải cam que cấy,ngón út và lòng bàn tay của tay phải cầm và giữ nút bông Không dé ông nghiệm ở quá xa đèn côn Bước 4: o Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm Dé vào thành ông nghiệm cho bớt nóng
Không để đầu que cấy chạm vào miệng chứa vsv và thành ống nghiệm ° Lây một ít sinh khôi vsv và đậy nút bông lại Bước 5: Tránh đề vỡ thạch © Mở nút bông ở ống thạch cần cấy, khử trùng miệng ống nghiệm
o Rồi đưa que cấy vào đáy ống nghiệm ria theo đường dzích
Trang 20Bước 5: o Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ o Đưa que cấy vào giữa ống nghiệm chứa VSV lấy một ít sinh khéi VSV o Kht tring miéng ống nghiệm, tiệt trùng nút bông và đóng bông ống nghiệm và để que cấy trong khơng gian vơ trùng
© Tay trái mở nắp petri, tay phải cam que cấy ria trên bề mặt thạch, đậy nắp petri lại 6 Đê que cấy vào miệng ống nghiệm cho bớt nóng o6 Chú ý thao tác cẩn thận để không làm vỡ thạch Bước 6: o6 Khử trùng que cấy khi cấy ria xong và để vào giá đựng
6 Ghi tên sinh viên, môi trường, tên
Trang 212.2.6 Kỹ thuật pha loãng mẫu * Với mẫu nước
Nội dung công việc Hình ảnh minh họa | Ghỉ chú
Bước I: Hút 10ml mẫu Lắc đều mẫu
cho vào bình tam giác đã trong bình tam giác ít nhất 2 phút ta có được mâu có độ pha loãng 10” có 90ml nước cất
Bước 2: Dùng pipette vô trùng hút Iml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cat Lắc đều ta được mau có độ pha loãng 10 Làm tương tự như trên đến khi đạt nồng độ yêu cầu * Với mẫu đất Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghỉ chú
Bước 1: Chuan bi mau dat,
Trang 222.2.7
Bước 2: Lắc đêu bình tam giá chứa mẫu, dùng pipette hút Iml cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cât Lac déu dung dich ta được mẫu có nồng độ pha loãng 10° Tiệp tục thực hiên như các bước trên ta sẽ được nông độ theo yêu câu Phương pháp hộp đỗ Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Chuan bị o Pha chế môi trường cần sử dụng đề cấy
o Petri, pipette,bao gói giấy báo và đem hấp khử trùng
Bước 2: o Mẫu chứa
o Kht tring tay va noi vsv phải được lắc
làm việc bằng đèn cồn đều trước khi hút
o Dùng pipette đã hấp © Sử dụng
khử trùng hút 1ml dịch vsv cho vào đĩa petri vô trùng chưa có môi trường
găng tay và khẩu
Trang 232.2.8 Bước 3: Đỗ khoảng 15 — 0ml môi trường nóng chảy ở 45°C vao dia petri da cấy giống vsv, day nap dia petri
Dat dia petri lén mat phang ngang, xoay nhe dia petri theo 2 chiéu ngugc Xoay | déu dia petri dé vsv dan déu va mat thach bang phang Cac thao tác phải được thực
hiện trong không gian vô trùng (gân nhau mỗi chiều từ 3 — 5 lần ngọn lửa đèn để dịch vsv dàn đều ở mặt côn)
đáy của đĩa petri và trộn đều trong môi trường cấy Bước 4: Để đông tự nhiên gần ngọn lửa đèn cồn Dán tên sinh viên ,môi trường, VSV, lén đĩa petri
Đợi môi trường đông, lật
ngược đĩa petri lại, bao gói
và đem bảo quản ở nhiệt độ thích hợp Phương pháp hộp trải Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1:
o St dung cac dia petri
Trang 24
Bước 2: Dùng pipette vô Hút trong không
