Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58C1 chứa plasmid pCB-
gusplus do Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp. pCB-gusplus có cấu trúc gus-intron nên dễ dàng hơn trong việc kiểm tra cây chuyển gen bằng phản ứng nhuộm màu (hình 2.1)
Hình 2.1. Sơ đồ vector pCB-gusplus
Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58C1 chứa plasmid
pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro do Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp. pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro mang cấu trúc RNAi chứa tổ hợp 3 đoạn có độ bảo thủ cao thuộc các gen CP (206 bp), Nib (187 bp) và HCpro (228 bp) của virus PRSV-p trên mẫu đu đủ nhiễm PRSV được thu thập tại Lý Nhân (hình 2.2).
Hình 2.2. Sơ đồ vector pK7GWIWG2(II)/CP-Nib-HCpro
(Nguồn: Phòng Công nghệ tế bào thực vật, viện Công nghệ Sinh học)
2.1.3. Dụng cụ, thiết bị, vật tƣ
Panh, kéo, dao cắt, buồng cấy vô trùng, pipetman, cân phân tích, tủ sấy, hệ thống giàn đèn, nồi hấp tiệt trùng, máy đo pH, máy đo OD, máy khuấy từ,... sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy nghiền mẫu Retsch, máy điện di Powerpac300 (Bio-Rad, Mỹ), Máy soi ADN (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), Máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Votex (Minishaker, IKA, Đức), máy ly tâm lạnh (Eppendorf, Sigma), hệ thống giàn đèn nuôi cấy mô tế bào cùng với các trang thiết bị khác sử dụng trong thí nghiệm biến nạp, đánh giá, phân tích cây chuyển gen.
Giá thể trồng cây TN1 do Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, Trung tâm nghiên cứu phân bón và dinh dưỡng cây trồng sản xuất.
2.1.4. Hóa chất
Kit tách chiết RNA (Trizol Reagents Kit), bộ hóa chất sử dụng cho RT-PCR (Cloned AMV Reverse Transcriptase Kit) (Invitrogen).
Maker ADN 1kb (Fermentas).
Môi trường MS cơ bản bao gồm các muối đa lượng và vi lượng, các chất hữu cơ và vitamin theo Murashige và Skoog (1962), môi trường nuôi khuẩn LB, đường sucrose, agar, các chất kích thích sinh trưởng như: BAP, IBA, NAA, Kinetin, GA3, các loại kháng sinh như Kanamycin (Km), Rifamycine, Cefotaxime (Cefo),...
Các hóa chất thông dụng khác như: Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, Tris- HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCL2, Ethanol 70%, X-gluc, nước cất, nước khử ion, Taq ADN polymerase, dNTPs…. của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech,…
Các thí nghiệm được tiến hành trên trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất có tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.5. Địa điểm
Các thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm trong luận án được bố trí theo sơ đồ hình 2.3. Các thí nghiệm được chia làm 4 giai đoạn, giai đoạn 1: xây dựng quy trình tái sinh ở cây dưa hấu; giai đoạn 2: xây dựng quy trình chuyển gen gus vào cây dưa hấu thông qua chuyển cấu trúc gus-intron; giai đoạn 3: chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào cây dưa hấu; giai đoạn 4: phân tích cây chuyển gen.
2.2.1. Xây dựng quy trình tái sinh in vitro cây dƣa hấu
Các thí nghiệm được bố trí ở điều kiện: nhiệt độ: 25 - 27oC; thời gian chiếu sáng: 8/16h và cường độ chiếu sáng 2000 lux; mẫu cấy được đặt nằm ngang trên bề mặt môi trường.
