BÁO cáo THÍ NGHIỆM VI SINH vật học THỰC PHẨM

- Biết cách chuẩn bị dụng cụ cần cho quá trình nuôi cấy - Biết cách bao gói đĩa petri, pipet, ống nghiệm và vô khuẩn chúng để đảm bảo môi trường đủ sách cho việc nuôi cấy.. Môi trường th

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ii

DANH MỤC BẢNG iii

BÀI 1: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 1

BÀI 2: KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP 5

BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG – TÁCH VI SINH VẬT 11

BÀI 4: QUAN SÁT VI SINH VẬT NÓI CHUNG TRÊN 15

BÀI 5: QUAN SÁT NẤM MEN 24

BÀI 6: QUAN SÁT VI KHUẨN 30

BÀI 7: QUAN SÁT NẤM MỐC 39

BÀI 8: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG DỊ HOÁ CARBONHYDRATE 49

BÀI 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CÁC LOẠI ĐƯỜNG 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Một số dung cụ và kỹ thuật gieo cấy vi khuẩn 5

Hình 2 Mẫu cấy ziczac và cấy song song 6

Hình 3 Cấy gạc trên môi trường đĩa petri 6

Hình 4 Cách cấy truyền trên môi trường đĩa thạch 7

Hình 5 Các kiểu cấy trên đĩa thạch 7

Hình 6 Trình tự cấy truyền 8

Hình 7 Qui trình pha loãng mẫu 9

Hình 8 Trình tự pha loãng mẫu 12

Hình 9 Các kiểu cấy ria 13

Hình 10 Cấu tạo kính hiển vi quang học 17

Hình 11 Cách làm tiêu bản giọt ép 19

Hình 12, cách làm tiêu bản giọt treo 19

Hình 13 Nấm men (trái) Bacillus Subtilis (phải) dưới kính hiển vi 21

Hình 14 Vi khuẩn Lactose Bacillus 21

Hình 15 Dưa cải muối chua, nem chua 23

Hình 16.chế phẩm vi sinh từ Bacillus Subtilis 23

Hình 17.Hình vẽ nấm men 24

Hình 18 Cách pha loãng mẫu và hình ảnh buồng đếm 28

Hình 19: Cấu tạo buồng đếm và các vùng đếm 28

Hình 20 ứng dụng của nấm men trong sản xuất bánh mì, rượu, bia 30

Hình 21 Các bước nhuộm Gram VSV 33

Hình 22 Hình VSV dưới kính hiển vi: bacillus subtilis, E.coli, Lactic 34

Hình 23 Mẫu nhuộm Gram Bacillus Subtilis, E.coli, Lactic 35

Hình 24 Hình ảnh quan sát được 36

Hình 25 Sản phẩm thạch dừa 37

Hình 26 Probiotic với vai trò hang rào phòng ngự bảo vệ niêm mạc ruột 39

Hình 27 Chao từ nấm Mucor 43

Hình 28 Phomat Camembert 44

Hình 29 Tempeh và món ăn làm từ nó 45

Hình 30 Nước tương lên men tự nhiên 46

Hình 31 Nấm mốc tân công nông sản, trái cây 48

Hình 32 Mẫu nấm men hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải) so với mẫu chuẩn 52

Hình 33 Mẫu hô hấp hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải) 52

Hình 34 Mẫu Lacto bacillus hô hấp hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải) 53

Hình 35 Mẫu A.oryzae hô hấp hiếu khí (bện trái) và yếm khí (bên phải) 54

Hình 36 Mẫu trước và sau khi nhỏ luygol 54

Hình 37 Nấm men trong môi trường Sacarose-lactose-maltose-glucose (trái) 56

Hình 38 L.acidophillus trong môi trường theo thứ tự S-L-M-L 57

Hình 39 Acetobacterxylium trong trong môi trường theo thứ tự S-L-M-L 57

DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Kết quả thí nghiệm tìm số tế bào/1ml mẫu 14

Bảng 2 Nhóm các phương pháp định lượng vi sinh vật 14

Bảng 3 Cấu tạo kính hiển vi quang học 16

Bảng 4 So sánh tiêu bản giọt ép và giọt treo 18

Bảng 5 Kết quả quan sát nấm men, vi khuẩn 20

Bảng 6.Tỷ lệ nảy chồi của nấm men 26

Bảng 7 Tỷ lệ chết của nấm men 27

Bảng 8 Số VSV trong ba vùng quan sát và tổng số VSV TB trong 1ml mẫu 29

Bảng 9 So sánh vi sinh vật Gram (-) và (+) 31

Bảng 10 Kết quả quan sát sống các mẫu VSV 34

Bảng 11 Kết quả quan sát sau khi nhuộm Gram 35

Bảng 12 Kết quả quan sát nhuộm màng nhày 35

Bảng 13 So sánh hô hấp và lên men 49

BÀI 1: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

I Mục đích thí nghiệm

- Tạo môi trường thuần khiết để nuôi cấy vi sinh vật

- Biết cách chuẩn bị dụng cụ cần cho quá trình nuôi cấy

- Biết cách bao gói đĩa petri, pipet, ống nghiệm và vô khuẩn chúng để đảm bảo môi trường

đủ sách cho việc nuôi cấy

II Sơ lược lí thuyết

1 Định nghĩa

Môi trường dinh dưỡng là 1 hỗn hợp các chất dinh dưỡng (những chất tham gia vào quá trình nội bào), và những chất này có thể duy trì thế oxi hóa khử, áp suất thẩm thấu của

tế bào và sự ổn định pH của môi trường

2 Phân loại

Phân loại theo trạng thái lý hóa:

· Môi trường lỏng: lên men, nhân giống, nghiên cứu một số đặc tính

· Môi trường rắn(môi trường đặc): môi trường lỏng kết hợp với chất tạo đặc agar (2-2.5%), gelatin (10-15%)-để phân lặp, định lượng, gieo giống và giữ giống vi sinh vật

· Môi trường bán rắn: hàm lượng chất tạo độ đặc ít hơn môi trường rắn thường dùng (0.3-0.7% agar) – dùng để quan sát khả năng chuyển động của một số

vi sinh vật ( tạo nên đường đi trên bề mặt môi trường)

Phân loại theo thành phần:

· Môi trường tổng hợp:

· Môi trường tự nhiên:

· Môi trường hòa tan chuẩn bị sẵn

3 Yêu cầu môi trường dinh dưỡng

Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết

Có pH thích hợp

Không chứa các yếu tố độc hại

Có độ nhớt nhất định

Tuyệt đối vô trùng

III Cách tiến hành thi nghiệm

Ghi chú:

(1) Đun cách thuỷ: nhiệt độ: 42-450C, thời gian 30 phút

(2) Nâng nhiệt: 68-700C, thời gian 1h

(3) Chỉnh độ đường: dùng balling kế đưa về dung dịch đường 70

(4) Phân phối: 3 ống nghiệm 1/4, 2 ống nghiệm ½

(5) Hấp tiệt trùng: 15-20p

Môi trường thạch nghiêng: cho vào 1/4 ống nghiệm sau đó để nghiêng định hình

Cân 60g malt

H2O Đun cách thu (1)

Nâng nhi t (2)

Th liugon

L c thô

Dd đ ng

Dd đ ng

H p ti t trùng trong

n i autoclave

Ch nh đ đ ng (3)

Đo đ đ ng, Vdd

B sung agar 2-2,5%

Đun cách thu

Đ ng hoá Phân ph i (4)

H p ti t trùng (5)

Đ nh hình

M u

ng nghi m

bã Xay nhuy n

Th

Môi trường thạch đứng: cho vào ½ ống nghiệm sau đó để thẳng đứng

Thao tác phân phối phải nhanh, khéo léo để môi trường không dính vào miệng ống nghiệm, đĩa petri hay nút bông và cần thực hiện trước khi môi trường bị đông đặc

Môi trường thạch phải phẳng, nhẵn

IV Kết quả

Ta có công thức

V1 N1 = V2 N2 V2= V1 N1 / N2

Trong đó

· V1 Thể tích môi trường sau khi lọc tinh

· N1 Độ đường sau khi lọc tinh

· N2 Độ đường cần điều chỉnh là = 70 Balling

Thể tích nước cần thêm vào = V2 – V1

N 1 ( 0 ) V 1 (ml) N 2 ( 0 ) V 2 (ml) V H2O thêm vào

11 127 7 200 73

V Một số chú ý trong tiến trình thí nghiệm:

- Dụng cụ bao gói phải đảm bảo sạch và khô

- Bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng

- Đầu nút tròn, độ chặt vừa phải

- Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng

- Phần giấy bao gói phải chặt kín

VI Bàn luận và mở rộng

1 Đánh giá chất tạo đặc cho môi trường:

Gelatin tuy làm đông môi trường nhưng môi trường tan chảy ở 37 0C, một nhiệt độ tối

ưu của vi khuẩn gây bệnh cho động vật, ngoài ra thì nhiều vi sinh vật phân hủy gelatin làm lỏng môi trường

Agar không chỉ đông đặc tốt ở nhiệt độ dưới 400C mà còn không bị vi sinh vật phân giải làm biến tính

2 Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng

Phương pháp này khá phổ biến vì rất đơn giản và tiện lợi, tuy nhiên thời gian giữ giống chỉ nên kéo dài trong 1 tháng , sau đó phẩi cấy truyền lại trên môi trường mới Do đó tốn nhiều công sức và dễ bị mất các đặc tính di truyền ban đầu Phương pháp này được tiến hành như sau:

Thuần khiết chủng vsv trên môi trường agar ở đĩa petri, chọn các khuẩn lạc điển hình

và cấy lên môi trường thạch nghiêng thích hợp, sau đó nuôi cấy trong tủ ấm để vsv phát triển bình thường, lấy các ống giống ra và cho vào tủ lạnh giữ ở 4oC, hàng tháng cấy truyền lại vào môi trường mới

Nên cho thêm vào môi trường 0,1 M citrat natri hoặc 0,3M Oxalat để chống nhiễm Bacteriophage

3 Hấp tiệt trùng

Ngoài cách tiệt trùng sử dụng hơi nước bão hoà (nồi autoclave) thì tuỳ từng loại môi trường mà có thêm một số phương pháp khác như:

· Phương pháp pasture: đun cách thuỷ ở nhiệt độ thấp 65-700C, thời gian 15-30p

· Phương pháp Tyndal: Nhiệt độ tiệt khuẩn của phương pháp này từ 70-800C/1 giờ làm như vậy 3 lần, mỗi lần cách nhau 24giờ hoặc dùng nhiệt độ 60-650C/1 giờ làm 5 lần Thời gian nghĩ để ở nhiệt độ 370C Phương pháp này thường

được áp dụng tiệt khuẩn các sản phẩm dễ bị hỏng ở nhiệt độ cao Tyndall cho

rằng ở nhiệt độ 60-650C hay ở 70-800C, vi khuẩn thể ding dưỡng sẽ bị chết nhưng nha bào vẫn sống, khi để nguội đến 370C, nha bào chuyển sang thể hoạt động (thể dinh dưỡng) và lại bị tiêu diệt ở lần hấp sau đó

· Nhược điểm: kéo dài thời gian tiệt khuẩn, độ tiệt khuẩn không chắc chắn

BÀI 2: KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP

I Gieo cấy

1 Định nghĩa

Gieo cấy là quá trình chuyển các canh trường vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác với mục đích nhân giống và giữ giống Môi trường mới đảm bảo thích hợp cho sinh vật sinh trưởng và phát triển

Canh trường: môi trường đã có vi sinh vật

2 Yêu cầu gieo cấy

Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối khu vực xung quanh, gieo cấy phải thực hiện trên ngọn lửa đèn cồn hay tủ cấy

Dụng cụ: Que cấy nhọn, móc hoặc vòng, pipet, que trang,

Hình 1 Một số dung cụ và kỹ thuật gieo cấy vi khuẩn

3 Kỹ thuật gieo cấy

- Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang ống chứa môi trường lỏng: nhân giống cấp 1-2-3 để lên men

- Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang môi trường đặc: phân lập, tạo khuẩn lạc

- Cấy chuyền từ canh trường đặc sang môi trường đặc: giữ giống

4 Các cách cấy truyền

Phương pháp cấy trên thạch nghiêng:

Hình 2 Mẫu cấy ziczac và cấy song song

· Hiếu khí: cấy điểm, cấy ziczac, cấy song song

· Yếm khí: đuổi khí, cấy đâm sâu vào trong ống nghiệm

Nếu cấy chuyền vi khuẩn hay nấm men thì di que cấy trên bề mặt thạch theo hình chữ chi hoặc vạch song song

Cấy chuyển nấm mốc thì chỉ cần chạm que cấy lên bề mặt thạch

- Cấy trên mặt thạch đứng

- Cấy trên đĩa petri

- Cấy gạt: cho một ít mẫu vào môi trường thạch trong petri sau đó dùng que trang dàn đều vi sinh vật trên bề mặt thạch trong hộp

Hình 3 Cấy gạc trên môi trường đĩa petri

- Cấy trộn: phối trộn dịch cấy với thạch (500C) sau đó lắc đều và đổ vào hộp petri

đã khử trùng Xoay tròn đĩa để thạch phân bố đều, để yên cho môi trường đặc lại

và cuối cùng là bao gói và nuôi trong tủ ấm (có thể cho dịch cấy vào petri trước và tiếp theo đổ thạch vào đĩa petri)

- Cấy ria: là việc sử dụng que cấy có chứa mẫu sau đó lướt que cấy lên mặt thạch theo hình chữ chi hay đường song song hoặc theo 4 góc

Hình 4 Cách cấy truyền trên môi trường đĩa thạch

Hình 5 Các kiểu cấy trên đĩa thạch

5 Tiến hành thí nghiệm (gieo cấy trên môi trường thạch nghiêng ống nghiệm)

Hình 6 Trình tự cấy truyền

Mô tả qui trình:

a) Một tay cầm 2 ống nghiệm: một ống canh trường và một ống môi trường (ống canh trường nằm bên ngoài, ống môi trường nằm bên trong)

Tay còn lại cầm que cấy và đốt đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn

Dùng ngón út và áp út rút nút bông của ống canh trường ra

b) Hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm

c) Đợi que cấy nguội, lấy vi sinh vật từ ống canh trường đưa sang ống môi trường

d) Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo kiểu hình chữ chi

e) Rút que cấy ra và đốt nóng que cấy

Khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm rồi đậy nút bong

II Phân lập

1 Định nghĩa

Phân lập là quá trình phân tách vi sinh vật từ quần thể ban đầu tạo thành các khuẩn lạc riêng lẻ, có hoạt tính cao

2 Các phương pháp phân lập vi sinh vật

Phương pháp trực tiếp

3 Tiến hành thí nghiệm

a Pha loãng mẫu

Hình 7 Qui trình pha loãng mẫu

Mô tả qui trình:

Mẫu Pha loãng

Làm tiêu bản

Soi dưới kính

Một tế bào riêng rẻ

Chọn chủng thuần khiết

đinh danh

Giống (giữ)

tb có hình dạng khác nhau

Phương pháp gián tiếp

Mẫu Pha loãng Tạo khuẩn lạc trên mt

mới Làm tiêu bản Soi dưới kính Một tế bào riêng rẻ Định danh Giống (giữ)

o Chuẩn bị sẵn 95ml nước vô khuẩn trong bình tam giác và 5 ống nghiệm chứa 9ml nước vô khuẩn

o Dùng pipet 10ml hút 5ml vi sinh vật cho vào bình tam giác có chứa sẵn 95ml nước

vô khuẩn và lắc đều (bình mẫu)

o Dùng pipet 1ml hút 1ml vi sinh vật từ bình mẫu cho vào ống nghiệm thứ nhất có chứa sẵn 9ml nước vô khuẩn (độ pha loãng 10-1)

o Tiếp tục dùng pipet 1ml hút 1ml vi sinh vật từ ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm thứ 2 có chứa sẵn 9ml nước vô khuẩn (độ pha loãng 10-2)

o Lần lượt ta làm tương tự đối với ống thứ 3, thứ 4 và thứ 5(độ pha loãng 10-3, độ pha loãng 10-4, độ pha loãng 10-5)

b Phân lập: đối với mẫu có độ pha loãng: 1 ống 10-3, 1 ống 10-4, 1 ống 10-5

· Hấp cách thủy, rã đông môi trường ½

· Tháo bao gói petri đã vô khuẩn, hơ quanh hộp petri trên ngọn lửa đèn cồn

· Tay trái cầm hộp petri, dùng ngón tay hé mở nắp và rồi dùng tay phải đổ thạch đã

rã đông vào trong hộp petri

· Xoay đều để thạch phân bố đều trong hộp và bề mặt phẳng, nhẵn Để nguội cho thạch đông lại

· Dùng pipet lấy mẫu ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-3 và cho vào hộp petri (vẫn dùng tay để hé nắp hộp petri)

· Vô khuẩn que trang bằng cồn và hơ nóng, sau đó để nguội rồi dàn đều mẫu trên bề mặt thạch để nấm men phát triển đều trên khắp bề mặt thạch

· Để ổn định trong 5 phút, lật ngược hộp petri lại và tiến hành bao gói

· Để nguội trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp (28-300C), trong vòng 48-72 giờ

III Bàn luận và mở rộng

BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG – TÁCH VI SINH VẬT

I Sơ lược lược lý thuyết

1 Khái niệm

Định lượng vi sinh vật là quá trình pha loãng mẫu sau đó cấy chuyền mẫu qua một môi trường mới nhằm mục đích tạo ra các tế bào riêng lẻ và đếm tổng số tế bào có trong 1g hay 1ml mẫu ban đầu

2 Phương pháp định lượng:

Định lượng trực tiếp: là phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có trên tiêu bản làm từ mẫu

o Ưu điểm: cho kết quả nhanh chóng

o Nhược điểm: không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết

o Phương pháp định lượng trực tiếp: Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu (thường dùng nhất)

Định lượng gián tiếp: là phương pháp định lượng thông qua môi trường mới bằng cách gieo cấy một lượng nhất định mẫu lên một môi trường dinh dưỡng thích hợp, nuôi cấy trong tủ ấm, sau đó đếm tổng số khuẩn lạc và dựa vào công thức để tính số tế bào có trong 1g hay 1ml mẫu ban đầu

o Ưu điểm: kết quả chính xác hơn

o Nhược điểm:

- Mất nhiều kinh phí để làm môi trường

- Mất nhiều thời gian

3 Nguyên lý:

o Phương pháp đổ đĩa: một ít vi sinh vật đã pha loãng được trộn đều với môi trường agar nóng chảy và được đổ vào hộp petri vô khuẩn Sau thời gian nuôi cấy vi sinh vật sẽ mọc thành những khuẩn lạc riêng lẽ

o Phương pháp cấy ria: que cấy được sử dụng để cấy ria nhiều lần hỗn hợp vi sinh vật phân lập trên khắp bề mặt môi trường đặc trong petri Sau mỗi lần vi sinh vật

sẽ tách dần ra khỏi hỗn hợp và phát triển thành một khuẩn lạc riêng lẽ

II Tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị dụng cụ:

o Erlen chứa 95ml nước vô khuẩn

o 5 ống nghiệm chứa 9ml nước vô khuẩn

o 1 pipet 10ml và 5 pipet 1ml đã hấp tiệt trùng

o Chuẩn bị các ống thạch, đun chảy cách thủy, giữ ở 450C-500C

1 Pha loãng mẫu:

o Chuẩn bị mẫu: lấy 5ml dịch mẫu chứa VSV cho vào erlen chứa 95ml nước vô khuẩn được 100ml dịch mẫu

o Pha loãng:

Hình 8 Trình tự pha loãng mẫu

o Sử dụng ống nghiệm chứa 9ml nước vô khuẩn

o Giữa những lần pha loãng nên đánh đều bằng máy Vortex

o Pipet nào thì dùng riêng cho ống nghiệm ứng với độ pha loãng đó

o Thao tác nên thực hiện gần đèn cồn để đảm bảo vô khuẩn

o Không nên mở nắp hộp petri quá lớn để tránh nhiễm khuẩn

o Thao tác thực hiện phải nhanh

o Dùng nút bông đậy các ống nghiệm để tránh nhiễm khuẩn

2 Phương pháp đổ hộp (phương pháp trộn)

o Hấp cách thủy, rã đông môi trường ½ giữ môi trường ở nhiệt độ 500C

o Cho 0.2ml mẫu với độ pha loãng tương ứng vào petri và đổ ống nghiệm chứa môi trường vào

o Xoay đều hộp petri cho mặt thạch đều và phẳng Để môi trường đặc lại

o Lật ngược petri, bao gói, để vào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp

o Sau 2-3 ngày, lấy ra, đếm số khuẩn lạc và tính toán kết quả

3 Phương pháp cấy ria (phương pháp tách)