Các chồi của 4 dòng dưa hấu được tạo thành sau 6 tuần trên môi trường tái sinh sẽ được cắt và chuyển sang môi trường kích thích kéo dài chồi có chứa 0,1 mg/l IBA và GA3 với các nồng độ khác nhau trong 2 tuần. Nhìn chung, với các chồi khỏe (cao >1cm, mập mạp) khi chuyển sang môi trường MS không có chất kích thích sinh trưởng vẫn phát triển rất tốt, cây lớn nhanh, khỏe, xanh tốt. Còn những chồi có kích thước nhỏ (<1cm), hoặc các cụm chồi nhỏ khi đưa sang các môi trường kéo dài chồi khác nhau thì sự kích thích kéo dài có sự khác biệt khá rõ rệt. Kết quả được thể hiện qua bảng 3.3 và hình 3.5.
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi có kích thƣớc < 1cm
Công thức
Số chồi đƣợc kéo dài Số chồi 3 – 5 cm Số chồi >5 cm
D1 D2 L1 L2 D1 D2 L1 L2 D1 D2 L1 L2
KC0 21 27 22 25 4 5 4 4 0 3 3 2
KC1 28 30 25 29 13 17 12 15 8 8 7 9
KC2 30 30 30 30 21 23 20 24 4 4 5 5
KC3 30 30 30 30 22 22 21 22 4 5 4 3
Ghi chú: Tổng số chồi được kích thích kéo dài của mỗi dòng dưa hấu nghiên cứu là 30 chồi.
Kết quả cho thấy, ở tất cả các công thức thí nghiệm dưa hấu D2 và L2 cho khả năng kéo dài tốt hơn so với dưa hấu D1 và L1. Ở cả 4 dòng dưa hấu, đối với công thức KC0 (0,0 GA3) thì hầu hết chồi phát triển chậm hơn so với trên môi trường có bổ sung GA3. Ở nồng độ 0,5 mg/l GA3, các chồi phát triển về chiều cao khá đồng đều, cây xanh tốt, một số cây có rễ, còn đối với nồng độ 0,7 mg/l GA3, dù thống kê về sự kéo dài chồi không khác biệt là mấy so với nồng độ 0,5 mg/l GA3 nhưng các chồi phát triển không đồng đều, lá cây có mầu vàng và số chồi có rễ ít hơn. Từ các kết quả trên, chúng tôi đã lựa chọn công thức kéo dài chồi KC2 là công thức tốt nhất.
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp GA3 và IBA đến sự kích thích kéo dài chồi 3.1.3. Kết quả tạo rễ cho chồi
Sau 2 tuần trên môi trường kéo dài, các chồi sẽ được chuyển sang môi trường tạo rễ có bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau. Kết quả được trình bày trong bảng 3.4 và hình 3.6. Kết quả cho thấy, trong các công thức thí nghiệm, công thức RR2, RR3 có tỷ lệ tạo rễ là rất cao. Tuy nhiên, ở công thức RR2, lá dưa hấu bị vàng, ít rễ chính, nhiều rễ phụ, còn ở công thức RR3 thì hầu hết các chồi đều ra rễ có màu vàng, to và ngắn, sần sùi, giòn và hầu hết bị gãy khi lấy cây ra khỏi môi trường thạch, vì thế 100% cây được ra rễ trên môi trường RR2, RR3 đều bị chết trong giai đoạn thích ứng với môi trường. Ở công thức RR1 (0,1 mg/l IBA) cây vẫn phát triển rất nhanh và tỷ lệ tạo rễ thấp hơn, nhưng cây xanh tốt, hầu hết không có rễ phụ, rễ mảnh, dai, ít bị đứt gãy khi lấy cây ra khỏi môi trường thạch. Ở công thức RR4
Các cụm chồi trƣớc khi
đƣợc kích thích kéo dài Các cụm chồi sau khi đƣợc kích thích kéo dài
Các chồi trƣớc khi đƣợc kích thích kéo dài
Các chồi sau khi đƣợc kích thích kéo dài
(1/2MS + 0,1 mg/l IBA) thì tỷ lệ ra rễ thấp và cây phát triển chậm, còi cọc, lá bị vàng. Có thể khẳng định RR1 (MS + 0,1 mg/l IBA) là công thức tốt nhất để tạo rễ cho các dòng dưa hấu nghiên cứu. Các cây hoàn chỉnh sẽ được chuyển sang các loại giá thể khác nhau để thích ứng dần với điều kiện môi trường.
