3.4.1.1. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
Sau 2-3 tuần ra cây, các mẫu lá của 79 dòng dưa hấu chuyển cấu trúc RNAi/Cp-Nib-HCpro được thu thập để tách chiết ADN tổng số và kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chuyển bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri, so sánh với đối chứng (+) có bổ sung ADN là vector pK7GWIW2(II) và đối chứng (-) không bổ sung ADN vào thành phần phản ứng PCR. Theo lý thuyết, đoạn gen đa đoạn nhân lên được sẽ có kích thước tương ứng là 621 bp.
Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng cây chuyển gen (hình 3.16) cho thấy, có 14/79 dòng dưa hấu chuyển gen T0 cho kết quả PCR dương tính với một băng sản phẩm PCR có kích thước tương ứng 621 bp. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với
kích thước lý thuyết của đoạn gen chuyển. Trong số 14 dòng cây này, 9 dòng thuộc D2 và 5 dòng thuộc L2.
Hình 3.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dƣa hấu chuyển gen T0 với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri
(M: Maker 1kb; (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm; (1-14): Các dòng dưa hấu chuyển gen)
3.4.1.2. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen bằng kỹ thuật RT - PCR
Việc sử dụng kỹ thuật PCR trong phân tích cây chuyển gen ở thế hệ T0 thường bị hạn chế bởi hiện tượng dương tính giả do vi khuẩn A.tumefaciens mang gen
chuyển có thể vẫn còn tồn tại trong khối mô hay gian bào của cây chuyển gen. Tuy nhiên, do cấu trúc RNAi/CP-Nib-Hcpro không được biểu hiện trong vi khuẩn mà chỉ được biểu hiện trong tế bào của sinh vật nhân chuẩn nên 14 dòng cây cho kết quả PCR dương tính tiếp tục được thu mẫu lá để tiến hành tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cADN và tiến hành phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri để kiểm tra sự có mặt của các RNA do đoạn gen chuyển quy định tổng hợp. (+) (-) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 D2 L2 750 bp 500 bp
Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR (hình 3.17) cho thấy, ở dưa hấu D2 có 8/9 dòng và dưa hấu L2 có 5/5 dòng cho kết quả RT-PCR dương tính với một băng ADN kích thước tương ứng với kích thước của đoạn gen chuyển. Điều này cho thấy đã có 13 dòng dưa hấu được chuyển gen thành công cấu trúc RNAi mang đoạn gen CP-Nib-HCpro của PRSV.
Hình 3.17. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR các dòng dƣa hấu chuyển gen T0 với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri
(M: Maker 1kb; (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm; (1-14): Các dòng dưa hấu chuyển gen)
Sử dụng phản ứng PCR và RT-PCR để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen, chúng tôi nhận thấy, nhiều dòng cây chuyển gen vẫn sống sót và ra rễ trên môi trường có 100mg/l Km nhưng lại cho kết quả PCR và RT-PCR âm tính với đoạn gen đích. Điều này có thể là do sự đứt gãy đoạn gen đích trong vector, kết quả là các dòng cây chuyển gen này chỉ mang gen kháng kháng sinh hoặc mang đồng thời gen kháng kháng sinh và một phần còn lại của đoạn gen đích làm cho cặp mồi nhân gen đích không bám được vào để thực hiện phản ứng nhân bản đoạn gen.
3.4.1.4. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu
M D2 L2 (-) (+) M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 750 bp 500 bp
Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dưa hấu được thể hiện trong bảng 3.11 và hình 3.18.
Bảng 3.11. Kết quả chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào dƣa hấu Lô thí nghiệm Tổng số mẫu Số dòng ra rễ Số dòng (+) PCR Số dòng (+) RT-PCR Hiệu suất chuyển gen (%) WT 30 0 0 0 0 D2 324 43 9 8 2,47 L2 276 36 5 5 1,81
Kết quả (bảng 3.11 và hình 3.18) cho thấy, 2 dòng dưa hấu cho hiệu quả chuyển gen ổn định rất khác nhau. Trong tổng số 79 dòng cây dưa hấu chuyển gen
A
D
B C
E F
Hình 3.18. Một số hình ảnh chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro
A: Lá mầm trên môi trường đồng nuôi cấy; B: Chồi/cụm chồi hình thành sau 10 ngày trên môi trường chọn lọc Km 200; C: Các cụm chồi trên môi trường chọn lọc Km 200; D: Chồi trên môi trường chọn lọc Km 100; E: Cây hoàn chỉnh trên
ra rễ được trên môi trường có chất chọn lọc, có 13 dòng cho kết quả RT-PCR dương tính với cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen chuyển CP-Nib-HCpro, tỷ lệ chuyển gen thu được là 2,47% (D2) và 1,81% (L2).