Các công thức thích hợp của thí nghiệm trước sẽ được chọn để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.1.1. Khử trùng mẫu
Việc khử trùng mẫu được tiến hành theo phương pháp của Akashi và cs (2005) có cải tiến. Các bước tiến hành như sau:
Trước hết, hạt dưa hấu được rửa sạch các chất bám bề mặt bằng xà phòng, rửa lại dưới vòi nước sạch cho đến khi hết bọt xà phòng bám dính trên bề mặt hạt. Sau đó hạt được đưa vào bình thủy tinh sạch và khử trùng bề mặt trong buồng cấy vô trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, sau đó ngâm trong dung dịch Javel thương mại ở
Xây dựng quy trình tái sinh cây dƣa hấu
Xây dựng quy trình chuyển gen gus vào cây
dƣa hấu
Tạo dòng cây dƣa hấu chuyển gen kháng PRSV (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phân tích cây chuyển gen
Phân tích PCR, RT-PCR
Đánh giá tính Kháng PRSV Chuyển cấu trúc Gus-
plus
Thông qua A.tumefaciens
Chuyển cấu trúc RNAi/Cp-Nib-HC-pro Thông qua A.tumefaciens
nồng độ 30% trong 20 phút rồi rửa lại 3 - 5 lần bằng nước cất khử trùng. Hạt đã khử trùng bề mặt được bóc vỏ, phôi hạt được tiếp tục khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, sau đó ngâm trong dung dịch Javel 5% có bổ sung 0,05% Tween-20 trong 5 phút rồi rửa lại 3 – 5 lần bằng nước cất khử trùng và được thấm khô trên giấy thấm khử trùng. Phôi hạt sau khi khử trùng được cho nảy mầm trên môi trường MS có bổ sung 30% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,8, nuôi trong tối ở 25 - 27oC. Sau 3, 5, 7, 9 ngày nảy mầm, các mảnh lá mầm được cắt thành các mảnh nhỏ kích thước khoảng 1 – 2 mm2 và được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.1.2. Tối ƣu quá trình tạo đa chồi từ lá mầm
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của tuổi lá mầm, vị trí mảnh lá mầm đến khả năng tái sinh chồi dưa hấu
Các mảnh lá mầm của 4 dòng dưa hấu nghiên cứu ở các độ tuổi 3, 5, 7, 9 ngày tuổi được cắt viền xung quanh lá, sau đó được cắt làm 2 phần trong đó có 1 phần gần gốc lá mầm, phần còn lại gần ngọn lá mầm để nghiên cứu khả năng tái sinh chồi của chúng trên môi trường tái sinh MS có bổ sung 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l IBA, 30% sucrose và 0,8% agar.
Tỷ lệ phát sinh đa chồi của các mảnh lá mầm ở các độ tuổi (số chồi tạo thành / số mảnh), vị trí tái sinh chồi (phần gần gốc lá mầm / gần ngọn lá mầm), chất lượng chồi được đánh giá sau 4 – 6 tuần
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng tái sinh đa chồi dưa hấu
Các mảnh lá mầm dưa hấu ở ngày tuổi và vị trí tái sinh tốt nhất được cắt thành các mảnh 1 – 2 mm2, đặt trên môi trường MS có bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8 g/l agar, 0,5 mg/l IBA và BAP ở các nồng độ khác nhau (Bảng 2.1). Số mảnh lá mầm phát sinh chồi/số chồi tạo thành/số mẫu cấy ban đầu, chất lượng chồi được đánh giá sau 4 – 6 tuần.
Bảng 2.1. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh có bổ sung IBA và BAP Tên môi trƣờng Nồng độ BAP (mg/l)
TS0 0 TS1 0,5 TS2 1,0 TS3 1,5 TS4 2,0 TS5 2,5 TS6 3,0 TS7 3,5 TS8 4,0 TS9 7,0 TS10 9,0
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tổ hợp BAP, IBA và NAA đến khả năng tái sinh đa chồi dưa hấu
Các mảnh lá mầm dưa hấu ở ngày tuổi và vị trí tái sinh tốt nhất được cắt thành các mảnh 1 – 2 mm2, đặt trên môi trường tái sinh tốt nhất (thí nghiệm 2) có bổ sung NAA ở các nồng độ 0,1; 0,2 mg/l trong 4 – 6 tuần.