trùng hút 0,Iml dịch vsv gian vô trùng gần
lên bề mặt môi trường ngọn lửa đèn cồn
thạch đĩa trong không gian vô trùng Thao tác cây được thực hiện trong không gian vô trùng Bước 3: o Nhúng dau que trang vào cốc thủy tỉnh chứa cồn 70, đốt trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng o Mo dia petri, dùng que trang gạt và xoay đều giọt vsv trên bề mặt thạch
Trong khi gat,xoay
dia petri toi lui 3 — 4 lần, mỗi lần % chu vi cho dich vsv trai déu khắp trên bề mặt môi trường Bước 4: Bao gói kỹ và bảo quản đúng thời gian và nhiệt độ o6 Rút que trang khỏi đĩa, đậy dia,up nguoc petri
o Dan nhan, bao
Trang 252.2.9 Phương pháp nhuộm đơn Nội dung công việc Hình ảnh minh họa Ghi chú Bước 1: Chọn 1 phiên kính sạch,cố định vsv bằng cách
cho I giọt sinh khôi vsv
trải đều lên phiến kính, hơ
trên ngọn lửa đèn cồn cho
đến khi khô
Hơ đến khi khô nhưng không đê cháy Bước 2: Cho I giọt lớn phẩm nhuộm đơn (methylene blue) lên vết VSV đã cố định để trong 5 phút Cho giọt dầu đủ lớn đê lắp giọt VSV
Bước 3: Hơ lại trên ngọn
lửa đèn cồn, để yên khoảng 2 — 3 phút, dùng bình tia rua sạch,tiếp tục hơ khô, đặt lam kính lên
Không hơ cháy Rửa vừa phải
cẩn thận tránh để
vsv trôi theo nước
Bước 4: Nhỏ l giọt dau
Trang 26
cedre lên vêt nhuộm, dưa =—— -
lên bàn mẫu, điều chỉnh kính hiển vi và quan sát đến khi thấy rõ ảnh
2.2.10 Phương pháp nhuộm kép (nhuộm gram)
Nội dung công việc Hinh anh minh hoa Ghi chú
Bước 1: Cho 1 giọt sinh Không đê quá gan
khối vsv lên phiến kính ngọn lửa làm cháy
sạch, hơ khô trên ngọn lửa vêt bôi đèn cồn Bước 2:Nhuộm vết bôi bằng dung dịch tím kết tỉnh 6 Nhỏ 2 giọt methyl violet lên vết bôi giữ 30 giây
© Dùng bình tia rửa sạch phẩm nhuộm rồi hơ khô
Trang 28Đước 4: 6 Nhỏ 2 giọt
sarn lên vết bơi,
Trang 30Bước 2: Chọn vật kính o Đặt tiêu bản| —_ - thích hợp để quan đã chuẩn bị trước lên Mu sát từng loài vsv bàn mẫu o Trên bàn mẫu, dùng ốc đi chuyển mẫu vật sau cho mẫu vsv phải nằm trong vùng thị trường o Hạ tụ quang,đóng bớt chắn sang sao cho nhìn rõ đươc hình ảnh © Tùy loài vsv mà sử dụng vật kính thích hợp (10X,40X,100X) o Dùng ốc chỉnh thô, điều chỉnh cho vật mẫu lên sát vật kính cho đến khi thấy được ảnh vsv o Dùng ốc chỉnh tnh vặn chỉnh để thấy rõ ảnh vsv o Để quan sát ảnh có độ phóng đại lớn hơn, chuyển sang vật kính lớn hơn và điều chỉnh ốc chỉnh tinh dé tim ảnh
Bước 3: Vé sinh sach kinh
o Sau khi quan sát để sử dụng cho
Trang 31
| dụng xong | | |
PHAN 3: KET QUA PHAN TICH VI SINH MOI TRUONG
3.1 Vi sinh vat phan giai cellulose 3.1.1 Nguyên tắc
- Cellulose (CaH¡gO¿)ạ là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật Hằng năm có một khối lượng lớn cellulose được đưa vào đất, mặc đù là chất cao phân tử, khá bền,
chúng vẫn bị phân giải đưới ảnh hưởng của một số vi sinh vật trong điều kiện kị khí lẫn hiếu khí, môi trường kiềm hay môi trường axit, độ âm cao thấp ở nhiệt độ khác nhau - Hoạt động phân giải cellulose có ảnh hưởng lớn đến độ phì nhiêu của đất và có ý nghĩa lớn trong quá trình xử lý môi trường
