Do tính chất gây hại chủ yếu trong hệ mạch dẫn, khả năng phát tán nhanh chóng qua các môi giới truyền bệnh nên bệnh có mức độ phát triển mạnh, dễ gây thành dịch. Đây là một trong những loại bệnh khó phòng trừ, các biện pháp hóa học ít có tác dụng.
Trên thế giới, nhiều biện pháp phòng trừ bệnh virus hại thực vật đã được áp dụng như :
-Loại bỏ nguồn bệnh bằng cách chọn cây giống tốt, có sức đề kháng cao, xử lý hạt giống (bằng nhiệt, hóa chất,…).
-Theo dõi và phá hủy cây bệnh ngay từ khi bắt đầu có biểu hiện bệnh lý nhằm tránh lây lan sang cây khác.
-Phòng trừ môi giới truyền bệnh: dùng thuốc diệt trừ côn trùng truyền bệnh, dùng bẫy thu hút, bắt và tiêu diệt côn trùng có hại,...
-Áp dụng các biện pháp xen canh, luân canh, phun thuốc diệt cỏ,…
Tuy nhiên, các biện pháp kể trên không mang lại hiệu quả cao trong việc phòng trừ đối với bệnh mà lại tốn rất nhiều công sức. Vì thế, hướng giải quyết tốt nhất để phòng và trừ bệnh là cần thiết phải có những giống cây có khả năng kháng lại loại virus này. Đây là biện pháp đang được các nhà khoa học Việt Nam cũng như thế giới quan tâm và coi đó như là một phương hướng trong chiến lược phòng trừ bệnh virus hại cây trồng hiện nay cũng như trong tương lai (Song et al., 2004).
1.2.5. PRSV gây bệnh trên dƣa hấu
Virus gây bệnh đốm vòng đu đủ là một trong những nguyên nhân chính gây bệnh trên họ bầu bí, trong đó có dưa hấu. Các mô tả về triệu chứng do PRSV gây ra trên cây họ bầu bí cho thấy hầu hết cây trong họ bầu bí nhiễm bệnh đều do PRSV-w
gây ra (Strange et al., 2002; Guner et al., 2002), với triệu chứng như khảm loang lổ, biến dạng, hoại tử trên lá, quả và thân (Guner et al., 2002; Halliwell et al., 1979). Các đốm sáng xuất hiện là do hàm lượng diệp lục bị giảm mạnh, dẫn đến giảm khả năng quang hợp và ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Cùng với ZYMV, PRSV-w thường xuyên lây nhiễm vào dưa hấu (đồng thời hoặc riêng lẻ) và lan truyền nhanh chóng thông qua các loài rệp, các vết thương cơ giới, gây ra sự sụt giảm năng suất nghiêm trọng (Ma et al., 2005; Provvidenti et al., 1984; Xu et al., 2004).
1.3. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng chuyển gen kháng virus
Chuyển gen vào cây trồng đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong tạo giống cây trồng. Cho đến nay, rất nhiều loại gen đã được chuyển vào cây trồng và nhiều loài cây chuyển gen được trồng thử ở điều kiện đồng ruộng, nhiều loại cây chuyển gen được sản xuất đại trà như cà chua, bông, cải dầu, ngô, khoai tây,… Năm 2011, có hơn 160 triệu ha cây trồng biến đổi gen, tương đương với 10,67% tổng diện tích đất nông nghiệp trên toàn thế giới (1,5 tỷ ha), tập trung chủ yếu ở các quốc gia như Mỹ (66,8 triệu ha), Brazil (25,4 triệu ha) Achentina (22,9 triệu ha), Ấn Độ (9,4 triệu ha), Canada (8,8 triệu ha), Trung Quốc (3,5 triệu ha),... Cây trồng chuyển gen có thể được tạo ra với các đặc tính như kháng virus, kháng côn trùng, chín chậm, kháng chất diệt cỏ, tăng hàm lượng chất dinh dưỡng,… (Guner et al., 2002).
1.3.1. Kỹ thuật RNAi
1.3.1.1. Lịch sử phát triển
RNAi (RNA interference) là cơ chế tự nhiên của tế bào sống, làm bất hoạt sự hoạt động của một gen nào đó sau quá trình phiên mã thông qua cơ chế can thiệp của các RNA nhỏ. Hiện tượng này được quan sát lần đầu tiên trên những cây thuốc lá kháng bệnh đốm vòng do virus đốm vòng thuốc lá (Tobacco ring spot virus - TRSV) gây ra (Wingard, 1928).
Năm 1990, nhiều báo cáo gây bất ngờ của các nhà khoa học Mỹ và Hà Lan khi nghiên cứu chuyển gen sinh tổng hợp Chalcone, gen mã hóa cho enzyme quy định
màu sắc hoa (Chalcone synthase - CHS), nhằm tăng thêm màu tím đậm trên cây hoa dã yên thảo (petunia). Tuy nhiên, kết quả không được như mong muốn, thay vì được làm đậm thêm màu hoa thì các cây hoa chuyển gen thu được lại có biểu hiện khảm trắng hoặc trắng tuyền. Điều này chứng tỏ lượng Chalcone đã được tổng hợp ít đi do sự hoạt động của gen chalcone đã bị ảnh hưởng dẫn đến sự giảm lượng sắc tố của hoa. Một điều thú vị nữa là qua các thế hệ, màu trắng của cánh hoa lại giảm đi, các cánh hoa lại dần dần chuyển sang màu tím. Những nghiên cứu sâu hơn về kiểu hình của cây đã cho thấy sự mất điều khiển ở đây là do sự ức chế sau phiên mã sự biểu hiện gen tổng hợp chalcone thông qua việc tăng tỷ lệ phân hủy mRNA (Napoli et al., 1990; Van der Krol et al., 1990). Một vài trường hợp tương tự cũng được quan sát thấy trên một số đối tượng thực vật và nấm (Cogoni et al., 1994; Romano & Macino, 1992). Thuật ngữ “co-supperession” (đồng ức chế) được sử dụng để chỉ hiện tượng này.
Các hiện tượng trên vẫn chưa thực sự giải thích được cho đến năm 1998, Fire và Mello đã lây nhiễm sợi đôi RNA (double stranded RNA, dsRNA) bao gồm cả sợi có nghĩa (sense) và sợi vô nghĩa (antisense), mã hóa cho một protein cơ bắp vào giun tròn C. elegans, cơ chế RNAi đã được làm sáng tỏ. Họ phát hiện khi chỉ tiêm phân tử RNA mã hóa cho protein cơ bắp (sợi có nghĩa) không làm thay đổi hành vi của giun tròn, khi tiêm phân tử RNA đối mã với RNA trên (sợi vô nghĩa) cũng không làm thay đổi gì. Tuy nhiên, khi tiêm đồng thời cả sợi có nghĩa và sợi vô nghĩa thì giun tròn có những cử động lạ, cụ thể là co giật. Các biểu hiện này tương tự như ở những con giun tròn hoàn toàn thiếu gen tổng hợp protein cơ bắp này. Fire và Mello đã giải thích hiện tượng trên là do có trình tự nucleotide hoàn toàn bổ sung với nhau nên sợi có nghĩa và sợi vô nghĩa RNA đã kết hợp lại với nhau tạo ra RNA sợi đôi, và cho rằng phân tử RNA sợi đôi đó có thể làm bất hoạt gen mang cùng mật mã với chúng. Fire và Mello đã sử dụng thuật ngữ “RNA interference” (RNAi) để đặt tên cho cơ chế này. Khám phá này đã làm sáng tỏ nhiều thí nghiệm tiến hành trước đó, đồng thời đề ra một cơ chế tự nhiên để kiểm soát thông tin di truyền, mở
ra một lĩnh vực nghiên cứu mới (Fire et al.., 1998). Nhờ những phát minh quan trọng này, năm 2006 Fire và Mello đã được trao giải thưởng Nobel về Y học.
1.3.1.2. Cơ chế hoạt động RNAi trong cây trồng
RNAi là cơ chế ức chế sự biểu hiện vật chất di truyền ở giai đoạn RNA. Ở thực vật có 3 con đường ức chế RNA: (1) ức chế gen sau phiên mã (post- transcriptional gene silencing, PTGS) thông qua siRNA (short interfering RNA); (2) ức chế gen sau phiên mã qua con đường tạo ra các miRNA (micro-RNA) trong điều chỉnh biểu hiện gen của tế bào; (3) sự câm gen phiên mã (transcriptional gene silencing – TGS) bằng cách liên kết với quá trình biến đổi nhiễm sắc thể trực tiếp qua siRNA, nó bao gồm sự methyl hóa histone và ADN (Baulcombe, 2004).
Các thành phần quan trọng tham gia vào cơ chế RNAi là enzyme Dicer, enzyme Argonaute, phức hệ RISC (RNA-incluced silencing complex), siRNA hoặc miRNA.
Sự ức chế RNA thông qua siRNA xảy ra ở tế bào chất và là con đường quan trọng trong tế bào thực vật nhiễm virus, nơi mà dsRNA có thể sao chép gián tiếp hoặc một đặc điểm cấu trúc thứ cấp của RNA virus sợi đơn. Đối với những virus có genome là ADN, các dsRNA có thể được tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung gối nhau (Baulcombe, 2004). Khi chuỗi xoắn kép RNA (dsRNA) xuất hiện trong tế bào chất, Dicer – một loại ribonuclease III đặc hiệu cho các dsRNA được hoạt hóa thông qua sự phân hủy một phân tử ATP và lập tức cắt những chuỗi kép RNA này thành những đoạn ngắn khoảng 21 – 25 nucleotide, gọi là siRNA (Hammond et al., 2000; Zamore et al., 2000, Hannon, 2002, Pare & Hobman, 2007). Khi lai những RNA cho thấy, đó là những sợi đôi có chứa nhóm phosphate ở tận cùng đầu 5’. Sau khi bị cắt bởi Dicer, chuỗi kép siRNA đi vào phức hệ RISC và được các helicase trong phức hệ RISC cắt các liên kết hydro tách chúng ra làm hai chuỗi đơn, trong đó chỉ có một chuỗi đơn siRNA có đầu 5’ có hoạt lực với Argonaute mới được gắn với phức hệ RISC tạo phức hợp siRNA-RISC, quá trình này có tiêu tốn năng lượng ATP (Schwarz et al., 2002, Redfern et al., 2013, Riley et al., 2012, Ender &
Meister, 2010). Phức hợp siRNA-RISC nhận biết các phân tử mRNA của tế bào có trình tự tương đồng với trình tự của chuỗi đơn siRNA. Sau quá trình nhận dạng, các mRNA và siRNA bắt cặp bổ sung với nhau ở đoạn tương đồng, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA tạo thành những đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotide từ đầu 3’. Sau khi bị cắt đứt, mRNA bị tiêu hủy bởi các RNA nuclease (hình 1.4) (Verdel et al., 2004).
Cơ chế ức chế miRNA: Ngay sau khi phát hiện ra RNAi, người ta nhanh chóng nhận ra rằng cơ chế này đã tồn tại từ lâu trong tế bào bởi một hệ thống điều hòa biểu hiện gen gọi là micro-RNA (miRNA). miRNA là một loại RNA nhỏ, kích thước khoảng 21-24 nucleotide, không mã hóa thông tin di truyền, có chức năng chủ yếu là điều khiển âm sau phiên mã vì cặp base có trình tự gần như bổ sung hoàn toàn với mRNA đích (Bartel et al., 2004). Khác với siRNA, miRNA có nguồn gốc từ các mRNA có cấu trúc kẹp tóc được phiên mã từ hệ gen nhân trong khi siRNA thường có nguồn gốc từ mRNA sợi đôi hoặc những cấu trúc kẹp tóc kéo dài được phiên mã từ transposon, ADN virus hoặc ADN ngoài nhiễm sắc thể. Trong nhân tế bào, các phân tử miRNA được tạo ra thông qua quá trình phiên mã từ các gene gọi là các phân tử miRNA nguyên thuỷ (pri- miRNA), các phân tử này có chứa các cấu trúc kẹp tóc (hairpin) và bị cắt bởi enzyme Drosha để tạo thành những sợi pre- miRNA (phân tử tiền microRNA). Các pre-miRNAs sau đó được di chuyển ra ngoài tế bào chất và bị enzyme Dicer cắt thành những đoạn ngắn miRNA sợi đôi (khoảng 19 – 21 nucleotide). Sau đó, các miRNA sợi đôi bị helicase cắt các liên kết hydro tạo ra miRNA sợi đơn, trong đó chỉ có một sợi có đầu 5’ có hoạt lực với Agronaute mới được kết hợp với phức hệ RISC tạo thành phức hợp miRNA-RISC. Ở thực vật, cơ chế tương tác giữa phức hợp miRNA-RISC với mRNA đích sẽ dẫn đến sự tiêu hủy mRNA, từ đó ức chế biểu hiện gen. Tuy nhiên, ở động vật, phức hợp miRNA- RISC thường can thiệp chủ yếu bằng cách cản trở quá trình dịch mã của mRNA (Jones-Rhoades và Bartel, 2004). Mức độ tương đồng của miRNA trong phức hệ RISC với mRNA đích sẽ quyết định đến hiệu quả bất hoạt quá trình dịch mã của mRNA. Nói chung, mRNA đích sẽ bị tiêu hủy nếu trình tự của nó tương đồng hoàn
toàn với trình tự của miRNA. Mặt khác, nếu trình tự của miRNA chỉ cần tương đồng với mRNA đích từ vị trí nucleotide thứ 2 đến 8 tính từ đầu 5’ thì miRNA sẽ liên kết với mRNA đích và ngăn cản sự dịch mã mà không làm tiêu hủy mRNA (Denli et al., 2004) (hình 1.4).
Hình 1.3. Con đƣờng tạo thành RNAi. a, b: siRNA; c: miRNA
(nguồn: Dykxhoorn et al., 2003)
Phần lớn miRNA thực vật điều khiển đích của chúng bằng cách cắt mRNA trực tiếp ở vùng mã hóa (Bartel và Bartel, 2003; Bartel, 2004). Một vài miRNA thực vật được chứng minh là mấu chốt trong sự phát triển lá và ra hoa thông qua gen đích là các nhân tố phiên mã liên quan (Reinhart et al., 2002; Bartel và Bartel, 2003). Khác với nhân tố phiên mã, miRNA có thể nhắm tới một giới hạn phiên mã rộng, quy định sự phát triển theo hướng đặc hiệu mô hoặc phản ứng với một giới hạn áp lực môi trường (Jones-Rhoades và Bartel, 2004; Adai et al., 2005). Các kiểu biểu hiện khác nhau và sự phong phú tiềm năng gen đích mRNA gợi ý rằng miRNA có thể điều khiển nhiều quá trình sinh lý và có thể đóng một vai trò trực tiếp trong sự di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ở thực vật (He và Hannon, 2004; Kidner và Martienssen, 2005).
Con đường làm câm gen thứ ba liên quan tới sự methyl hóa phân tử ADN và sự ức chế phiên mã. Cơ chế ức chế biểu hiện gen này lần đầu tiên được khám phá trên thực vật, khi cấu trúc đoạn gen chuyển và RNA virus có xu hướng methyl hóa ADN tạo nên trình tự nucleotide đặc hiệu (Jones et al., 2001; Mette et al., 2000; Wassenegger et al., 1994). Năm 2002, khi nghiên cứu sự sinh sản của nấm men, Volpe và cs đã quan sát thấy sự hình thành sợi tạp sắc ở xung quanh vùng tâm động được liên kết với siRNA (Volpe et al., 2002). Năm 2003, Zilberman và cs đã phát hiện sự methyl hóa ADN thông qua siRNA trên thực vật được liên kết với biến đổi histone (Zilberman et al., 2003). Một vai trò quan trọng của sự câm gen ở mức độ nhiễm sắc thể là bảo vệ genome tránh những biến đổi gây ra bởi transposon (Baulcombe, 2004).
1.3.2. Ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây trồng kháng virus (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Việc chuyển gen nhằm tạo ra những giống cây trồng có khả năng kháng virus bằng cách sử dụng chính các yếu tố gây bệnh (pathogen-derived resistance - PDR) có nguồn gốc từ virus đó để chuyển vào cây trồng đang được xem là biện pháp có hiệu quả nhất để kiểm soát bệnh virus hại cây trồng (Satyajit et al., 2014). Biện pháp này đã giúp tạo ra nhiều loài cây trồng có khả năng kháng lại virus (Simón- Mateo and García, 2011).
Trong các kỹ thuật chuyển gen, RNAi được xem là một trong những kỹ thuật đem lại nhiều triển vọng và được ứng dụng trong việc tạo ra các giống cây trồng chuyển gen có khả năng kháng virus. Cho đến nay, đã có nhiều loại cây trồng chuyển gen kháng nhiều loại virus khác nhau được tạo ra bằng kỹ thuật RNAi thông qua việc chuyển gen mã hóa cho các protein (CP, Nib, Pro,…) của chính virus đó như: kháng Potato virus Y (Waterhouse et al., 1998; Smith et al., 2000), Barley yellow dwarf virus – PAV (BYDV-PAV) (Wang et al., 2000), Curcumber mosaic virus (CMV) (Kalantidis et al., 2002), Tobaco mosaic virus (TMV) (Kai et al.,
2005); Curcumber green mottle mosaic virus (CGMMV) (Park et al., 2005), Tobacco streak virus (TSV) (Pradeep et al., 2012), Rice stripe virus (Zhou et al.,
2012), African cassava mosaic virus (ACMV) (Vanitharani et al., 2003; Ruiz-Ferrer & Voinnet, 2007), Cassava brown streak disease (CBSD) (Patil et al., 2011), Tomato yellow leaf curl virus (TYLC) (Fuentes et al., 2006), Rice tungro bacilliform virus (RTBV) (Tyagi et al., 2008), Citrus tristeza virus (CTV) (López et
al. 2010), Potato spindle tuber viroid (PSTVd) (Schwind et al., 2009),… Trong các nghiên cứu này, người ta thường sử dụng cấu trúc RNAi chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều để chuyển vào cây. Cấu trúc RNAi này sẽ được biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen, từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây.
Hiệu quả làm câm gen đạt được cao nhất khi cấu trúc hpRNA được lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) (Smith et al., 2000; Wesley et al., 2001). Năm 2007, Shinichiro Kamachi và cs đã tạo được một số dòng thuốc lá chuyển gen có khả năng kháng virus CGMMV khi chuyển cấu trúc ihpRNA chứa gen mã hóa cho protein vỏ của virus CGMMV, hiệu quả kháng đối với CGMMV đạt 85,7% ở thế hệ T2. Khi phân tích RNA trong các dòng cây chuyển gen, các nhà khoa học đã xác định sự có mặt của các siRNA (Shinichiro et al., 2007). Cũng năm này, Bonfim và cs đã tạo được một dòng cây đậu chuyển gen kháng Bean golden mosaic virus (BGMV), hiệu quả kháng đạt được 93% (Bonfim et al., 2007). Nói chung, sự có mặt của các siRNA đã kìm hãm sự nhân lên của virus trong các tế bào của cây chuyển gen, từ đó làm chậm sự tích lũy virus, làm chậm hoặc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh (Gottula et al., 2009).
Cho đến nay, đã có nhiều loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus được công nhận và trồng thương mại như: đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (PRSV) đã được công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng đồng thời ba loại virus CMV, WMV (Watermelon mosaic virus) và ZYMV (Zucchini yellow mosaic virus) đã được công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng CMV đã được công nhận và trồng ở Trung Quốc,… Ngoài ra, rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để được công nhận là giống cây trồng thương mại như: Sắn
chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); khoai tây chuyển gen kháng đồng thời ba loại virus Potato virus X (PVX), Potato virus Y (PVY), Potato leafroll virus