Bảng 2.2. Thành phần các loại môi trƣờng tái sinh có bổ sung IBA, BAP, NAA Tên môi trƣờng Nồng độ NAA (mg/l)
TS11 0,1
TS12 0,2
Chỉ tiêu quan sát: Số mảnh lá mầm phát sinh chồi/số chồi tạo thành/số mẫu cấy ban đầu, chất lượng chồi.
2.2.1.3. Ảnh hƣởng tổ hợp của IBA và GA3 đến khả năng kéo dài chồi dƣa hấu
Các chồi tái sinh được cấy vào trong môi trường MS có bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8 g/l agar, 0,1 mg/l IBA, 580 mg/l MES và GA3 ở các nồng độ 0; 0,3; 0,5;
0,7 mg/l trong 2 tuần.
Bảng 2.3. Nồng độ GA3 sử dụng trên MT kéo dài chồi Tên môi trƣờng Nồng độ GA3 (mg/l)
KC0 0
KC1 0,3
KC2 0,5
KC3 0,7
Các chồi được cấy vào trong môi trường thạch. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chỉ tiêu quan sát: Số chồi được kéo dài / mức độ kéo dài chồi / số chồi cấy, chất lượng chồi sau kéo dài.
2.2.1.4. Ảnh hƣởng của nồng độ IBA đến khả năng tạo rễ cho chồi dƣa hấu
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh, có đầy đủ thân, lá và rễ để chuyển ra trồng ngoài tự nhiên. Cây con phải khoẻ mạnh, sức đề kháng tốt nhằm nâng cao sức sống khi ra môi trường bên ngoài.
Các chồi sau giai đoạn tái sinh hoặc kéo dài, kích thước > 1cm, khỏe mạnh, mập mạp có thể được chuyển sang môi trường ra rễ MS có bổ sung IBA với các nồng độ 0,0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 mg/l hoặc môi trường ½ MS có bổ sung 0,1 mg/l IBA. Các chồi được cấy thẳng đứng trong môi trường nuôi cấy. Số chồi được ra rễ / số chồi cấy, chất lượng rễ (số lượng, độ dài, kích thước) được đánh giá sau 2-3 tuần.
Bảng 2.4. Nồng độ IBA sử dụng trên môi trƣờng tạo rễ Tên môi trƣờng Nồng độ IBA (mg/l)
RR0 (MS) 0 RR1 0,1 RR2 0,2 RR3 0,3 RR4 0,5 RR5 (1/2MS) 0,1
2.2.1.5. Ảnh hƣởng của giá thể tiếp nhận đến khả năng thích ứng cây ra môi trƣờng
Mục đích của thí nghiệm này là tìm ra giá thể thích hợp cho cây phát triển. Thời gian tối thiểu để cây con thích nghi được với môi trường sống là 2 – 3 tuần.
Bảng 2.5. Thành phần các loại giá thể thích ứng cây in vitro
Công thức Thành phần giá thể Tỷ lệ GT1 Giá thể trồng cây : Trấu hun 1: 1
GT2 Trấu hun : Cát đen 1 : 1
Chỉ tiêu quan sát: tỷ lệ cây sống ngoài vườn ươm, sức sinh trưởng của cây. 2.2.1.6. Thu thập và xử lí số liệu tái sinh
Để đánh giá và tìm được môi trường tái sinh cây dưa hấu tốt nhất, các thí nghiệm được đánh giá theo những công thức sau:
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = Tổng số mẫu tạo chồi
x 100 Tổng số mẫu cấy
Số chồi TB/ mẫu = Tổng số chồi Tổng số mẫu tạo chồi
Tỷ lệ số chồi ra rễ (%) = Tổng số chồi ra rễ
x 100 Tổng số chồi nuôi cấy
Số rễ TB/ chồi = Tổng số rễ Tổng số chồi ra rễ
Các số liệu được tính toán theo phương pháp phân tích thống kê toán học. Quá trình xử lí được thực hiện trên máy vi tính theo chương trình Excel 5.0 và được mô phỏng bằng các bảng và hình.