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của IBA và môi trƣờng cơ bản đến khả năng tạo rễ của chồi dƣa hấu
Công thức
Số chồi đƣợc kích
thích tạo rễ Tỷ lệ chồi tạo rễ (%) Số rễ /chồi
D1 D2 L1 L2 D1 D2 L1 L2 D1 D2 L1 L2 RR0 27 24 30 28 51,9 54,2 53,3 56,7 1-2 1-4 1-3 1-3 RR1 30 27 30 30 70,0 77,8 76,7 80,0 1-5 1-6 1-5 2-7 RR2 30 30 30 29 86,7 83,3 86,7 86,2 1-3 1-5 1-3 1-5 RR3 28 21 30 27 85,7 90,5 90,0 92,6 1-3 1-5 1-3 1-3 RR4 30 16 28 30 46,7 56,3 53,6 46,7 1-2 1-2 1-2 1-3
Hình 3.6. Kết quả tạo rễ cho chồi dƣa hấu D2
(A: Công thức RR1; B: Công thức RR2; C: Công thức RR3)
3.1.4. Ảnh hƣởng của giá thể tiếp nhận đến khả năng thích ứng cây in vitro
Việc thích ứng cây in vitro ra môi trường là giai đoạn quan trọng trong quá trình nhân giống vô tính. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ... Khi chuyển ra ngoài với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác, cây con dễ bị mất nước mà chết. Vì vậy, phải tiến hành thích nghi dần dần cây con với điều kiện tự nhiên. Quá trình thích nghi là sự thay đổi những đặc điểm sinh lý và hình thái của cây con. Thời gian tối thiểu để cây con thích nghi được với môi trường sống là 2 - 3 tuần. Trong thời gian này, cây được chăm sóc và bảo vệ kĩ càng, tránh những hiện tượng: mất nước nhanh làm cây bị héo khô, nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng bị thối nhũn, cháy lá do nắng.
Tiến hành trồng cây trong bầu, chúng tôi thử nghiệm trên 2 loại giá thể với các thành phần khác nhau. Cây sau khi ra rễ được khoảng 2 – 3 tuần thì bộ rễ có thể thích nghi với môi trường mới được trồng với các loại giá thể trên. Các bầu cây được cho vào các khay, khay được đậy bằng túi nilon có đục lỗ, nuôi trong phòng đặt hệ thống giàn đèn nuôi cây hoặc trong buồng sinh trưởng có nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng tương đối ổn định, thời gian khoảng 1 tuần đến 10 ngày. Sau đó, các bầu cây được chuyển ra nhà lưới hoặc đặt nơi có ánh sáng khuyếch tán, thoáng mát, tưới đủ ẩm hàng ngày để cây dần dần thích nghi với môi trường tự nhiên. Kết quả thống kê sau 1 tháng trồng cây trong bầu được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.7.
Hình 3.7. Kết quả thích ứng cây in vitro GT1
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của giá thể đến khả năng thích ứng cây ra môi trƣờng Công thức Số cây đƣợc thích ứng Tỷ lệ cây sống (%) D1 D2 L1 L2 D1 D2 L1 L2 GT1 30 30 30 30 73,3 73,3 76,7 73,3 GT2 30 30 30 30 76,7 80 73,3 76,7
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy, ở cả hai công thức thí nghiệm, tỷ lệ cây sống sót được sau 1 tháng thích ứng với điều kiện môi trường ở cả 4 dòng dưa hấu là khá cao, giao động từ 73,3 đến 80%. Trong đó, ở công thức GT2 (1 cát đen : 1 trấu hun) cho tỉ lệ cây sống cao hơn ở cả. Dựa vào kết quả này, chúng tôi lựa chọn giá thể GT2 là giá thể để thích ứng cây dưa hấu in vitro ngoài điều kiện tự nhiên.
3.1.5. Tổng kết quy trình tái sinh
Hạt dưa hấu được khử trùng ngoài buồng cấy rồi tiếp tục được khử trùng trong buồng cấy theo quy trình: cồn 70% trong 1 phút, zavel thương mại 30% trong 15 phút rồi rửa lại 3 – 5 lần bằng nước cất khử trùng. Hạt sau khi tách vỏ được khử trùng lại bằng cồn 70% trong 1 phút, zavel thương mại 5% trong 5 phút rồi rửa lại 3 – 5 lần bằng nước cất khử trùng và được cho nảy mầm trên môi trường MS, 30% sucrose, 0,8% agar, pH = 5,8 nuôi trong tối. Sau 5 ngày, các mảnh lá mầm được cắt thành những mảnh có kích thước khoảng 1 – 2 mm2, sử dụng đầu lưỡi dao để tạo thêm các vết thương trên mặt lá rồi đặt trên môi trường tái sinh (MS bổ sung 3%sucrose, 1,5mg/l BAP, 0,5mg/l IBA, 0,8% agarose. Sau 6 tuần, các chồi hoặc cụm chồi thu được được chuyển sang môi trường tạo rễ (MS bổ sung 3%sucrose, 0,8% agarose, 0,2 mg/l IBA) hoặc môi trường kéo dài chồi (MS bổ sung 3%sucrose, 0,8% agar, 0,1mg/l IBA, 0,5mg/l GA3) trong 2 – 3 tuần tùy thuộc vào độ lớn của chồi. Các cây hoàn chỉnh sẽ được chuyển sang giá thể trấu hun : cát đen (1 :1) trước khi tiến hành đánh giá cây chuyển gen (hình 3.8).
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của một số yếu tố đến quá trình chuyển gen vào cây dƣa hấu thông qua chuyển gen gus
3.2.1. Đánh giá khả năng sống sót của cây dƣa hấu trên môi trƣờng chứa chất chọn lọc Km
Việc chọn lọc và xác định những cá thể mang đoạn gen chuyển là khâu rất quan trọng trong quá trình chuyển gen. Để chọn lọc có hiệu quả, cần xác định được nồng độ chất chọn lọc phù hợp giúp cho việc loại bỏ phần lớn những cá thể không được chuyển gen, đồng thời giữ lại các cá thể được chuyển gen. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm ảnh hưởng của các nồng độ Km 0, 50, 100, 150, 200 mg/l đến sự phát triển của chồi dưa hấu D2 trong 6 tuần nhằm xác định ngưỡng nồng độ Km phù hợp cho việc chọn lọc cây dưa hấu chuyển gen. Kết quả được trình bày trong bảng 3.6.
Hình 3.8. Một số hình ảnh về xây dựng quy trình tái sinh cây dƣa hấu. A: Hạt nảy mầm trên môi trường MS; B: Mảnh lá mầm 4-5 ngày tuổi được cấy lên môi trường tái sinh; C: Chồi được hình thành sau 2 tuần nuôi cấy; D: Cụm chồi sau 5 – 6 tuần nuôi cấy; E: Các cụm chồi cần chuyển sang môi trường kéo dài chồi; F: Các cụm chồi sau 2 tuần trên môi trường kéo dài chồi; G: Tạo rễ cho chồi; H: Thích ứng cây với môi trường.
G
A B C
E F H
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ Km đến sự phát triển của chồi Nồng độ Km (mg/l) Số chồi cảm ứng Số chồi sống Số chồi chết Tỷ lệ sống sót (%) 0 30 30 0 100 50 45 23 22 51,1 100 45 6 39 13,3 150 42 3 39 7,1 200 48 1 47 2,1
Kết quả cho thấy, Km có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sống sót, sinh trưởng, phát triển của các chồi dưa hấu. Ngay nồng độ 50mg/l đã có gần 50% cây bị chết sau 6 tuần nuôi cấy và tỷ lệ sống sót là 2,1% với nồng độ 200mg/l Km. Theo Brukhin và cộng sự (2000), ngưỡng nồng độ chất chọn lọc phù hợp là khi nó loại bỏ được khoảng 90% các cây không chuyển gen. Căn cứ vào kết quả trên, chúng tôi lựa chọn Km 100mg/l là ngưỡng chọn lọc cho các dòng dưa hấu chuyển gen của Việt Nam. Tuy nhiên, trong quá trình tái sinh chồi từ các mảnh lá mầm dưa hấu, do các mảnh lá mầm có sức sống tốt nên để loại bỏ bớt các chồi không mang đoạn gen chuyển, chúng tôi đã sử dụng Km ở nồng độ 200mg/l là nồng độ chọn lọc trong giai đoạn tái sinh chồi từ các mảnh lá mầm.
3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ vi khuẩn (OD600) đến hiệu quả chuyển gen
Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn đến hiệu quả của quá trình chuyển gen, các mảnh lá mầm của mỗi giống dưa hấu nghiên cứu được ngâm trong sáu nồng độ vi khuẩn khác nhau (OD600 0.0, 0.3, 0.5, 0.7, 0.9, 1.1) trong thời gian 30 phút. Sau 3 ngày đồng nuôi cấy, các mảnh lá mầm được nhuộm với dung dịnh X-gluc và đánh giá biểu hiện tạm thời của gen gus trong mô biến nạp. Kết quả thể hiện trên hình 3.9 cho thấy nồng độ vi khuẩn ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen. Hiệu quả chuyển gen tăng từ 2 đến 4 lần khi tăng nồng độ vi khuẩn từ OD=0,3 đến OD=0,7 và giảm dần khi tăng nồng độ OD = 0,9 và 1,1 (trừ dưa hấu
D1). Nồng độ vi khuẩn OD600 = 0,5 và 0,7 là thích hợp nhất cho dưa hấu L2 (tần số chuyển gen tương ứng là 88,76 và 86,67) và OD600 = 0,7 và 0,9 thích hợp nhất cho dưa hấu D2 (tần số chuyển gen tương ứng là 93,33 và 87,99%). Với các dòng còn lại, mặc dù tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus không cao bằng dưa hấu D2 và L2 nhưng ở nồng độ khuẩn OD600 = 0,7 cũng cho kết quả biểu hiện gus tạm thời khá cao (76,67% đối với D1 và 66,67% đối với L1), vì vậy chúng tôi lựa chọn nồng độ vi khuẩn này cho các thí nghiệm tiếp theo.