3.4.1.5. Đánh giá khả năng kháng với PRSV Việt Nam
A. Kết quả kiểm tra nguồn cây bệnh sử dụng trong thí nghiệm lây nhiễm PRSV bằng phản ứng RT-PCR
Để đảm bảo độ tin cậy về khả năng kháng virus PRSV của các dòng dưa hấu chuyển gen, cần thiết phải tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm virus nhân tạo để đánh giá tính kháng đối với PRSV Việt Nam. Để có nguồn PRSV Việt Nam phục vụ cho thí nghiệm lây nhiễm virus nhân tạo, chúng tôi đã tiến hành thu thập 5 mẫu bí ngô bị bệnh và kiểm tra sự có mặt của PRSV thông qua phản ứng tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cADN và tiến hành RT-PCR nhân gen mã hóa cho protein vỏ (CP) với cặp mồi đặc hiệu PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1. Theo lý thuyết, đoạn gen nhân lên được sẽ có kích thước khoảng 1,2kb. Kết quả được thể hiện trên hình 3.19 và 3.20.
Hình 3.19. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu PRSV-Nib-F3/PRSV-CP-R1trên gel agarose 0,8%
M: thang ADN 1 Kb; (1 – 5): thứ tự các mẫu bí ngô nhiễm virus; (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm
1000nts
Kết quả RT-PCR trên hình 3.19 cho thấy, chúng tôi đã nhân được 1 phân đoạn ADN có kích thước khoảng 1,2 Kb ở cả 5 mẫu bí ngô bị bệnh. Như vậy, chúng tôi đã xác định được sự có mặt của PRSV ở 5 mẫu bí ngô thu thập được. Các mẫu bí ngô này (hình 3.20) được sử dụng để nghiền, thu dịch chiết chứa virus, phục vụ cho các thí nghiệm lây nhiễm PRSV nhân tạo.
Hình 3.20. Mẫu lá bí ngô bị nhiễm PRSV
B. Đánh giá khả năng kháng với PRSV Việt Nam
Điều quan trọng nhất của nghiên cứu này là tạo ra được dòng dưa hấu chuyển gen có khả năng kháng lại PRSV. Các PRSV có thể lây truyền qua các loài rệp hoặc thông qua các vết thương cơ giới, vì thế chúng tôi đã lựa chọn con đường lây nhiễm virus nhân tạo cho các dòng cây chuyển gen thông qua các vết thương trên bề mặt lá dưa hấu chuyển gen và cây đối chứng theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.3.3. Thí nghiệm lây nhiễm PRSV cho 13 dòng dưa hấu chuyển gen được bố trí trong khoảng thời gian tháng 4 đến tháng 5 năm 2012, đây là thời điểm thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của dưa hấu tại miền Bắc Việt Nam. Kết quả đánh giá khả năng kháng với PRSV Việt Nam của các dòng dưa hấu chuyển gen thế hệ T0 được thể hiện trong bảng 3.12 và hình 3.22.
Kết quả thể hiện trong bảng 3.12 cho thấy, các dòng dưa hấu chuyển gen có thời gian nhiễm bệnh chậm hơn các dòng đối chứng. Hầu hết các cây WT có biểu hiện bệnh ở mức độ nhìn thấy rõ 8-10 ngày sau lần lây nhiễm thứ nhất, còn ở các
cây chuyển gen sau khi lây nhiễm 12 – 17 ngày thì triệu chứng bệnh mới bắt đầu được biểu hiện. Mức độ chuyển bệnh của các dòng cây chuyển gen cũng lâu hơn so với các cây đối chứng. Sau 20 ngày lây nhiễm, các cây WT không chuyển gen đều biểu hiện bệnh ở mức độ nặng hơn nhiều so với các cây chuyển gen có biểu hiện bệnh.
Bảng 3.12. Kết quả lây nhiễm virus các dòng dƣa hấu chuyển gen RNAi/Cp- Nib-HCpro thế hệ T0 và WT (mỗi dòng 05 cây)
Ngày Dòng
Mức độ biểu hiện bệnh của các dòng cây chuyển gen sau lây nhiễm PRSV theo các ngày theo dõi
9 13 15 17 26 36 40 45 Mức độ TB D2.1 0 0 0 0,2 1,2 1,6 2,0 2,0 2 D2.2 0 0 0 0 0 0,6 1,0 1,6 1 D2.3 0 0 0 0 0 0,4 0,4 1,0 1 D2.4 0 0,8 1,0 1,0 1,4 2,0 2,2 2,6 2 D2.5 0 0 0 0 0 0,2 0,8 1,4 1 D2.6 0 0 0 0,2 1,2 1,4 1,4 1,4 1 D2.7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 D2.8 0 0 0 0 0 0,4 0,6 1,6 1
Tỷ lệ kháng virus của dưa hấu D2 là 12,5%
L2.1 0 0 0 0 0 0,4 0,8 1,6 1
L2.2 0 0 0 0 0 0,8 1,2 1,2 1
L2.3 0 0 0 0 0 0 0 0 0
L2.4 0 0 0 0 0 0,2 0,6 1,4 1
L2.5 0 0 0 0 0 0,6 0,6 1,2 1
Tỷ lệ kháng virus của dưa hấu L2 là 20,0%
WT 0,6 0,8 1,6 2,0 2,6 3,0 3,0 3,0 3 Tỷ lệ kháng virus của dưa hấu WT là 0,0%
Ghi chú: Biểu hiện bệnh được đánh giá theo cấp bệnh từ 0 - 3
Cấp bệnh 2: các vết đốm nhiều hơn, một vài chỗ xuất hiện các vết khảm loang lổ, lá dưa hấu bắt đầu biến dạng, cây còi cọc hơn, ngọn cây có biểu hiện bị khô;
Cấp bệnh 3: các vết khảm xuất hiện khắp bề mặt lá, lá cây, ngọn cây bị biến dạng hoàn toàn, cây còi cọc, lượng diệp lục giảm nghiêm trọng, kích thước hoa và bầu quả nhỏ.
A B
C D
Ở 13 dòng dưa hấu chuyển gen được lây nhiễm virus, 2 dòng có khả năng kháng hoàn toàn với PRSV, trong đó có 1 dòng thuộc L2 (L2.3), 1 dòng thuộc D2
Hình 3.21.Các mức độ biểu hiện bệnh ở lá dƣa hấu chuyển gen
A: Lá không nhiễm bệnh; B: Cấp bệnh 1; C: Cấp bệnh 2; D: Cấp bệnh 3
(D2.7), tỷ lệ kháng virus ở dưa hấu D2 là 12,5% và dưa hấu L2 là 20,0%. Hai dòng dưa hấu này sinh trưởng tốt, lá xanh đậm, cây khỏe, mập mạp, ra hoa và đậu quả tốt. 11 dòng dưa hấu chuyển gen còn lại có biểu hiện nhiễm PRSV với các cấp bệnh và thời gian bắt đầu biểu hiện bệnh, cũng như mức độ chuyển bệnh khác nhau. Trong đó, các dòng dưa hấu chuyển gen thuộc dưa hấu D2 có thời gian bắt đầu biểu hiện bệnh sớm hơn nhiều so với các dòng dưa hấu L2. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện bệnh ở các dòng dưa hấu này khá giống nhau, từ khi cây bắt đầu xuất hiện các triệu chứng bệnh thì mức độ biểu hiện bệnh khá nhẹ ở cấp bệnh 1, sau đó nặng dần lên đến cấp bệnh 2 và ổn định ở mức đó trong suốt quá trình theo dõi tiếp theo (trừ D2.1, D2.4, D2.8, L2.1 có một số cây biểu hiện bệnh ở cấp bệnh 3). Như vậy, rõ ràng là mức độ chuyển bệnh của các dòng dưa hấu thuộc L2 nhanh hơn so với D2, tuy nhiên mức độ biểu hiện bệnh cao nhất cũng chỉ đạt cấp bệnh 2. Sự khác biệt này có lẽ là do sự khác biệt về kiểu gen giữa một dòng là con lai F1 mang ưu thế lai (L2) với một dòng là thuần có nguồn gốc từ hạt giống địa phương.
Mặc dù 13 dòng dưa hấu chuyển gen trên đều là những dòng được chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro, xong có lẽ do mức độ biểu hiện cấu trúc này trong cây chuyển gen không ổn định và không cao, làm cho các dòng cây này có khả năng kháng với PRSV nhưng kháng không hoàn toàn, và khả năng kháng cũng hoàn toàn khác nhau, do đó ở lần lây nhiễm thứ 3, số dòng cây có biểu hiện bệnh đã tăng lên đáng kể. Tuy nhiên, một điều rõ ràng là cấu trúc RNAi đã hoạt động và có tác dụng kháng virus ở cây dưa hấu chuyển gen.