- Quá trình phân giải cellulose xảy ra nhờ tác dụng của enzyme cellulose Dưới tác dụng
của enzyme nay, cellulose bị phân giải thành cellulobiose (C¡;H›;O¡¡) lại tạo thành ølucose (CzH¡2O¿) nhờ tác dụng của enzyme celloblase
- Các vi sinh vật tham gia quá trình phân giải cellulose bao gồm vi khuẩn, xạ khuân, nắm nhưng trong đó niêm vi khuẩn đóng vai trò quan trọng
3.1.2 Kết quả - Kết quả phân tích : Tính kết quả:
Số tế bào/g =N x = xnx K=26x m x 10000 x 1= 26.10” (tế bào/g) N: Số khuẩn lạc trung bình trong 1 petri (với N = 26 tế bào)
V : thể tích mẫu cấy (trong trường hợp này là 0,1)
n: số nghịch đảo của nồng độ pha loãng (nồng độ pha loãng ở đây là 10 >n=10000) K: hệ số khô kiệt của mẫu (trong trường hợp này K=l)
Trang 32
Khuân lạc Kích thước Màu sắc Mức độ phân giải Sô khuân lạc Rae 10-20mm Vĩ khuẩn đỏ Đỏ 5/10 13 Vi khuan „ trắng 3-5mm Trắng 2/10 5 Vi nắm 5-10mm Den 3/10 8
- Nhóm chiếm ưu thế là vi khuẩn màu đỏ
- Lấy vi khuẩn trắng cấy ria ta được
- Hình ảnh vi nắm phân giải cellulose, mô tả chỉ tiết
Trang 343.1.3 Nhận xét:
- Tùy vào môi trường mà thời gian xuất hiện khuẩn lạc nhanh hay lâu
- Khi đặt giấy lọc vào hộp petri phải ép sát giấy lọc vào môi trường đề tận dụng hết bề mặt giấy và tránh vi khuẩn khác loài mọc lan vào giấy
- Lúc cấy ria phải thao tác phải nhanh, chính xác, thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh sự nhiễm trùng từ môi trường bên ngoài
3.2 Vỉ sinh vật phân giải phosphor 3.2.1 Nguyên tắc
- Các vi sinh vật đảm nhận chức năng chuyên hoá phosphor vô cơ thành dạng hoà tan có thể là vi khuẩn lưu huỳnh, vi khuẩn nitrat hoá hoặc các laoj vi khuẩn sinh axit lên men nhiều chất khác nhau
- Để xác định số lượng vi khuẩn này, người ta thường dung môi trường glucose và muối phospho khó tan, thường dung Caz(PO/); Do kết quả làm tan phospho mà xung quanh khuẩn lạc sẽ hình thành những vòng trong suốt
3.2.2 Kết quả
Nồng độ 10? Nông độ 10?
- Nong độ pha loãng 107: khuẩn lạc mọc dày trên mặt thạch, không đếm được
Trang 35N: Số khuẩn lạc trung bình trong 1 petri (với N = 26 tế bào)
V : thể tích mẫu cấy (trong trường hợp này là 0,1) n: số nghịch đảo của nồng độ pha loãng
K: hệ số khô kiệt của mẫu (trong trường hợp này K=l) - Hình ảnh vi khuẩn phân giải cellulose, mô tả chỉ tiết 3.2.3 Nhận xét:
- Khi đồ thạch vào hộp petri phải khử trùng vùng xung quanh và tay đề tránh nhiễm vi
sinh vật vào môi trường thạch.Khi tiến hành đồ thạch phải thực hiện trong phạm vi khử
khuẩn của đèn cồn
-_ Ghi nhãn đúng môi trường và đúng nồng độ pha loãng tránh gây lẫn lộn
- Do thí nghiệm của nhóm không đạt kết quả, nên có sử dụng kết quả của một số nhóm
khác dé hoàn thiện bài báo cáo
3.3 Vi khuẩn Nitrat hoá, nitrit hoá và vi khuẩn phản nitrat hoá 3.3.1 Nguyên tắc
- Quá trình mtrit hoá
NH¿ dưới tác dụng của một số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc biệt được oxy hoá để biến thành NO; gọi là quá trình nitrit hoá ÑOz sẽ tác dụng với dung địch Griss I và
