Báo cáo Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm trình bày các nội dung chính như: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật, kỹ thuật gieo cấy và phân lập, định lượng – tách vi sinh vật, quan sát vi sinh vật nói chung trên,...Mời các bạn cùng tham khảo!
Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh Khoa Kỹ Thuật Hố Học Bộ mơn Cơng Nghệ Thực Phẩm BÁO CÁO THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG SV: NGUYỄN THỊ KIM TIẾN_61103601 Tp HCM, 11/2013 Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG BÀI 1: MƠI TRƯỜNG NI CẤY VI SINH VẬT I Mục đích thí nghiệm Tạo mơi trường thuần khiết để ni cấy vi sinh vật Biết cách chuẩn bị dụng cụ cần cho q trình ni cấy Biết cách bao gói đĩa petri, pipet, ống nghiệm và vơ khuẩn chúng để đảm bảo mơi trường đủ sách cho việc ni cấy II Sơ lược lí thuyết Định nghĩa Mơi trường dinh dưỡng là 1 hỗn hợp các chất dinh dưỡng (những chất tham gia vào q trình nội bào), và những chất này có thể duy trì thế oxi hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định pH của mơi trường Phân loại Phân loại theo trạng thái lý hóa: Mơi trường lỏng: lên men, nhân giống, nghiên cứu một số đặc tính Mơi trường rắn(mơi trường đặc): mơi trường lỏng kết hợp với chất tạo đặc agar (22.5%), gelatin (1015%)để phân lặp, định lượng, gieo giống và giữ giống vi sinh vật. Mơi trường bán rắn: hàm lượng chất tạo độ đặc ít hơn mơi trường rắn thường dùng (0.30.7% agar) – dùng để quan sát khả năng chuyển động của một số vi sinh vật ( tạo nên đường đi trên bề mặt mơi trường) Phân loại theo thành phần: Mơi trường tổng hợp: Mơi trường tự nhiên: Mơi trường hịa tan chuẩn bị sẵn u cầu mơi trường dinh dưỡng Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết Có pH thích hợp Khơng chứa các yếu tố độc hại Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | Có độ nhớt nhất định Tuyệt đối vơ trùng III Cách tiến hành thi nghiệm Ghi chú: (1) Đun cách thuỷ: nhiệt độ: 42450C, thời gian 30 phút (2) Nâng nhiệt: 68700C, thời gian 1h (3) Chỉnh độ đường: dùng balling kế đưa về dung dịch đường 70 (4) Phân phối: 3 ống nghiệm 1/4, 2 ống nghiệm ½ Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | Hấp tiệt trùng: 1520p (5) Mơi trường thạch nghiêng: cho vào 1/4 ống nghiệm sau đó để nghiêng định hình Mơi trường thạch đứng: cho vào ½ ống nghiệm sau đó để thẳng đứng Thao tác phân phối phải nhanh, khéo léo để mơi trường khơng dính vào miệng ống nghiệm, đĩa petri hay nút bơng và cần thực hiện trước khi mơi trường bị đơng đặc Mơi trường thạch phải phẳng, nhẵn IV Kết quả Ta có cơng thức V1 . N1 = V2 . N2 V2= V1 . N1 / N2 Trong đó V1 Thể tích mơi trường sau khi lọc tinh N1 Độ đường sau khi lọc tinh N2 Độ đường cần điều chỉnh là = 70 Balling Thể tích nước cần thêm vào = V2 – V1 N1(0) 11 V N2 (0) V1(ml) 127 V2(ml) 200 VH2O thêm vào 73 Một số chú ý trong tiến trình thí nghiệm: Dụng cụ bao gói phải đảm bảo sạch và khơ Bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vơ trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng Đầu nút trịn, độ chặt vừa phải Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng Phần giấy bao gói phải chặt kín VI Bàn luận và mở rộng Đánh giá chất tạo đặc cho mơi trường: Gelatin tuy làm đơng mơi trường nhưng mơi trường tan chảy ở 37 0C, một nhiệt độ tối ưu của vi khuẩn gây bệnh cho động vật, ngồi ra thì nhiều vi sinh vật phân hủy gelatin làm lỏng mơi trường Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | Agar khơng chỉ đơng đặc tốt nhiệt độ dưới 400C mà cịn khơng bị vi sinh vật phân giải làm biến tính Giữ giống trên mơi trường thạch nghiêng Phương pháp này khá phổ biến vì rất đơn giản và tiện lợi, tuy nhiên thời gian giữ giống chỉ nên kéo dài trong 1 tháng , sau đó phẩi cấy truyền lại trên mơi trường mới. Do đó tốn nhiều cơng sức và dễ bị mất các đặc tính di truyền ban đầu. Phương pháp này được tiến hành như sau: Thuần khiết chủng vsv trên mơi trường agar đĩa petri, chọn các khuẩn lạc điển hình và cấy lên mơi trường thạch nghiêng thích hợp, sau đó ni cấy trong tủ ấm để vsv phát triển bình thường, lấy các ống giống ra và cho vào tủ lạnh giữ 4 oC, hàng tháng cấy truyền lại vào mơi trường mới Nên cho thêm vào mơi trường 0,1 M citrat natri hoặc 0,3M Oxalat để chống nhiễm Bacteriophage Hấp tiệt trùng Ngồi cách tiệt trùng sử dụng hơi nước bão hồ (nồi autoclave) thì tuỳ từng loại mơi trường mà có thêm một số phương pháp khác như: Phương pháp pasture: đun cách thuỷ ở nhiệt độ thấp 65700C, thời gian 15 30p Phương pháp Tyndal: Nhiệt độ tiệt khuẩn của phương pháp này từ 70 800C/1 giờ làm như vậy 3 lần, mỗi lần cách nhau 24giờ hoặc dùng nhiệt độ 60650C/1 giờ làm 5 lần. Thời gian nghĩ để ở nhiệt độ 370C. Phương pháp này thường được áp dụng tiệt khuẩn các sản phẩm dễ bị hỏng ở nhiệt độ cao. Tyndall cho rằng nhiệt độ 60650C hay ở 70800C, vi khuẩn thể ding dưỡng sẽ bị chết nhưng nha bào vẫn sống, khi để nguội đến 370C, nha bào chuyển sang thể hoạt động (thể dinh dưỡng) và lại bị tiêu diệt lần hấp sau đó Nhược điểm: kéo dài thời gian tiệt khuẩn, độ tiệt khuẩn khơng chắc chắn Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | BÀI 2: KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP I Gieo cấy Định nghĩa Gieo cấy là q trình chuyển các canh trường vi sinh vật từ mơi trường này sang mơi trường khác với mục đích nhân giống và giữ giống. Mơi trường mới đảm bảo thích hợp cho sinh vật sinh trưởng và phát triển Canh trường: mơi trường đã có vi sinh vật u cầu gieo cấy Khi gieo cấy cần đảm bảo vơ trùng tuyệt đối khu vực xung quanh, gieo cấy phải thực hiện trên ngọn lửa đèn cồn hay tủ cấy Dụng cụ: Que cấy nhọn, móc hoặc vịng, pipet, que trang, Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | Hình . Một số dung cụ và kỹ thuật gieo cấy vi khuẩn Kỹ thuật gieo cấy Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang ống chứa môi trường lỏng: nhân giống cấp 123 để lên men Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang môi trường đặc: phân lập, tạo khuẩn lạc Cấy chuyền từ canh trường đặc sang mơi trường đặc: giữ giống Các cách cấy truyền Phương pháp cấy trên thạch nghiêng: Hình . Mẫu cấy ziczac và cấy song song Hiếu khí: cấy điểm, cấy ziczac, cấy song song Yếm khí: đuổi khí, cấy đâm sâu vào trong ống nghiệm. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | Nếu cấy chuyền vi khuẩn hay nấm men thì di que cấy trên bề mặt thạch theo hình chữ chi hoặc vạch song song Cấy chuyển nấm mốc thì chỉ cần chạm que cấy lên bề mặt thạch Cấy trên mặt thạch đứng Cấy trên đĩa petri Cấy gạt: cho một ít mẫu vào mơi trường thạch trong petri sau đó dùng que trang dàn đều vi sinh vật trên bề mặt thạch trong hộp Hình . Cấy gạc trên mơi trường đĩa petri Cấy trộn: phối trộn dịch cấy với thạch (50 0C) sau đó lắc đều và đổ vào hộp petri đã khử trùng. Xoay trịn đĩa để thạch phân bố đều, để n cho mơi trường đặc lại và cuối cùng là bao gói và ni trong tủ ấm. (có thể cho dịch cấy vào petri trước và tiếp theo đổ thạch vào đĩa petri) Cấy ria: là việc sử dụng que cấy có chứa mẫu sau đó lướt que cấy lên mặt thạch theo hình chữ chi hay đường song song hoặc theo 4 góc Hình . Cách cấy truyền trên mơi trường đĩa thạch Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 10 Việc ứng dụng bột bào tử trong q trình lên men chao khơng những vẫn giữ được hương vị và chất lượng như sản phẩm chao truyền thống mà cịn mà cịn có thể rút ngắn thời gian lên men, góp phần tránh sự tạp nhiễm Phương pháp mới để sản xuất chao cơng nghiệp bằng Viên nấm Mucor: Viên mốc chứa số lượng lớn bào tử nấm mốc Actinomucor Elegans thuần chủng, thời gian bảo quản dài giúp lên men nhanh, nâng cao năng suất – chất lượng hơn so với những phương pháp trước đó Phómát Camembert Đây là một của nhiều phómát bề mặt chín. Có nguồn gốc từ Normandy, Pháp lần đầu tiên nó được làm bởi Marie Harel vào năm 1791. Năm 1890, M. Ridel phát triển hộp gỗ nổi tiếng tạo điều kiện xuất khẩu với lượng lớn Hình . Phomat Camembert Sau khi sữa đơng cịn rất non (ép thành bánh sữa), nó được chủng giống bởi bào tử của Penicillium camembert bằng cách phun như sương mù. Sau khi ngâm trong nước muối và đưa vào điều kiện thích hợp, sự phát triển của mốc bắt đầu tại bề mặt phómát trong suốt giai đoạn ủ. Vỏ cứng của phómát Camembert thì mỏng và trắng. Các dịng mốc chủng khác nhau có màu sắc trong khoảng từ xám lục nhạt tới trắng tinh. Bên trong của phómát phải là vàng nhạt với trung tâm màu trắng rắn chắc Trong q trình chín, các phân hố tố (enzim) thuỷ phân đạm và chất béo của P. camemberti khuyếch tán vào trong phómát Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 53 Tempeh Tempeh có nguồn gốc từ Java, Indonesia nhưng cũng được phổ biến ở Hà Lan và nó đã đạt được thị trường tiêu thụ đáng kể ở Mỹ, châu Âu và Úc. Tempeh là một bánh có thể thái (cắt) được, thu được bởi phương pháp lên men bề mặt với nấm của những hạt đậu, ngũ cốc hoặc vật liệu phù hợp khác sau khi đã ngâm rồi nấu. Cơ chất được dùng nhiều và phổ biến nhất là đậu nành (Nout and Rombouts, 1990; Wood, 1998). Tempeh cung cấp một nguồn đạm thực vật rẻ tiền giàu dinh dưỡng dễ tiêu hố và an tồn. Nó thường được ăn chỉ khi sau khi nấu hoặc rán/chiên trong dầu Đậu nành được ngâm và tách vỏ, hoặc tách vỏ khơ trước rồi ngâm (cơ giới hố như Hà lan) Trong q trình ngâm sự lên men lactic tự nhiên diễn ra làm hạ thấp pH của đậu, làm cho chúng phù hợp hơn cho sự phát triển của nấm mốc và chống lại vi khuẩn gây hư hỏng và các mầm bệnh Hình . Tempeh và món ăn làm từ nó Sau khi nấu sơi và làm nguội, làm cơ chất cho q trình lên men. Mốc chức năng chính yếu là Rhizopus oligosporus và R.oryzae, chúng nảy mầm nhanh ở 37°C và phát triển sợi nấm nhanh của chúng đảm bảo sự chiếm ưu thế và lấn át các dòng tạm nhiễm khác như Aspergillus spp. trong vòng 30 giờ các đậu