2.2.2. Đánh giá ảnh hƣởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào cây dƣa hấu thông qua chuyển gen gus
2.2.2.1. Xác định ngƣỡng sống sót của cây dƣa hấu trên môi trƣờng chứa chất chọn lọc kanamycin (Km)
Để đánh giá ảnh hưởng của các nồng độ chất chọn lọc Km đến khả năng sinh trưởng, phát triển của chồi dưa hấu, các chồi dưa hấu D2 (không chuyển gen) đã được nuôi trên môi trường có bổ sung các nồng độ Km khác nhau (0, 50, 100, 150, 200mg/l) trong 2 – 4 tuần. Bảng 2.6. Các nồng độ Km sử dụng Tên môi trƣờng Nồng độ Km (mg/l) Km0 0 Km1 50 Km 2 100 Km 3 150 Km 4 200
2.2.2.2. Chuẩn bị vật liệu chuyển gen
Hạt dưa hấu được khử trùng như trong mục 2.2.1.1. và được cho nảy mầm trên môi trường MS, 30% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,8 nuôi trong tối. Sau 5 ngày, các mảnh lá mầm được cắt thành những mảnh có kích thước khoảng 1 – 2 mm2
và được sử dụng làm vật liệu chuyển gen.
2.2.2.3. Thành phần các loại môi trƣờng dùng cho nghiên cứu Bảng 2.7. Thành phần các loại môi trƣờng
Tên môi trƣờng Công thức
Nuôi khuẩn (LB) 10 g/l trypton, 10 g/l NaCl, 5 g/l extract yeast, pH 7,0 Hòa tan khuẩn
(HTK) MS, 200 M AS, 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l IBA, pH 5,6 Đồng nuôi cấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(ĐNC)
MS, 200 M AS, 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l IBA, 30% sucrose, 0,8% agar, pH 5,6
Tái sinh chồi (TS) MS, 1,5 mg/l BAP, 0,5 mg/l IBA, 30% sucrose, 0,8% agar, 200 mg/l km, 500 mg/l cefo, pH 5,6
Kéo dài chồi (KD) MS, 0,1 mg/l IBA, 0,5 mg/l GA3, 30% sucrose, 0,8% agar, 150 mg/l km, 500 mg/l cefo, pH 5,6
Tạo rễ cho chồi (RR)
MS, 0,1 mg/l IBA, 30% sucrose, 0,8% agar, 100 mg/l km, 250 mg/l cefo, pH 5,6
2.2.2.4. Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens
Một ngày trước khi biến nạp, tiến hành nuôi lắc một khuẩn lạc vi khuẩn
A.tumefaciens CV58C1 chứa vector pCB-gusplus trong 5 ml LB lỏng có bổ sung 40
mg/l rifamycin, 50 mg/l Spectinomycine, 50 mg/l Streptomycine ở 28oC trong 6 - 8 giờ với tốc độ lắc 200 v/p. Sau đó, hút 1 ml dịch khuẩn vừa nuôi chuyển sang bình chứa 50 ml LB lỏng có bổ sung các kháng sinh như trên để tiến hành nuôi lắc qua đêm cho đến khi đạt đến OD600= 0,7 – 1,0. Tiếp theo, lấy 4 – 5 ml dịch khuẩn trên nuôi trong 30 ml LB lỏng không bổ sung kháng sinh, nuôi lắc cho đến khi đạt các nồng độ OD khác nhau trước khi tiến hành biến nạp.
Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ vi khuẩn thích hợp nhất cho biến nạp
Sáu nồng độ vi khuẩn đã được thử nghiệm (OD600= 0,0; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9; 1,1) để đánh giá ảnh hưởng của chúng đến hiệu quả quá trình chuyển gen vào 30 mảnh lá mầm của các dòng dưa hấu nghiên cứu. Vi khuẩn được thu nhận bằng ly
tâm với vận tốc 4500 v/p trong 15 phút và sau đó được hòa tan trong 50 ml môi trường hòa tan khuẩn để tiến hành biến nạp.