Griss II sẽ tạo thành hợp chất màu hồng
- Quá trình nitrat
NH¿ đưới tác dụng của một số vi sinh vật tự dưỡng hoá năng đặc biệt được oxy hoá để
biến thành NO;ˆ gọi là quá trình nitrat hoá Quá trình này gồm 2 giai đoạn: giai đoạn nitrit hod tạo sản phâm nitrit NO; và giai đoạn nitrat hoá với sản phẩm là NO;' Xác định sự hiện diện của NOx bằng cách cho dung dịch phản ứng diphenylamine, nitrat sẽ phản ứng với diphenylamine tạo ra Sulfonylindiphenyamine và dung dịch có màu xanh
- Qué trinh phan nitrat hoa
Là quá trình khử NO; qua nhiều giai đoạn và cuối cùng tạo ra nitơ phân tử dưới tác dụng
của vi sinh vật Quá trình xảy ra trong môi trường kị khí Định tính sự có mặt của nitrat, nitrit như trong phan nitrat hoá, sự tạo ra của nitơ phân tử thé hiện sự hình thành các bọt
khí trong môi trường nuôi cấy
Trang 36
3.3.2 Kết quá
3.3.2.1 Vi khuẩn amon trong môi trường lồng: - Quan sát và ghi nhận các đặc điểm sau:
Sự đục môi trường
L] Sự tạo bông, cặn
CO Sự nổi váng trên bề mặt - Phản ứng sinh hoá:
Sự biến đổi màu sắc của giấy thử pH: giá trị pH
Trang 37
Vi khuẩn Amon hoá Sự đổi màu của giấy pH
- Sau vài ngày,trong quá trình nuôi cấy không ngừng sinh ra bọt khí và trên bề mặt
môi trường có một lớp bọt khí Chứng tỏ có quá trình chuyển hóa NO; và sinh ra khi Np
3.3.2.2 Vi khuan nitrat hoa:
- Phản ứng định tính nitrit:
Dùng ống hút lấy 0,1 ml dung dịch môi trường cho vào ống nghiệm vô trùng Nhỏ I giọt dung dịch Griess I, Griess II : mau hồng
- _ Chọn ống nghiệm đương tính làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển vi
-_ Mô tả,so sánh các hình thái tế bào vi khuẩn quan sát được về: hình đạng,khả năng
di động, khả năng tạo tập đoàn khuẩn keo
Trang 38
Hình: Sự đổi màu của vi khuẩn Nitrat
3.3.2.3 Vi khuẩn phản Nitrat hoá:
3.3.3 Nhận xét:
- Ở quá trình phản nitrat hóa : NO; được khử đến N;O và N¿ Sự giải phóng N; là sản phẩm ưu thế của quá trình phản nitrat Vì N; hòa tan ít trong nước,do đó chúng có
Trang 39
khuynh hướng thốt ra ngồi như các bong bóng nỗi lên trên.Nhờ có lớp dầu paraffin trén bề mặt môi trường nên không khí bên ngồi khơng vào được và nito bên rong mơi trường
cũng khơng thốt ra ngoài được Trong quá trình thí nghiệm cần thao tác cần thận tránh
dé không khí bên ngoài vào
- O quá trình nitrat hóa: sự đổi màu từ trắng sang hồng chứng tỏ cường độ hoạt động của
vi khuẩn mạnh
3.4 E.coli,Coliform
3.4.1 Nguyên tắc
- Ngoài phương pháp đếm khuẩn lạc, số lượng coliforms, coliforms chịu nhiệt, coliforms
phân và E.coli trong mẫu được xác định bằng phương pháp MPN (most probable
number)
- Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy nồng độ thập phân; 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm có môi
trường thích hợp có ống Durham bẫy khí Mỗi nồng độ pha loãng ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại
- Theo đối sự sinh hơi và đôi màu đề định tính sự hiện diện trong từng ống nghiệm, đây
là các ống đương tính Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện