3.2.5.1. Phân tích biểu hiện bền vững của gus ở các dòng cây chuyển gen
Những cây đã ra rễ trên môi trường chọn chọn lọc có kháng sinh Km100 được thu mẫu lá để kiểm tra sự biểu hiện bền vững của gus. Các mẫu lá được ngâm
D
F E
A
Hình 3.13. Hình ảnh chuyển gen gus vào cây dƣa hấu. A. Mảnh lá mầm trong dung dịch hòa tan khuẩn; B. Mảnh lá mầm trên môi trường đồng nuôi cấy; C. Mảnh lá mầm trên môi trường tái sinh có chất chọn lọc 200 mg/l Km; D. Chồi hình thành sau 4 – 6 tuần trên môi trường tái sinh có chất chọn lọc 200 mg/l Km; E. Chọn lọc chồi trên môi trường ra rễ có chất chọn lọc 100 mg/l Km; F. Cây con trồng trên giá thể trấu hun : cát đen (1:1).
trong dung dịch X-gluc (Tris/NaCl pH7,2 + 10mg/ml X-gluc + 10% Triton X-100) và ủ ở nhiệt độ 37oC
trong 24 – 36h. Mô nhuộm X-gluc sẽ được tẩy hết diệp lục nhiều lần với cồn 70% và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Mẫu được chuyển gen gus sẽ có màu xanh chàm đặc trưng. Mức độ biểu hiện của gen gus được đánh giá thông qua mức phân bố và độ đậm của màu xanh chàm trên các mô kiểm tra.
Sau khi nhuộm X-gluc, trong tổng số 36 dòng cây dưa hấu ra rễ được trên môi trường có chất chọn lọc, thu được 5 dòng cây cho phản ứng dương tính với X-gluc, trong đó 3 dòng được tái sinh từ D2 và 2 dòng tái sinh từ L2. Mức độ biểu hiện của
gus khá mạnh, màu xanh đậm xuất hiện ở cả rễ, thân cây, lá cây, đỉnh chồi, hoa.
Kết quả phân tích biểu hiện bền vững của gus trong các dòng dưa hấu chuyển gen được thể hiện trong hình 3.14.
3.2.5.2. Phân tích cây chuyển gen gus bằng phản ứng PCR
Để khẳng định sự có mặt của đoạn gen chuyển trong các dòng dưa hấu chuyển gen, 5 dòng cây cho kết quả biểu hiện gus bền vững dương tính được ra cây trong bầu trấu : cát (1 : 1), sau 2 - 3 tuần các cây được thu mẫu lá để tiến hành tách chiết ADN tổng số và kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chuyển bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu với gen nptII, so sánh với đối chứng (+) có ADN là vector pCB- Gusplus và đối chứng (-) không có ADN trong thành phần phản ứng PCR. Theo lý
A B
Hình 3.14.Biểu hiện bền vững của gus ở các dòng dƣa hấu chuyển gen A: Rễ; B: Đỉnh chồi; C: Cây hoàn chỉnh
thuyết, kích thước đoạn gen nptII nhân lên được là 963bp. Kết quả được trình bày trong hình 3.15.
Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen nptII
trên gel agarose 0,8%
M: Maker 1kb; 1 – 5: Các dòng dưa hấu chuyển gen gus; (+): đối chứng dương; (-): đối chứng âm
Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen nptII ở 5 dòng
dưa hấu chuyển gen (hình 3.15) cho thấy, có sự xuất hiện một vệt ADN với kích thước xấp xỉ 1000bp tương ứng với kích thước lý thuyết của đoạn gen nptII. Điều
này chứng tỏ, chúng tôi đã chuyển thành công cấu trúc gus-intron vào 2 dòng dưa hấu Việt Nam.
3.2.6. Kết quả chuyển gen gus vào cây dƣa hấu
Kết quả chuyển gen gus vào cây dưa hấu được tổng kết trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả chuyển gen gus vào dƣa hấu Lô thí nghiệm Số mẫu thí nghiệm Tổng số chồi tạo thành Số chồi ra rễ Số dòng (+) gus Số dòng (+) PCR Hiệu suất chuyển gen (%) WT 30 0 0 0 0 0 D1 142 29 5 0 0 0 D2 162 57 11 3 3 1,85 1000bp
L1 167 43 8 0 0 0
L2 107 54 12 2 2 1,87
Kết quả chuyển gen gus (bảng 3.9) cho thấy, 4 dòng dưa hấu cho hiệu quả chuyển gen ổn định rất khác nhau. Trong tổng số 36 dòng cây dưa hấu chuyển gen ra rễ được trên môi trường có chất chọn lọc, có 5 dòng cho kết quả nhuộm (+) với X-gluc, và (+) với gen nptII. Như vậy, chúng tôi đã chuyển thành công gen gus vào dưa hấu D2 và L2, tỷ lệ chuyển gen thu được là 1,85% (D2) và 1,87% (L2). Giống D1 và L1 không tạo được cây chuyển gen. Kết quả này một lần nữa khẳng định khả năng chuyển gen ở các giống khác nhau là không giống nhau.
3.3. Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi vào dƣa hấu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng chủng Agrobacterium tumefaciens CV58C1 chứa vector pK7GWIW2(II) mang đoạn gen đa đoạn CP- Nib-HCpro để chuyển vào 2 dòng dưa hấu D2 và L2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hạt dưa hấu được khử trùng, tách vỏ cứng và cho nảy mầm trên môi trường MS có bổ sung 30mg/l sucrose, 8g/l agar. Sau 5 – 7 ngày nảy mầm, các mảnh lá mầm được cắt thành những mảnh nhỏ có kích thước khoảng 1 – 2mm2 và được sử dụng làm nguyên liệu biến nạp. Song song với việc tạo nguyên liệu biến nạp, dịch huyền phù vi khuẩn cũng được chuẩn bị bằng cách nuôi cấy một khuẩn lạc vi khuẩn
A.tumefaciens chứa vector pK7GWIW2(II) mang đoạn gen đa đoạn CP-Nib-HCpro
trong dung dịch LB có bổ sung các chất chọn lọc để đạt đến nồng độ vi khuẩn OD600=0,7. Tiến hành chuyển gen với 3 lô thí nghiệm riêng biệt với mỗi dòng dưa hấu. Để tạo được cây dưa hấu chuyển gen kháng virus PRSV thông qua việc chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro, chúng tôi tiến hành theo quy trình chuyển gen gus
đã được trình bày trong mục 3.2.5. Kết quả được trình bày trong bảng 3.10.
Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu (bảng 3.10) cho thấy, với tổng số 600 mảnh lá mầm của 2 dòng dưa hấu nghiên cứu được biến nạp, sau các giai đoạn nuôi cấy và chọn lọc thu được 79 dòng dưa hấu sống sót và ra rễ được trên môi trường nuôi cấy có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100mg/l Km. Trong
đó, có 43 dòng thuộc dưa hấu D2 và 36 dòng thuộc dưa hấu L2. Các dòng dưa hấu này được nhân giống vô tính trên môi trường kéo dài chồi KC2 (MS bổ sung 30g/l sucrose, 8g/l agar, 0,1mg/l IBA, 0,5mg/l GA3, 150mg/l Km, 500mg/l Cefo) nhằm tạo nhiều cây con cùng dòng phục vụ cho thí nghiệm phân tích cây chuyển gen.
Các dòng cây thế hệ T0 ra rễ trên môi trường có kháng sinh chọn lọc sau 2 tuần được chuyển ra bầu cát : trấu (1:1). Sau khoảng 2 – 3 tuần, các dòng cây chuyển gen được kiểm tra sự có mặt của đoạn gen đa đoạn bằng phản ứng PCR và RT-PCR.
Bảng 3.10. Kết quả biến nạp cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dƣa hấu Lô thí nghiệm Tổng số mẫu Số mẫu sống Số mẫu tạo chồi Tổng số chồi Số chồi ra rễ WT 30 0 0 0 0 D2 324 241 151 190 43 L2 276 183 147 165 36
3.4. Kết quả phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển và đánh giá khả năng kháng virus của các dòng cây chuyển gen
3.4.1. Phân tích các dòng cây chuyển gen T0
3.4.1.1. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
Sau 2-3 tuần ra cây, các mẫu lá của 79 dòng dưa hấu chuyển cấu trúc RNAi/Cp-Nib-HCpro được thu thập để tách chiết ADN tổng số và kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chuyển bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri, so sánh với đối chứng (+) có bổ sung ADN là vector pK7GWIW2(II) và đối chứng (-) không bổ sung ADN vào thành phần phản ứng PCR. Theo lý thuyết, đoạn gen đa đoạn nhân lên được sẽ có kích thước tương ứng là 621 bp.
Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng cây chuyển gen (hình 3.16) cho thấy, có 14/79 dòng dưa hấu chuyển gen T0 cho kết quả PCR dương tính với một băng sản phẩm PCR có kích thước tương ứng 621 bp. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với
kích thước lý thuyết của đoạn gen chuyển. Trong số 14 dòng cây này, 9 dòng thuộc D2 và 5 dòng thuộc L2.
Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dƣa hấu chuyển gen T0 với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri
(M: Maker 1kb; (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm; (1-14): Các dòng dưa hấu chuyển gen)
3.4.1.2. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen bằng kỹ thuật RT - PCR
Việc sử dụng kỹ thuật PCR trong phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T0 thường bị hạn chế bởi hiện tượng dương tính giả do vi khuẩn A.tumefaciens mang gen
chuyển có thể vẫn còn tồn tại trong khối mô hay gian bào của cây chuyển gen. Tuy nhiên, do cấu trúc RNAi/CP-Nib-Hcpro không được biểu hiện trong vi khuẩn mà chỉ được biểu hiện trong tế bào của sinh vật nhân chuẩn nên 14 dòng cây cho kết quả PCR dương tính tiếp tục được thu mẫu lá để tiến hành tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cADN và tiến hành phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri để kiểm tra sự có mặt của các RNA do đoạn gen chuyển quy định tổng hợp. (+) (-) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 D2 L2 750 bp 500 bp
Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR (hình 3.17) cho thấy, ở dưa hấu D2 có 8/9 dòng và dưa hấu L2 có 5/5 dòng cho kết quả RT-PCR dương tính với một băng ADN kích thước tương ứng với kích thước của đoạn gen chuyển. Điều này cho thấy đã có 13 dòng dưa hấu được chuyển gen thành công cấu trúc RNAi mang đoạn gen CP-Nib-HCpro của PRSV.
Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR các dòng dƣa hấu chuyển gen T0 với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri
(M: Maker 1kb; (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm; (1-14): Các dòng dưa hấu chuyển gen)
Sử dụng phản ứng PCR và RT-PCR để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen, chúng tôi nhận thấy, nhiều dòng cây chuyển gen vẫn sống sót và ra rễ trên môi trường có 100mg/l Km nhưng lại cho kết quả PCR và RT-PCR âm tính với đoạn gen đích. Điều này có thể là do sự đứt gãy đoạn gen đích trong vector, kết quả là các dòng cây chuyển gen này chỉ mang gen kháng kháng sinh hoặc mang đồng thời gen kháng kháng sinh và một phần còn lại của đoạn gen đích làm cho cặp mồi nhân gen đích không bám được vào để thực hiện phản ứng nhân bản đoạn gen.
3.4.1.4. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu
M D2 L2 (-) (+) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 750 bp 500 bp
Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu được thể hiện trong bảng 3.11 và hình 3.18.
Bảng 3.11. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dƣa hấu Lô thí nghiệm Tổng số mẫu Số dòng ra rễ Số dòng (+) PCR Số dòng (+) RT-PCR Hiệu suất chuyển gen (%) WT 30 0 0 0 0 D2 324 43 9 8 2,47 L2 276 36 5 5 1,81
Kết quả (bảng 3.11 và hình 3.18) cho thấy, 2 dòng dưa hấu cho hiệu quả chuyển gen ổn định rất khác nhau. Trong tổng số 79 dòng cây dưa hấu chuyển gen
A
D (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
B C
E F
Hình 3.18. Một số hình ảnh chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro
A: Lá mầm trên môi trường đồng nuôi cấy; B: Chồi/cụm chồi hình thành sau 10 ngày trên môi trường chọn lọc Km 200; C: Các cụm chồi trên môi trường chọn lọc Km 200; D: Chồi trên môi trường chọn lọc Km 100; E: Cây hoàn chỉnh trên
ra rễ được trên môi trường có chất chọn lọc, có 13 dòng cho kết quả RT-PCR dương tính với cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen chuyển CP-Nib-HCpro, tỷ lệ chuyển gen thu được là 2,47% (D2) và 1,81% (L2).
3.4.1.5. Đánh giá khả năng kháng với PRSV Việt Nam
A. Kết quả kiểm tra nguồn cây bệnh sử dụng trong thí nghiệm lây nhiễm PRSV bằng phản ứng RT-PCR
Để đảm bảo độ tin cậy về khả năng kháng virus PRSV của các dòng dưa hấu chuyển gen, cần thiết phải tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm virus nhân tạo để đánh giá tính kháng đối với PRSV Việt Nam. Để có nguồn PRSV Việt Nam phục vụ cho thí nghiệm lây nhiễm virus nhân tạo, chúng tôi đã tiến hành thu thập 5 mẫu bí ngô bị bệnh và kiểm tra sự có mặt của PRSV thông qua phản ứng tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cADN và tiến hành RT-PCR nhân gen mã hóa cho protein vỏ (CP) với cặp mồi đặc hiệu PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1. Theo lý thuyết, đoạn gen nhân lên được sẽ có kích thước khoảng 1,2kb. Kết quả được thể hiện trên hình 3.19 và 3.20.