2.2.2.5. Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
Thí nghiệm 1: Xác định ngưỡng thời gian nhiễm khuẩn thích hợp nhất cho biến nạp
Các mảnh lá mầm được cắt thành những mảnh có kích thước khoảng 1 – 2 mm2, sử dụng đầu lưỡi dao để tạo thêm các vết thương trên mặt lá rồi ngâm vào dung dịch hòa tan khuẩn trong 15, 30, 45 phút. Sau đó, các mảnh lá được thấm khô và chuyển vào môi trường đồng nuôi cấy.
Thí nghiệm 2: Xác định ngưỡng thời gian đồng nuôi cấy thích hợp nhất cho biến nạp
Sau 2, 3, 4, 5 ngày, các mảnh lá mầm được rửa khuẩn trong nước cất khử trùng có bổ sung 500 mg/l cefo, thấm khô và chuyển vào môi trường tái sinh. Sau 6 tuần, các chồi hoặc cụm chồi thu được được chuyển sang môi trường tạo rễ hoặc môi trường kéo dài chồi trong 2 – 3 tuần tùy thuộc vào độ lớn của chồi. Các cây ra rễ trong môi trường chọn lọc sẽ được chuyển sang giá thể trấu hun : cát (1 : 1) trước khi tiến hành đánh giá cây chuyển gen.
Chỉ tiêu đánh giá: Tỷ lệ chuyển gen (H) được tính theo tỷ lệ giữa tổng số cây kiểm tra cho kết quả PCR dương tính với tổng số mẫu biến nạp ban đầu.
H (%) = (tổng số cây PCR dương tính với gen gus hoặc nptII / tổng số mẫu biến nạp) x 100
2.2.2.6. Kiểm tra biểu hiện của gen gus
Biểu hiện tạm thời hay bền vững của gen gus được phân tích theo phương pháp của Jefferson (1987). Các mảnh lá mầm sau 3 ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn Agrobacterium hoặc các bộ phận của chồi dưa hấu được hình thành trên môi trường chọn lọc được ngâm trong dung dịch X-gluc (Tris/NaCl pH7,2 + 10 mg/ml X-gluc + 10% Triton X-100) và ủ ở 37oC trong 24 – 36h. Mảnh lá hoặc mô sẽ được
tẩy hết diệp lục nhiều lần với cồn 70% và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Mẫu được chuyển gen gus sẽ có màu xanh chàm đặc trưng. Mức độ biểu hiện của gen gus được đánh giá thông qua mức phân bố và độ đậm của màu xanh chàm trên các mô kiểm tra.
2.2.2.7. Phân tích cây chuyển gen thông qua phản ứng PCR
i. Tách chiết ADN tổng số
Tiến hành tách ADN tổng số theo phương pháp của Gawel và Jarett (1991) có cải tiến.
Thành phần đệm rửa bao gồm: Tris-HCl 1M, pH 8 (100mM), EDTA 0,5M, pH 8 (5 mM), Sorbitol (0,35 M), Na2HPO4 (0,4%), nước khử ion, khử trùng.
Thành phần đệm chiết: CTAB (6%), NaCl 5 M (1,4 M), EDTA 0,5 M, pH 8 (20 mM), Tris-HCl 1 M, pH 8 (100 mM), -MercaptoEthanol (0,1%), nước khử ion, khử trùng.
Quy trình tách ADN như sau:
Bước 1.Nghiền nhanh 0,2 g lá bằng cối chầy sứ trong nitơ lỏng cho đến khi tạo thành bột thật mịn, sau đó chuyển ngay vào ống Eppendorf 2 ml, giữ trong đá; (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 2.Bổ sung 1 ml đệm rửa, lắc mạnh trong 40 giây, ly tâm (14000 vòng/phút, 4oC, 7 phút); Loại dịch nổi và lặp lại bước 2-3 từ 1 đến 2 lần;
Bước 3.Bổ sung 800 l đệm chiết, lắc đều và giữ ở 65oC trong thời gian 30 phút đến 1 tiếng; Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10 phút;
Bước 4.Bổ sung 800 l Chloroform : isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc