Các cây chuyển gen sẽ được kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chuyển thông qua chỉ thị kháng kháng sinh km và phản ứng PCR và RT-PCR, sau đó được kiểm tra tính kháng đối với virus thông qua lây nhiễm virus nhân tạo.
2.2.4.1. Kiểm tra nguồn cây bệnh sử dụng trong thí nghiệm lây nhiễm PRSV
Để có nguồn PRSV Việt Nam phục vụ cho thí nghiệm lây nhiễm virus nhân tạo, chúng tôi đã tiến hành thu thập các mẫu bầu bí bị bệnh và kiểm tra sự có mặt của PRSV thông qua phản ứng RT-PCR nhân gen mã hóa cho protein vỏ (CP) từ cDNA được tổng hợp từ nguồn RNA tổng số được tách chiết từ các mẫu lá bầu bí nhiễm bệnh. Phản ứng RT-PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu PRSV-Nib- F3: 5’-CTTGAGGAAGCTCCATTCAA-3’ và PRSV-CP-R1: 5’- GTTGACATCTTCCACTGTGT-3’. Đoạn gen nhân lên được có kích thước khoảng 1,2 kb. Phản ứng được tiến hành với chu kỳ nhiệt như sau: một chu kỳ 940
C trong 4 phút, 30 chu kỳ 940
C trong 1 phút, 520C trong 45 giây, 720C trong 90 giây. Thành phần phản ứng PCR nhân gen CP/PRSV như sau: Nước cất khử ion, khử trùng (14,3 l), Dung dịch đệm 10X (2,5 l), MgCl2 25 mM (2,5 l), dNTPs 10 mM (2l), mồi Nib-F3 10 pmol (1 l), mồi CP-R1 10 pmol (1 l), Taq polymerase (0,2 l), AND (1,5 l). Tổng thể thích phản ứng là 25 l.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8%, nhuộm với ethidium bromide và quan sát dưới đèn UV.
2.2.4.2. Phân tích cây chuyển gen thông qua PCR
Các dòng cây chuyển gen sau khi được trồng trên giá thể trấu hun 2-3 tuần sẽ được tách ADN tổng số để tiến hành PCR.
Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen đa đoạn CP-Nib-HCpro. Trình tự cặp mồi sử dụng là: PRSV-CP-Fi: 5’-
CACCATGCAACTCCTTCATTCA-3’ và PRSV-HC-Ri: 5’-
là 621 bp. Phản ứng được tiến hành với chu kỳ nhiệt như sau: một chu kỳ 940
C trong 4 phút, 30 chu kỳ 940
C trong 45 giây, 550C trong 45 giây, 720C trong 60 giây. Thành phần phản ứng PCR nhân gen CP/PRSV như sau: Nước cất khử ion, khử trùng (14,3 l), Dung dịch đệm 10X (2,5 l), MgCl2 25 mM (2,5 l), dNTPs 10 mM (2l), mồi PRSV-CP-Fi 10 pmol (1 l), mồi PRSV-HC-Ri 10 pmol (1 l), Taq polymerase (0,2 l), AND (1,5 l). Tổng thể thích phản ứng là 25 l.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8%, nhuộm với ethidium bromide và quan sát dưới đèn UV.
2.2.4.3. Phân tích cây chuyển gen thông qua RT-PCR
Các dòng cây chuyển gen T0 cho kết quả dương tính với phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của đoạn gen CP-Nib-HCpro được tiến hành tách RNA tổng số để tiến hành RT-PCR.
i. Phương pháp tách RNA tổng số
Sử dụng bộ kit Trizol Reagents (In vitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá dưa hấu theo hướng dẫn của hãng sản xuất.
Quy trình:
- Cân 100mg lá dưa hấu, nghiền nhanh trong nitơ lỏng, đảm bảo mẫu phải được nghiền triệt để và tránh enzyme RNase cắt RNA.
- Chuyển ngay mẫu vào ống Eppendorf 2ml.
- Bổ sung 1ml Trizol Reagents, đảo đều ở nhiệt độ phòng (15 – 30oC) trong 5 phút.