A1 A2 B1 B2 C1 C2 Hình 3.22Một số hình ảnh về tính kháng bệnh PRSV của các dòng dƣa hấu chuyển gen
A1, A2: Cây kháng bệnh
B1, B2: Cây nhiễm bệnh ở cấp bệnh 2 C1, C2: Cây WT bị nhiễm bệnh
3.4.2. Kết quả phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển và đánh giá khả năng kháng virus của các dòng cây chuyển gen ở thế hệ T1
Để phân tích biểu hiện gen và đánh giá khả năng kháng virus của các dòng dưa hấu chuyển gen ở thế hệ T1, các hạt của hai dòng dưa hấu T0 L2.3 và D2.7 được cho nảy mầm tạo thành cây T1 để thu mẫu lá phục vụ cho việc tiến hành phản ứng tách chiết gen, PCR để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chuyển, đồng thời các cây T1 cũng được sử dụng để tiến hành đánh giá tính kháng đối với PRSV bằng biotest.
3.4.2.1. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen thế hệ T1 bằng kỹ thuật PCR
Trong tạo cây trồng chuyển gen, việc đoạn gen chuyển có được di truyền qua các thế hệ hay không là yếu tố vô cùng quan trọng, quyết định đến hiệu quả của quá trình chuyển gen. Để kiểm tra sự di truyền đoạn gen chuyển từ thế hệ T0 sang thế hệ T1, chúng tôi thu mẫu lá của các cây T1 thuộc dưa hấu D2.7 và L2.3 để tiến hành tách ADN tổng số và phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu với đoạn gen chuyển PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.13 và hình 3.23 và 3.24.
Hình 3.23. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dƣa hấu chuyển gen D2.7 thế hệ T1với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri
(M: Maker 1kb; (1-18): Các dòng dưa hấu chuyển gen); (19): cây WT; (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm
750 bp 500 bp
Hình 3.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng dƣa hấu chuyển gen L2.3 thế hệ T1với cặp mồi đặc hiệu PRSV-CP-Fi / PRSV-HC-Ri
(M: Maker 1kb; (1-23): Các dòng dưa hấu chuyển gen); (24): cây WT; (+): Đối chứng dương; (-): Đối chứng âm
Bảng 3.13. Kết quả PCR phân tích các dòng dƣa hấu chuyển gen thế hệ T1 Dòng Tổng số cây Số cây PCR (+)
D2.7 18 7
L2.3 23 6
Kết quả cho thấy, trong tổng số 41 cây T1 thuộc dưa hấu D2.7 và L2.3 chúng tôi đã thu được 13 dòng cây T1 cho kết quả PCR dương tính với một băng ADN kích thước tương ứng với kích thước của đoạn gen chuyển (~621 bp), trong đó có 7 cây thuộc dưa hấu D2.7 và 6 cây thuộc dưa hấu L2.3. Như vậy, đoạn gen CP-Nib- HCpro của PRSV đã được di truyền từ dưa hấu chuyển gen D2.7 và L2.3 thế hệ T0
750 bp 500 bp
750 bp 500 bp
sang thế hệ T1. Tuy nhiên, số lượng hạt thu được còn hạn chế do gặp thời tiết bất lợi nên cần được nghiên cứu thêm.
3.4.2.2. Đánh giá khả năng kháng với PRSV Việt Nam của các dòng dưa hấu chuyển gen thế hệ T1
Tiếp tục sử dụng phương pháp lây nhiễm PRSV nhân tạo để kiểm tra khả năng kháng PRSV Việt Nam của 2 dòng dưa hấu chuyển gen D2.7 và L2.3 thế hệ T1. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.14.
Kết quả ở bảng 3.12 cho thấy, chúng tôi đã thu được 5 cây có khả năng kháng hoàn toàn với PRSV, trong đó có 2 cây thuộc dòng L2.3 và 3 cây thuộc dòng D2.7. Số cây còn lại biểu hiện khả năng kháng kém hơn, sau 45 ngày theo dõi hầu hết các cây chuyển gen đều biểu hiện bệnh ở cấp bệnh 1 hoặc 2, chỉ có duy nhất một cây thuộc dưa hấu L2.3 cho biểu hiện bệnh ở cấp bệnh 3.
So sánh với T0 chúng tôi nhận thấy, mức độ biểu hiện bệnh ở các dòng cây T1 là nhẹ hơn. Thời gian bắt đầu biểu hiện bệnh ở các cây dưa hấu T1 thuộc L2.3 sớm hơn nhiều so với T0 trong khi đó ở các cây T1 thuộc D2.7 không có sự khác biệt đáng kể, điều này có thể là do sự giảm ưu thế lai ở các cây thuộc dưa hấu L2.3 gây ra.
Ở thế hệ T1, chúng tôi thu được 1 cây thuộc dưa hấu D2.7 có biểu hiện bệnh ở ngày thứ 26 ở mức độ nhẹ (cấp bệnh 1) và duy trì tình trạng biểu hiện này trong suốt quá trình theo dõi. Bên cạnh đó, chúng tôi thu được 1 cây chuyển gen thuộc