0 20 40 60 80 100 D1 D2 L1 L2 OD = 0 OD = 0.3 OD = 0.5 OD = 0.7 OD = 0.9 OD = 1.1
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của nồng độ vi khuẩn (OD600) đến biểu hiện gus
3.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian biến nạp đến hiệu quả chuyển gen
3.2.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm đến hiệu quả chuyển gen
Để xác định thời gian lây nhiễm tối ưu cho việc chuyển gen, các mảnh lá mầm được lây nhiễm với vi khuẩn trong 15, 30 và 45 phút ở nhiệt độ phòng với nồng độ vi khuẩn (OD600) = 0,7. Sự biểu hiện tạm thời của gen gus được phân tích sau 3
ngày đồng nuôi cấy. Kết quả (hình 3.10) cho thấy, thời gian lây nhiễm 30 phút cho tỷ lệ biểu hiện gus cao nhất ở dưa hấu D2 (93,33%) và L2 (86,67%). Thời gian lây nhiễm kéo dài 45 phút dường như không có tác dụng, chỉ làm tăng tỷ lê biểu hiện gen gus ở dưa hấu D1 và D2 lên 0,53 và 0,54%, nhưng lại làm giảm tỷ lện này ở dưa hấu L1 (6,1%) và L2 (0,73%) so với thời gian lây nhiễm 30 phút. Mức độ biểu hiện gen gus ở các dòng dưa hấu khi được lây nhiễm trong 30 và 45 phút cũng
không có sự khác biệt đáng kể. Vì thế, thời gian lây nhiễm 30 phút là ngưỡng được chọn để chuyển gen vào dưa hấu.
0 20 40 60 80 100 D1 D2 L1 L2 15 phút 30 phút 45 phút
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của thời gian lây nhiễm đến biểu hiện Gus
3.2.3.2. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen
Thời gian đồng nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả của quá trình chuyển gen. Mảnh lá mầm của các dòng dưa hấu được biến nạp với vi khuẩn (OD600) = 0,7 trong 30 phút và được đồng nuôi cấy trong thời gian 2, 3, 4 và 5 ngày. Sau đó, nhuộm các mảnh lá mầm với X-gluc để đánh giá biểu hiện tạm thời của gen gus. Kết quả được thể hiện trong hình 3.11.
0 20 40 60 80 100 D1 D2 L1 L2 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đến biểu hiện gus
Kết quả phân tích biểu hiện của gen gus (hình 3.11) cho thấy, thời gian đồng
nuôi cấy có ảnh hưởng khác nhau trên các dòng dưa hấu nghiên cứu. Nhìn chung, ở %
cả 4 dòng dưa hấu nghiên cứu, tỷ lệ biểu hiện gus tạm thời sau 2 ngày đồng nuôi
cấy đều rất thấp, giao động từ 20,4% đến 27,4%; tỷ lệ này lại rất cao và gần như giao động không đáng kể khi thời gian đồng nuôi cấy tăng từ 3 đến 5 ngày (trừ dưa hấu L1). Tỷ lệ biểu hiện gen gus cao ở dưa hấu D1, D2 và L2 (giao động từ 76,67% đến 95,35%) là sau thời gian đồng nuôi cấy 3 đến 5 ngày, trong khi đó đối với L1 là 2 ngày (90%). Tuy nhiên đối với dòng có phản ứng tốt với Agrobacterium như D2 và L2 mặc dù tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus cao nhất ở 4 ngày nhưng nguy cơ phát triển quá mức của Agrobacterium ở môi trường chọn lọc lại cao, ở 5 ngày cũng tương tự. Vì thế chúng tôi đã lựa chọn ngưỡng 3 ngày đồng nuôi cấy để chuyển gen vào hai dòng dưa hấu trên.
A B C D
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ vi khuẩn đến biểu hiện Gus
A. OD600 = 0,7; thời gian lây nhiễm 30 phút; B. OD600 = 0,7; thời gian lây nhiễm 45 phút; C. OD600 = 0,3; thời gian lây nhiễm 30 phút; OD600 = 0,9; thời gian lây nhiễm
30 phút
3.2.4. Kết quả biến nạp gen gus vào dƣa hấu
Sau khi tối ưu các yếu tố chủ yếu ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện gen tạm thời ở dưa hấu, chúng tôi có được quy trình chuyển gen như sau. Lá mầm 5 ngày tuổi được cắt thành những mảnh nhỏ có kích thước khoảng 1 – 2mm2, rồi ngâm vào