- Bổ sung 200l Chloroform : Isoamyl (24 : 1), đảo đều ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Ly tâm 10000 v/p trong 15 phút.
- Hút 500l dịch nổi, chuyển sang ống Eppendorf 1,5ml.
- Bổ sung 500l Isopropanol đã được làm lạnh đến 4oC, lắc nhẹ ống để RNA kết tủa.
- Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa RNA bằng cồn 70% pha trong DEPC 0,01%.
- Ly tâm 6000 v/p trong 5 phút.
- Làm khô RNA bằng máy Speed Vac trong khoảng 3 phút.
- Pha loãng RNA trong 40l H2O đã xử lý DEPC 0,01%.
- Ủ ở nhiệt độ 55oC trong 5 phút để RNA tan hết.
- Lấy 1l RNA tổng số điện di kiểm tra chất lượng trên gel agarose 0,8%.
Chú ý: Do RNA dễ bị RNase cắt nên tất cả các dụng cụ đều phải xử lý DEPC 0,01% và khử trùng trước khi sử dụng.
ii. Phương pháp RT-PCR
RNA tổng số được sử dụng để nhân đoạn gen CP-Nib-HCpro bằng kỹ thuật RT-PCR hai bước như sau:
Bước 1: Tổng hợp cADN
- Bổ sung lần lượt các thành phần sau đây vào ống Eppendorf 0,5ml đã được xử lý DEPC 0,01% hoặc RNase:
Thành phần Thể tích
100ng mồi ngẫu nhiên 2 l
10pg - 5g RNA tổng số 2 l
dNTPs 10mM 2 l
- Bổ sung nước DEPC 0,01% tới thể tích 13l. - Ủ ở 65oC trong 5 phút, sau đó đặt vào đá.
- Tiếp tục bổ sung các thành phần sau vào ống phản ứng:
Buffer 5X 4 l
DTT 0,1M 1 l
RNase OUTTM (40 đơn vị/l) Cloned AMV RT (15 đơn vị/l)
1 l 1 l
Tổng 20 l
- Trộn mẫu nhẹ nhàng, sau đó thực hiện một chu kì nhiệt như sau: 25oC trong 10 phút, 45oC trong 55 phút, 85oC trong 5 phút, hạ nhiệt độ xuống 4o
Bước 2: Phản ứng PCR
Sau khi tổng hợp cADN, tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu PRSV- CP-Fi/PRSV-HC-Ri để nhân bản đoạn gen CP-Nib-HC-pro. Thành phần, chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR giống như trong mục 2.2.4.2.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8%, nhuộm với ethidium bromide và quan sát dưới đèn UV.
2.2.4.4. Đánh giá tính kháng virus của các dòng cây dƣa hấu chuyển gen
Các dòng cây dưa hấu chuyển gen T0 và T1 cho kết quả PCR và RT-PCR dương tính với cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn gen đa đoạn sẽ được lây nhiễm nhân tạo với virus PRSV theo phương pháp của Herbers và cộng sự (1996) có cải tiến. 5 cây con của mỗi dòng dưa hấu chuyển gen và cây Wild-type (WT) được lây nhiễm nhân tạo với virus. Mẫu lá bị bệnh được nghiền trong đệm phosphate 100mM, pH7 (khoảng 1g mẫu lá trong 20ml đệm). Lá dưa hấu được gây tổn thương nhẹ bằng cách sử dụng tăm bông khử trùng chấm bột SiC và quét nhẹ trên bề mặt lá hoặc trộn lẫn bột SiC vào cùng với dịch chiết chứa virus trước khi cho vùng lá bị tổn thương tiếp xúc với dịch chứa virus, sau vài phút lây nhiễm, rửa bề mặt lá bằng nước. Sau 10 – 15 ngày, các triệu chứng sẽ xuất hiện trên cây. Quá trình lây nhiễm virus được lặp lại 3 lần ở cả cây chuyển gen và cây WT, mỗi lần cách nhau 15 ngày và cây sau khi lây nhiễm có biểu hiện bệnh sẽ không sử dụng để lây nhiễm lần sau.
Đánh giá sự biểu hiện bệnh virus đối với cây chuyển gen ở 3 cấp bệnh sau: Cấp bệnh 1: các vết đốm rất nhỏ, rải rác trên bề mặt lá non, rất khó quan sát; Cấp bệnh 2: các vết đốm nhiều hơn, một vài chỗ xuất hiện các vết khảm loang lổ, lá dưa hấu bắt đầu biến dạng, cây còi cọc hơn, ngọn cây có biểu hiện bị khô;
Cấp bệnh 3: các vết khảm xuất hiện khắp bề mặt lá, lá cây, ngọn cây bị biến dạng hoàn toàn, cây còi cọc, lượng diệp lục giảm nghiêm trọng, kích thước hoa và bầu quả nhỏ.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Việc tái sinh và chuyển gen vào dưa hấu không phải là vấn đề mới, trên thế giới đã có nhiều công bố về vấn đề này. Tuy nhiên, hiệu quả tái sinh và chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó giống là một trong những yếu tố ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả của quá trình chuyển gen. Vì vậy, trước khi chuyển gen đích vào cây dưa hấu nhằm tạo tính kháng đối với PRSV, chúng tôi đã xây dựng lại hệ thống tái sinh và chuyển gen vào các giống dưa hấu Việt Nam để làm cho nó hiệu quả hơn.
3.1. Xây dựng quy trình tái sinh cây dƣa hấu 3.1.1. Khả năng tái sinh chồi và cụm chồi
3.1.1.1. Ảnh hƣởng của tuổi lá mầm đến quá trình tái sinh chồi
Các mảnh lá mầm dưa hấu 3, 5, 7 và 9 ngày tuổi được đặt lên môi trường tái sinh có bổ sung 1,5 mg/l BAP và 0,5 mg/l IBA. Khả năng tái sinh chồi được quan sát sau 6 tuần và được thể hiện trong bảng 3.1, hình 3.1, 3.2.
Kết quả cho thấy, có sự khác biệt khá rõ về ảnh hưởng của tuổi lá mầm đến khả năng tái sinh thành chồi ở dưa hấu. Lá mầm 5 ngày tuổi cho hiệu quả tái sinh thành chồi cao nhất. Cùng với tuổi của lá mầm, các vùng khác nhau trên cùng một mảnh lá mầm cũng cho hiệu quả tái sinh chồi không giống nhau. Ở tất cả các công thức thí nghiệm, hầu hết các chồi đều được hình thành ở lát cắt gần với gốc lá mầm, các mảnh ở phần gần ngọn lá mầm đều không có khả năng tái sinh thành chồi. Rõ ràng, sự phát sinh chồi dưa hấu từ lá mầm là rất phân cực, các chồi chủ yếu phát sinh từ phần gần gốc lá mầm. Do đó, chúng tôi lựa chọn phần gần gốc ở các mảnh lá mầm dưa hấu 5 ngày tuổi để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tuổi lá mầm dƣa hấu đến khả năng tái sinh chồi
(A: lá mầm 9 ngày tuổi; B,C: lá mầm 5 ngày tuổi;)
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của vị trí trên lá mầm đến khả năng tái sinh chồi
(Mũi tên chỉ những mảnh gần ngọn lá mầm không có khả năng tái sinh chồi)
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của tuổi lá mầm tái sinh chồi Tuổi lá mầm
(ngày)
Tỷ lệ mẫu tái sinh thành chồi(%)
D1 D2 L1 L2
3 26,7 26,7 20,0 26,7
5 36,7 46,6 40,0 43,3
7 33,3 30,0 33,3 36,7
9 16,7 20,0 16,7 23,3
Ghi chú: Số mẫu cấy/1 dòng/1 công thức thí nghiệm bằng nhau: 30 mẫu
3.1.1.2. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP, NAA và IBA đến quá trình tái sinh
Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP + IBA và BAP + IBA + NAA đến khả năng tái sinh chồi từ các mảnh lá mầm dưa hấu 5 ngày tuổi. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy có bổ sung 0,5 mg/l IBA có sự tham khảo các công bố của Ganasan và cs (2010), Pirinc và cs (2003), Park và cs (2005), Krug và cs (2005). Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.3, 3.4.
