H F
Dân số tăng nhanh cùng với sự phát triển đô thị hóa và mức thu nhập ngày càng cao ở nhiều nước đang phát triển là nguyên nhân dẫn đến sự tăng nhu cầu đối với các sản phẩm từ thịt, sữa và trứng, ngũ cốc,… trong thời gian tới. Tính đến năm 2020, nhu cầu trên toàn thế giới đối với các sản phẩm từ thịt cũng sẽ tăng hơn 55% so với mức tiêu thụ hiện tại, mà phần lớn là ở các nước đang phát triển. Do vậy, nhu cầu đối với các loại thức ăn chăn nuôi, ngũ cốc mỗi năm cũng sẽ tăng theo và ở mức 3% đối với các nước đang phát triển và 0,5% đối với các nước phát triển. Tính trung bình, để tạo ra 1kg thịt thì cần khoảng 3 kg thức ăn chăn nuôi làm từ ngũ cốc và 1kg sữa thì cần khoảng 1kg thức ăn tương ứng (James C, 2006). Bên cạnh đó nhu cầu đối với lương thực và thực phẩm hàng ngày cho con người cũng đang tăng lên không ngừng. Theo dự đoán đến năm 2050 thế giới sẽ có khoảng 9,3 tỷ người, yêu cầu đối với tổng sản lượng lương thực và thực phẩm phải đạt tốc độ tăng trưởng ít nhất 40% so với hiện nay, điều đó thật khó thực hiện trong tình trạng sản xuất như hiện nay khi diện tích đất canh tác ngày một giảm mạnh do xu hướng công nghiệp hóa, đô thị hóa ngày một tăng; nguồn nhân lực trực tiếp tham gia vào sản xuất nông nghiệp ngày một giảm dẫn đến việc mở rộng diện tích canh tác là rất khó thực hiện. Bên cạnh đó, những tác động tiêu cực của nạn mất rừng, ô nhiễm môi trường và biến đổi khí hậu đến đời sống và quá trình sản xuất nông nghiệp: hạn hán, lũ lụt, sạt lở đất, sói mòn, dịch bệnh,… cũng ngày một tăng. Do đó, việc sản xuất cây trồng biến đổi gene là hết sức cần thiết. Có 3 lý do chính để chúng ta lựa chọn việc phát triển các sản phẩm chuyển gen: (1) Chuyển gen để bảo vệ cây trồng tốt hơn khỏi dịch, bệnh, côn trùng gây hại cũng như bảo vệ cây trước những điều kiện khắc nghiệt của thời tiết (hạn hán, ngập úng,..), từ đó mà năng suất cây trồng sẽ được nâng cao; (2) Chuyển gen vào cây trồng để giảm lượng thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu, phân bón hóa học, … từ đó góp phần bảo vệ môi trường sống, chống biến đổi khí hậu; (3) Chuyển gen vào cây trồng để tăng sản lượng và chất lượng lương thực, từ đó mà lợi nhuận nông nghiệp cũng được nâng cao.
Ngày 21/06/2010, Chính phủ Việt Nam đã ra Nghị định về An toàn Sinh học đối với sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di truyền và sản phẩm của sinh vật biến đổi gen, điều này cho thấy sự quan tâm của Chính phủ Việt Nam đối với vấn đề này. Trong Nghị định nêu rõ các quy định về các vấn đề liên quan đến việc nghiên cứu, sản xuất và sử dụng các sinh vật biến đổi gen và các sản phẩm của chúng như việc đánh giá rủi ro và quản lý các rủi ro của sinh vật biến đổi gen đối với môi trường cũng như sức khỏe của con người; các quy định về vấn đề nghiên cứu khoa học và
phát triển công nghệ về sinh vật biến đổi gen và các sản phẩm của chúng; các quy định về việc khảo nghiệm sinh vật biến đổi gen; các quy định về việc cấp giấy chứng nhận an toàn sinh học; các quy định về việc sinh vật biến đổi gen đủ điều kiện sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi; các quy định về việc sản xuất, kinh doanh, xuất nhập khẩu, vận chuyển, lưu giữ sinh vật biến đổi gen và sản phẩm của chúng cũng như các quy định về thông tin của sinh vật biến đổi gen và thông tin của các sản phẩm của sinh vật biến đổi gen (Lê Trần Bình và cs, 2003).
Trong nhiều năm qua, việc nghiên cứu, ứng dụng cây trồng biến đổi gen trong sản xuất nông nghiệp đã được Việt Nam rất chú trọng. Đã có nhiều công bố chuyển gen thành công ở nhiều loại cây trồng khác nhau như hoa đồng tiền, cây thuốc lá, đu đủ, cam, lúa, mía, xoan, hông, bông, dưa hấu,…Năm 2010, Việt Nam chính thức cho phép trồng thử nghiệm trên diển rộng một số loại cây trồng chuyển gen, đánh dấu bước ngoặt quan trọng đối với sự phát triển cây trồng chuyển gen tại Việt Nam. Cùng với sự phát triển của các loại cây trồng chuyển gen nói chung, các dòng dưa hấu chuyển gen kháng PRSV trong nghiên cứu này cũng rất có triển vọng được nghiên cứu và phát triển thành giống thương mại trong thời gian tới.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN
1.1. Đã xây dựng được quy trình tái sinh in vitro 4 giống dưa hấu nghiên cứu.
Mảnh lá mầm 5 ngày tuổi là thích hợp cho việc tái sinh ở dưa hấu. Các vùng khác nhau trên lá mầm cho hiệu quả tái sinh cũng khác nhau, vùng gần gốc lá mầm cho hiệu quả tái sinh cao hơn các vùng khác. Môi trường thích hợp để tái sinh chồi là MS bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, 0,5 mg/l IBA, 1,5 mg/l BAP. Các chồi tạo thành có thể được kéo dài trên môi trường MS bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, 0,1 mg/l IBA, 580mg/l MES và 0,5 mg/l GA3 và được ra rễ trên môi trường MS bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, 0,1 mg/l IBA. Các cây hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra bầu trấu hun : cát (1 : 1) để thích nghi với điều kiện môi trường.
1.2. Đã tối ưu được quy trình chuyển gen gus thông qua A.tumefaciens vào lá mầm dưa hấu: ngưỡng kanamycin 100 mg/l, nồng độ vi khuẩn OD600 = 0,7, thời gian biến nạp 30 phút và thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày trong tối được lựa chọn để chuyển gen gus vào dưa hấu.
1.3. Đã chuyển thành công gen gus vào 2 giống dưa hấu D2 và L2, hiệu suất
chuyển gen gus thu được đối với giống L2 là 1,87% và D2 là 1,85%. Biểu hiện bền vững của gen gus ở trong cây chuyển gen khá mạnh, màu xanh chàm biểu hiện ở cả lá, thân, hoa, rễ và đỉnh chồi của cây chuyển gen. Giống L1 và D1 không có khả năng tiếp nhận đoạn gen chuyển, hiệu suất chuyển gen là 0%.
1.4. Đã chuyển thành công cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào 2 giống dưa hấu D2 và L2 thông qua chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Hiệu suất chuyển gen đạt được là 2,47% (D2) và 1,81% (L2). Phân tích tính kháng PRSV sau 45 ngày lây nhiễm virus nhân tạo ở các dòng dưa hấu T0 thu được 2 dòng dưa hấu có khả năng kháng hoàn toàn với PRSV trong đó 1 dòng thuộc dưa hấu D2 (D2.7) và 1 dòng thuộc dưa hấu L2 (L2.5).
1.5. Kết quả phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển trong cây chuyển gen và phân tích tính kháng PRSV sau 45 ngày lây nhiễm virus nhân tạo ở các cây T1 thu
được 5 cây có khả năng kháng hoàn toàn với PRSV, trong đó có 2 cây thuộc dòng L2.3 (tỷ lệ kháng là 33,33%) và 3 cây thuộc dòng D2.7 (tỷ lệ kháng là 42,87%). Như vậy, cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro đã được di truyền ổn định từ thế hệ T0 sang T1.
2. ĐỀ NGHỊ
2.1. Tiếp tục phân tích khả năng di truyền của đoạn gen chuyển và tính kháng virus PRSV của các dòng dưa hấu ở các thế hệ tiếp theo và phân tích tính kháng bệnh đối với các chủng PRSV-w khác tại Việt Nam để lựa chọn những dòng có triển vọng phục vụ công tác chọn giống.
2.2. Nghiên cứu đánh giá mức độ an toàn sinh học của các dòng dưa hấu chuyển gen kháng PRSV.
2.3. Thiết kế cấu trúc RNAi có khả năng bất hoạt đồng thời nhiều loại virus khác nhau tại Việt Nam gây bệnh trên dưa hấu.
SUMMARY
1. Name of thesis:
Generation of transgenic virus-resistant watermelon (Citrulus lanatus Thumb)
2. Objectives
- Build up process of transgenic and regeneration of Vietnam watermelon.
- Create a new transgenic line of watermelon resistant against Vietnam PRSV viruses.
3. Contents:
3.1. Collecting watermelon varieties.
3.2. Building up an in vitro regeneration process of watermelon varieties collected. 3.3. Building up a transgenic process to watermelon varieties based on gus in PCB- gusplus vector by Agrobacterium method.
3.4. Creating a new transgenic watermelon line resistant against PRSV virus by
Agrobacterium tumefaciens CV58C1 containing pK7GWIW2 (II) / CP-Nib-HCpro
vector.
3.5. Analyzing the new transgenic plants and assessing the resistance against Vietnam PRSV. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4. Results:
4.1. Managed to build up in vitro regeneration process of the four Vietnam watermelon varieties. The cotyledons pieces, 5 days-old, were suitable for regeneration. Different pieces of cotyledons showed different regeneration results; pieces which were near the foot of cotyledons had better regeneration efficiency than those out of cotyledons foot. MS added 3% sucrose, 0.8% agar, 0.5 mg / l IBA, 1.5 mg / l BAP was favorable medium for shoot regeneration. The shoots elongated in MS added 3% sucrose, 0.8% agar, 0.1 mg / l IBA, 580mg / l MES and 0.5 mg / l
GA3 and rooted in MS added 3% sucrose, 0.8% agar, 0.1 mg / l IBA. The new plants will be moved to small plastic bag with burnt husk and sand (1: 1) to get them adapted to new medium.
4.2. Succeeded in building up transgenic process of gus by A. Tumefaciens to
watermelon cotyledons: 5-day-old watermelon cotyledons were cut into small pieces about 1 - 2mm2, then soaked into solution of OD600 = 0.7 in 30 minutes. After that cotyledons pieces were dried with absorbent piece and put up in next medium (MS added 3%sucrose, 200MAS, 1,5mg/l BAP, 0,5mg/l IBA, 0,8% agar), kept in the darkness. After 3 days, the cotyledon pieces were washed in distilled water added with 500 mg / l cefo, then dried and taken to regeneration medium (MS added 3% sucrose, 1.5 mg / l BAP, 0, 5 mg / l IBA, 0.8% agar, 200 mg / l Km and 500 mg / l cefo). After 6 weeks, the shoots and shoots group would be brought to rooting-favorable medium (MS added 0.1 mg / l IBA, 100 mg / l Km, 250mg / l cefo) or shoot-favorable medium (MS added 0.1 mg / l IBA, 0.5 mg / l GA3, 150 mg / l Km, 500 mg / l cefo) in 2-3 weeks depending on shoots size. The new plants, then, would be taken to plastic bag with burnt husk: black sand (1:1) in light room or cultivation chamber before assessment.
4.3. When analyzing gus transgenic plants by PCR reaction with nptII gene and dyeing tissue of transgenic plants with X-gluc, the performance obtained in transgenic watermelon varieties ranged from 0 to 1 , 87%. Performance of L1 and D1 was 0%, L2 1.87%, and D2 1.85%. In conclusion, the gus gene was successfully transferred into 2 watermelon varieties D2 and L2 byAgrobacterium tumefaciens containing PCB-guslus CV58C1 vector. Sustainability of GUS in transgenic plants was well expressed; dark green was found in the leaves, stems, flowers, roots and shoots head of transgenic plants.
4.4. Managed to transfer RNAi / Nib-CP-2 HCpro to the two watermelon varieties L2 and D2 by Agrobacterium tumefaciens CV58C1. The results of T0 generation transgenic plants by PCR and RT-PCR with Nib-CP HCpro showed positive,
respectively, 8/43 for D2 line and 5/36 for L2. Transgenic performance showed 2.47% (D2) and 1.81% (L2). The resistance of PRSV after 45 days of artificially affected in T0 showed positive for PCR and RT-PCR with Nib-CP gene and that 1/8 of D2 line (D2 .7) and 1/5 of L2 (L2.5) were completely resistant against PRSV. 4.5. The results of T1 transgenic plants by PCR and RT-PCR with Nib-CP HCpro showed positive; respectively 7/18 of D 2.7 and 6/23 of L2. Resistance of PRSV after 45 days of artificially affected in T1 plants showed that PCR was positive with CP-Nib-HCpro gene fragments and that 5new plants were completely resistant against PRSV. Of the 5 plants, 2 belonged to L2.3 line had resistance rate of 33.33% and 3 plants of D2.7 line of 42.87%). Of 13 studied watermelon plants, only one, belonged to L2.3 line, showed the highest expression of disease at 3, the remaining showed the highest expression at 2.
NHỮNG CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Nguyễn Thị Thanh Nga, Nguyễn Tường Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2010), Nghiên cứu quy trình tái sinh in vitro cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3B): 1-7, 2010
2. Nguyễn Thị Thanh Nga, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2012), Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.). Tạp chí Sinh học, 34(3):
389-396
3. Nguyễn Thị Thanh Nga, Đoàn Thị Thùy Linh, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Tạo dòng cây dưa hấu
(Citrullus lanatus Thumb.) chuyển gen kháng virus PRSV bằng kỹ thuật RNAi. (đang gửi đăng)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Abhary MK, Anfoka GH, Nakhla MK, Maxwell DP (2006) Post-transcriptional gene silencing in controlling viruses of the tomato yellow leaf curl virus complex. Arch Virol 151: 2349-2363.
2. Adai A, Johnson C, Mlotshwa S, Archer-Evans S, Manocha V, Vance V and Sundaresan V (2005) Computational prediction of miRNAs in Arabidopsis thaliana. Genome Research, 15: 78-91.
3. Adrian (2008) The Health Benefits of watermelon. website: http://www.elements4health.com/watermelon-and-arginine.html
4. Akashi K, Morikawa K and Yokota A (2005) Agrobacterium-mediated transformation system for the drought and excess light stress-tolerant wild watermelon (Citrullus lanatus). Plant Biotechnology 22 (1): 13–18.
5. Amarzguioui M, Holen T, Babaie E, Prydz H (2003) Tolerance for mutations and chemical modifications in a saran. Nucleic Acids Res 31(2):589-95.
6. Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall M, Matzke M, Ruvkun G, Tuschl T (2003) A uniform system for microRNA annotation. RNA 9(3):277-9.
7. Ananthakrishnan G, Xia X, Elman C, Singer S, Paris HS, Galon A, Gaba V (2003) Shoot production in squash (Cucurbita pepo) by in vitro organogenesis.
Plant Cell Reports, v.21, p.739-746.
8. Andika IB, Kondo H, Tamada T (2005) Evidence that RNA silencing-mediated resistance to beet necrotic yellow vein virus is less effective in roots than in leaves. Mol Plant Microbe Interact 18(3):194–204.
9. Anindya R, Chittori S, Savithri HS (2005) Tyrosine 66 of Pepper vein banding virus genome-linked protein is uridylylated by RNA-dependent RNA polymerase. Virology 5;336(2):154-62.
10.Asad S, Haris W A A, Bashir A, Zafar Y, Malik K A, Malik M N and Lichtenstein C P (2003) Transgenic tobacco expressing geminiviral RNAs are resistant to the serious viral pathogen causing cotton leaf curl disease. Archives
of Virology 148, 2341-2352.
11. Babadoost M, Islam S Z, Tian D, Pavon C, Hurt M, Swiader J M, Fouly H M, Ogutu M O, Walters S A, Honda Y (2000) Ressearch Program on Pumpkin Diseases in Illinois. Website: http://veg-fruit.cropsci.uiuc.edu/.
12.Bartel B, and Bartel D P (2003) MicroRNAs: At the root of plant development.
Plant Physiol. 132, 709–717. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
13.Bartel DP (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function, Cell. 116(2):281-97.
14.Bateson MF, Lines RE, Peter R, Worawan C, Ha CV, Gibbs AJ, Dale JL (2002) On the evolution and molecular epidemiology of the potyvirus Papaya ringspot virus. J Gen Virol, 83, pp. 2575-2585.
15.Baulcombe D C (2004) RNA silencing in plants. Nature 431:356-63.
16.Bernsein E, Caudy AA, Hammond SM, Gannon GJ (2001) Role for abidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature, 409:363-366. 17. Bonfim K, Faria JC, Nogueira EO, Mendes EA, Aragão FJ (2007) RNAi-
mediated resistance to Bean golden mosaic virus in genetically engineered common bean (Phaseolus vulgaris). Mol Plant Microbe Interact. 2007 Jun;20(6):717-26.
18.Boulton MI (2002) Functions and interactions of mastrevirus gene products.
19.Carmell MA, Xuan Z, Zhang MQ, Hannon GJ (2002) The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev 16(21):2733-42.
20.Chen WS, Chiu CC, Liu HY, Lee TL, Cheng JT, Lin CC, Wu YJ, Chang HY (1998) Gene transfer via pollen-tube pathway for anti-fusarium wilt in watermelon. Biochem Mol Biol Int 46:1201-1209.
21.Chen WS, Chiu CC, Liu HY, Lee TL, Cheng JT, Lin CC, Wu YJ, Chang HY (1998) Gene transfer via pollen-tube pathway for anti-fusarium wilt in watermelon. Biochem Mol Biol Int 46:1201-1209.
22.Cho MA, Moon CY, Liu LR, Choi PS (2008) Agrobacterium – mediated transformation in citrullus lanatus. Biologia Plantarum 52(2): 365-369
23.Choi PS, Soh WY, Kim YS, Yoo Ook J and Liu JRta (1994) Genetic transformation and plant regeneration of watermelon using Agrobacterium tumefaciens. Plant cell Reports 13: 344-348.
24.Choi PS, Soh WY, Kim YS, Yoo Ook J and Liu JRta (1994) Genetic transformation and plant regeneration of watermelon using Agrobacterium tumefaciens. Plant cell Reports 13: 344-348.
25.Chu Hoàng Hà, Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình, 2009. Tạo cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus bằng kỹ thuật RNAi. Báo cáo Hội nghị quốc gia về sinh vật biến đổi gen và quản lý an toàn sinh học, Hà Nội 2009, p. 19-28.
26.Cogoni C, Romano N, Macino G (1994) Suppression of gene expression by homologous transgenes. Antonie Van Leeuwenhoek. 65(3):205-9.
27.Compton M E (1999) Dark pretreatment improves adventitious shoot organogenesis from cotyledons of diploid watermelon. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 58 : 185 – 188.
28.Compton M E, Gray D J (1993) Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature cotyledons of watermelon. Plant Cell Reports12: 61 - 65.