Hình 3.19. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1trên gel agarose 0,8%
M: thang ADN 1 Kb; (1 – 5): thứ tự các mẫu bí ngô nhiễm virus; (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm
1000nts
Kết quả RT-PCR trên hình 3.19 cho thấy, chúng tôi đã nhân được 1 phân đoạn ADN có kích thước khoảng 1,2 Kb ở cả 5 mẫu bí ngô bị bệnh. Như vậy, chúng tôi đã xác định được sự có mặt của PRSV ở 5 mẫu bí ngô thu thập được. Các mẫu bí ngô này (hình 3.20) được sử dụng để nghiền, thu dịch chiết chứa virus, phục vụ cho các thí nghiệm lây nhiễm PRSV nhân tạo.
Hình 3.20. Mẫu lá bí ngô bị nhiễm PRSV
B. Đánh giá khả năng kháng với PRSV Việt Nam
Điều quan trọng nhất của nghiên cứu này là tạo ra được dòng dưa hấu chuyển gen có khả năng kháng lại PRSV. Các PRSV có thể lây truyền qua các loài rệp hoặc thông qua các vết thương cơ giới, vì thế chúng tôi đã lựa chọn con đường lây nhiễm virus nhân tạo cho các dòng cây chuyển gen thông qua các vết thương trên bề mặt lá dưa hấu chuyển gen và cây đối chứng theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.3.3. Thí nghiệm lây nhiễm PRSV cho 13 dòng dưa hấu chuyển gen được bố trí trong khoảng thời gian tháng 4 đến tháng 5 năm 2012, đây là thời điểm thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của dưa hấu tại miền Bắc Việt Nam. Kết quả đánh giá khả năng kháng với PRSV Việt Nam của các dòng dưa hấu chuyển gen thế hệ T0 được thể hiện trong bảng 3.12 và hình 3.22.
Kết quả thể hiện trong bảng 3.12 cho thấy, các dòng dưa hấu chuyển gen có thời gian nhiễm bệnh chậm hơn các dòng đối chứng. Hầu hết các cây WT có biểu hiện bệnh ở mức độ nhìn thấy rõ 8-10 ngày sau lần lây nhiễm thứ nhất, còn ở các
cây chuyển gen sau khi lây nhiễm 12 – 17 ngày thì triệu chứng bệnh mới bắt đầu được biểu hiện. Mức độ chuyển bệnh của các dòng cây chuyển gen cũng lâu hơn so với các cây đối chứng. Sau 20 ngày lây nhiễm, các cây WT không chuyển gen đều biểu hiện bệnh ở mức độ nặng hơn nhiều so với các cây chuyển gen có biểu hiện bệnh.
Bảng 3.12. Kết quả lây nhiễm virus các dòng dƣa hấu chuyển gen RNAi/Cp- Nib-HCpro thế hệ T0 và WT (mỗi dòng 05 cây)
Ngày Dòng
Mức độ biểu hiện bệnh của các dòng cây chuyển gen sau lây nhiễm PRSV theo các ngày theo dõi
9 13 15 17 26 36 40 45 Mức độ TB D2.1 0 0 0 0,2 1,2 1,6 2,0 2,0 2 D2.2 0 0 0 0 0 0,6 1,0 1,6 1 D2.3 0 0 0 0 0 0,4 0,4 1,0 1 D2.4 0 0,8 1,0 1,0 1,4 2,0 2,2 2,6 2 D2.5 0 0 0 0 0 0,2 0,8 1,4 1 D2.6 0 0 0 0,2 1,2 1,4 1,4 1,4 1 D2.7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D2.8 0 0 0 0 0 0,4 0,6 1,6 1
Tỷ lệ kháng virus của dưa hấu D2 là 12,5%
L2.1 0 0 0 0 0 0,4 0,8 1,6 1
L2.2 0 0 0 0 0 0,8 1,2 1,2 1
L2.3 0 0 0 0 0 0 0 0 0
L2.4 0 0 0 0 0 0,2 0,6 1,4 1
L2.5 0 0 0 0 0 0,6 0,6 1,2 1
Tỷ lệ kháng virus của dưa hấu L2 là 20,0%
WT 0,6 0,8 1,6 2,0 2,6 3,0 3,0 3,0 3 Tỷ lệ kháng virus của dưa hấu WT là 0,0% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ghi chú: Biểu hiện bệnh được đánh giá theo cấp bệnh từ 0 - 3
Cấp bệnh 2: các vết đốm nhiều hơn, một vài chỗ xuất hiện các vết khảm loang lổ, lá dưa hấu bắt đầu biến dạng, cây còi cọc hơn, ngọn cây có biểu hiện bị