Kết quả cho thấy, trên môi trường không có chất kích thích sinh trưởng, tất cả các mẫu nuôi cấy đều không tạo được mô sẹo hoặc tạo chồi và chết sau 4 tuần nuôi cấy. Sự có mặt của BAP và IBA như chỉ ra trong các công thức TS1 – TS10 đều kích thích tạo chồi với tỷ lệ khác nhau. Tỷ lệ tái sinh giao động từ 13,3% đến 56,7%. Tuy nhiên, tỷ lệ các mảnh lá mầm tái sinh tạo được chồi cao nhất ở cả 4 giống dưa hấu lại ở công thức TS3 và số chồi trung bình ở công thức TS3 cũng là cao nhất đối với cả 4 giống dưa hấu. Tỷ lệ các mảnh tái sinh ở các công thức có nồng độ BAP cao (TS6 đến TS10), không làm tăng tỷ lệ các mảnh tái sinh lên mà còn làm cho tỷ lệ các mảnh tái sinh thành chồi và tỷ lệ số mảnh cho trên 1 chồi giảm mạnh và tỷ lệ số chồi dị hình ở các công thức này cũng cao hơn hẳn so với các công thức còn lại.
Ở công thức tái sinh TS11 và TS12 (có bổ sung NAA), hầu hết các mảnh lá mầm đều tạo được mô sẹo nhưng mô sẹo cứng và có mầu trắng hơn so với công thức đối chứng. Thêm vào đó, 60 – 70% các mảnh lá tạo rễ to, sần sùi, cứng thay vì tạo chồi. Như vậy, sự kết hợp đồng thời giữa IBA, BAP và NAA đã kìm hãm quá trình tái sinh cây từ mô sẹo và kích thích quá trình tạo rễ.
Từ các kết quả trên, chúng tôi đã lựa chọn công thức tái sinh TS3 (MS bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, 0,5 mg/l IBA, 1,5 mg/l BAP) làm môi trường tái sinh thích hợp nhất đối với các giống dưa hấu nghiên cứu.
Hình 3.3. Kết quả tái sinh chồi dƣa hấu từ lá mầm sau 6 tuần nuôi cấy
Hình 3.4. Hình ảnh chồi có hình thái bất thƣờng so với đối chứng TS1
TS9
TS3
TS11
Bảng 3. 2. Ảnh hƣởng của tổ hợp IBA, BAP, NAA đến sự phát sinh chồi Môi
trƣờng Số mẫu cấy Tỷ lệ tái sinh (%)
Tỷ lệ số mẫu cho chồi (%) Tỷ lệ số mẫu cho > 1 chồi (%) Số chồi trung bình Dòng D1 D2 L1 L2 D1 D2 L1 L2 D1 D2 L1 L2 D1 D2 L1 L2 D1 D2 L1 L2 TS0 38 39 30 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 TS1 80 47 83 85 27,5 23,4 25,3 25,9 25,0 23,4 20.5 21,2 18,7 15,0 14,5 14,1 2,6 2,8 1,8 3,0 TS2 94 80 93 82 33,0 37,5 35,5 41,2 31,9 35,0 31,2 36,6 24,5 30,0 23,7 29,3 3,3 4,7 2,1 2,9 TS3 73 69 84 78 39,7 47,8 41,2 46,2 38,4 45,0 38,1 41,0 35,6 37,7 35,7 35,9 4,3 4,9 3,4 4,3 TS4 97 60 88 87 38,1 56,7 39,7 39,1 36,1 41,7 34,9 36,8 34,0 30,0 27,3 31,0 3,6 4,2 2,4 3,9 TS5 94 59 82 79 40,4 42,4 39,0 35,4 35,1 30,5 30,5 30,4 23,4 25,4 23,2 24,1 3,3 3,4 2,8 3,6 TS6 99 102 94 95 39,4 44,1 38,3 37,9 31,3 31,4 26,6 26,3 14,1 21,6 16,0 16,8 2,3 3,7 2,4 3,6 TS7 68 71 76 85 39,7 40,1 44,7 41,2 29,4 28,1 27,6 25,9 14,7 11,3 14,5 17,6 2,3 2,3 2,1 3,2 TS8 92 77 95 93 44,6 36,4 37,9 34,4 26,1 24,7 22,1 22,6 14,1 14,3 12,6 12,9 1,9 1,8 1,8 2,5 TS9 47 36 57 58 34,0 30,6 33,3 32,8 10,6 22,2 17,5 18,9 4,7 2,8 3,5 5,2 1,7 1,4 1,8 2,2 TS10 39 47 49 52 17,9 23,4 20,4 19,2 7,7 11,4 10,2 11,5 7,7 4,7 4,1 3,8 1,5 1,6 1,5 1,8 TS11 30 44 52 56 16,7 27,2 19,2 17,9 10,0 20,5 7,7 10,7 10,0 18,2 1,9 3,6 2,5 2,5 2,3 2,7 TS12 30 38 45 47 13,3 18,4 13,3 14,9 10,0 18,4 4,4 4,3 6,7 7,9 2,3 2,1 2,2 2,6 2,1 2,4
3.1.2. Kết quả kích thích kéo dài chồi
Các chồi của 4 dòng dưa hấu được tạo thành sau 6 tuần trên môi trường tái sinh sẽ được cắt và chuyển sang môi trường kích thích kéo dài chồi có chứa 0,1 mg/l IBA và GA3 với các nồng độ khác nhau trong 2 tuần. Nhìn chung, với các chồi khỏe (cao >1cm, mập mạp) khi chuyển sang môi trường MS không có chất kích thích sinh trưởng vẫn phát triển rất tốt, cây lớn nhanh, khỏe, xanh tốt. Còn những chồi có kích thước nhỏ (<1cm), hoặc các cụm chồi nhỏ khi đưa sang các môi trường kéo dài chồi khác nhau thì sự kích thích kéo dài có sự khác biệt khá rõ rệt. Kết quả được thể hiện qua bảng 3.3 và hình 3.5.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi có kích thƣớc < 1cm
Công thức
Số chồi đƣợc kéo dài Số chồi 3 – 5 cm Số chồi >5 cm
D1 D2 L1 L2 D1 D2 L1 L2 D1 D2 L1 L2
KC0 21 27 22 25 4 5 4 4 0 3 3 2
KC1 28 30 25 29 13 17 12 15 8 8 7 9
KC2 30 30 30 30 21 23 20 24 4 4 5 5
KC3 30 30 30 30 22 22 21 22 4 5 4 3
Ghi chú: Tổng số chồi được kích thích kéo dài của mỗi dòng dưa hấu nghiên cứu là 30 chồi.
Kết quả cho thấy, ở tất cả các công thức thí nghiệm dưa hấu D2 và L2 cho khả năng kéo dài tốt hơn so với dưa hấu D1 và L1. Ở cả 4 dòng dưa hấu, đối với công thức KC0 (0,0 GA3) thì hầu hết chồi phát triển chậm hơn so với trên môi trường có bổ sung GA3. Ở nồng độ 0,5 mg/l GA3, các chồi phát triển về chiều cao khá đồng đều, cây xanh tốt, một số cây có rễ, còn đối với nồng độ 0,7 mg/l GA3, dù thống kê về sự kéo dài chồi không khác biệt là mấy so với nồng độ 0,5 mg/l GA3 nhưng các chồi phát triển không đồng đều, lá cây có mầu vàng và số chồi có rễ ít hơn. Từ các kết quả trên, chúng tôi đã lựa chọn công thức kéo dài chồi KC2 là công thức tốt nhất.
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi 3.1.3. Kết quả tạo rễ cho chồi
Sau 2 tuần trên môi trường kéo dài, các chồi sẽ được chuyển sang môi trường tạo rễ có bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau. Kết quả được trình bày trong