rời rạc đã được kết chặt lại nhau tạo thành khối rắn. R.oligosporus được khảo sát là thâm nhập khoảng 2mm vào sâu bên trong đậu nấu Hoạt động enzim của Rhizopus spp. bao gồm enzim thuỷ phân protein, enzim thuỷ phân chất béo, enzim thuỷ phân các hơp chất cácbon và phosphatase. Nhờ hoạt Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 54 động của các enzim này, một phần các cơ chất mạch dài bị thuỷ phân thúc đẩy cho sự tiêu hoá dễ dàng Qui trình mới cải tiến đã được báo cáo bao gồm tiến trình bán liên tục cho lên men tempeh với nhiệt độ được điều khiển trong thùng lên men xoay vịng Nước tương đậu nành Nó là một chất lỏng nâu xậm trong với thành phần xấp xỉ: 17% NaCl, 1,6% đạm tổng số, 1% đạm formol, 3% đường khử, 2,3% rượu alcohol và pH 4.7. Về cơ bản của q trình chế biến (Hình 7.4) bao gồm 3 giai đoạn: đậu nành lên men trong nước muối và lọc trong. Nó được chủng giống với bào tử Aspergillus oryzae hoặc A.sojae và được ủ ở 25°C trong 23 ngày để thu được sự phát triển dày đặc và sự tạo bào tử xanh vàng chỉ ra rằng mức độ cao của enzim đã được tạo ra. Những enzim này bao gồm peptidases, proteinases, glutaminase, amylase, pectinases cellulases cần thiết cho sự thuỷ phân từng phần của đạm và các hợp chất carbon của vật liệu thô Giai đoạn 2 lên men trong nước muối diễn ra trong mẽ nước muối 2225% NaCl để vi sinh vật gây hư hỏng khơng thể phát triển nhưng sự phân cắt enzim vẫn diễn ra. Tuy nhiên, trong 2 tháng đầu ở 1520°C, vi khuẩn axít lactic (Tetragenococcus halophila) và những tháng tiếp theo 30°C, nấm men ưa muối (Zygosaccharomyces rouxii) sẽ phát triển, vào khoảng thời gian chín, những sản phẩm trao đổi chất của chúng thêm vào thành phần hương vị thực chất thơm ngon của nước tương Hình . Nước tương lên men tự nhiên Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 55 Làm giàu thêm đạm cho thực phẩm tinh bột và thức ăn gia súc Do có khả năng phân cắt vật chất cácbon, nấm là hữu dụng trong việc nâng cao giá trị dinh dưỡng của các sản phẩm phụ nơngcơng nghiệp sau chế biến, chẳng hạn như tinh bột chứa trong chất cặn bã khoai lang (Yang et al., 1993) hoặc bã mía đường cellulose (MooYoung et al., 1992). Cho mục đích thêm vào các nguồn đạm rẽ tiền như (NH4)2SO4 và urea có thể biến đổi thành đạm vì thế làm giàu dinh dưỡng thêm cho thức ăn. Sản phẩm cuối cùng (sau vài ngày lên men) có thể chứa dựng xấp xỉ 30% đạm thơ trên trọng lượng khơ, khi sử dụng nấm Aspergillus niger, Rhizopus spp và Neurospora sitophila Thành phần thức ăn và gia vị có nguồn gốc từ nấm mốc a. Axít hữu cơ Axít hữu cơ được tạo ra bởi sự lên men có thể phân thành hai nhóm: (i) được tạo ra thơng qua lộ trình axít carboxylic, (ii) được tạo ra trực tiếp từ đường glucose Ở nhóm (i), axít citric là axít hữu cơ quan trọng nhất được tạo ra bới sự lên men Sản lượng hàng năm ước tính khoảng 400.000 làm chủ yếu với Aspergillus niger nhưng Yarrowia lipolytica cũng được sử dụng. Hệ thống ni cấy bề mặt cũng như bề sâu (chìm) được sử dụng cho sự biến đổi những nguồn carbon rẻ tiền (mật đường) và nalkanes. Axít citric được sử dụng rộng rãi trong cơng nghiệp thực phẩm, chất hương vị… Trong nhóm (ii) axít gluconic (50.000 tấn/năm) được làm ra chủ yếu với vi khuẩn, nhưng A. niger và A. foetidus được sử dụng trong các qui trình ni cấy bề mặt và ni cấy chìm. Axít lactic (30.000 tấn/năm) đươc làm ra chủ yếu với vi khuẩn lactic, nhưng cũng với Rhizopus oryzae và có những ứng dụng rộng rãi trong cơng nghiệp thực phẩm như chất axít, nhân tố bảo quản, bột nướng … (Mattey, 1992) b. Chất béo (lipids) Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 56 Hàm lượng chất béo của nấm đơi khi có thể cao đến 6080% sinh khối khơ Tuy nhiên, chất dầu và chất béo động và thực vật là rẻ tiền hơn để sản xuất, vì chỉ những sản phẩm đặc sản thì việc lên men là sự quan tâm về mặt kinh tế Nói riêng, khả năng tích luỹ axít béo khơng no từ nấm là lý thú về quan điểm dinh dưỡng. Nhiều nấm mốc được sử dụng thương mại để tạo ra axít γ–linolenic, trên nguồn đạm và cacbon rẻ tiền (bã nho, tinh bột, mật rỉ đường), Mucor javanicus và M. rouxii có thể phát triển trong mơi trường nuối cấy chìm sản lượng axít γ– linolenic 0,33g/l. Những trường hợp như thế hàm lượng lipid là 711% của sinh khối khơ axít γ–linolenic chiếm 1737% trọng lượng lipid (Lindberg and Hansson, 1991) c. Phân hoá tố (enzim) Trong số những phân hoá tố enzim được tạo ra bởi sự lên men, chiếm đa số enzim thuỷ phân đạm (proteases) enzim thuỷ phân hợp chất cacbon (carbonhydrases) Enzime thuỷ phân đạm thu từ Aspergillus oryzae, Penicillium roquefortii và Mucor spp. được ứng dụng trong chất tẩy rửa, và trong chế biến thực phẩm như làm nhanh chín phómat, làm bánh mì, sự làm mềm thịt Enzim thuỷ phân hợp chất carbon bao gồm enzim thuỷ phân tinh bột (αamylase, glucoamylase) được tạo ra bởi Aspergillus oryzae và A. niger và được ứng dụng trong làm bánh mì, ủ bia rượu, và bánh kẹo. Những carbonhydrases khác là cellulase được tiết ra bởi A. niger, Penicillium spp. và Trichoderma reesei; enzim thuỷ phân pectin (pectinases) được tạo ra bởi Aspergillus spp.; và β–glucanase được tạo ra bởi A. niger, Penicillium spp. những enzim này được ứng dụng để thúc đẩy sự tiêu hố của thực phẩm có sợi, sự tinh lọc nước trái cây và bia… Những enzim quan trọng khác bao gồm enzim thuỷ phân chất béo (lipases) được tạo ra bởi Mucor spp. và A niger ứng dụng cho sự phát triển hương vị các sản phẩm từ sữa. Glucose oxidase được tạo ra bởi A. niger đã có nhiều ứng dụng trong thực phẩm và y học… Mặt khác, có sự phong phú của những cơ chất có thể được tạo ra bởi nấm, bao gồm axít amin, các hợp chất đường, các sinh tố vitamins, phẩm màu và các thành phần hương vị… Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 57 Tuy nhiên cũng phải nói tới tác hại mà nấm mốc mang lại: Penicillium, Mucor, Rhizopus, Aspergillus phân giải chất đường, bột làm cho thực phẩm bị biến chất, thành phần dinh dưỡng giảm, cảm quan thay đổi. Aspergillus flavus hay có trong lạc, ngơ, cùi dừa khơ, đỗ tương khơ tiết ra độc tố Aflatoxin gây bệnh nguy hiểm, đặc biệt là bệnh ung thư Hình . Nấm mốc tân cơng nơng sản, trái cây BÀI 8: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG DỊ HỐ CARBONHYDRATE I Sơ lược lý thuyết Carbohydrat Carbohydrate bao gồm: Đường đơn: glucose, galactose, fructose Đường phức gồm: o Đường oligo: sacharose, lactose, maltose o Đường đa phân tử: tinh bột và cellulose Q trình chuyển hố Carbohydrat Q trình chuyển hóa từ đường phức thành đường đơn chủ yếu chuyển hóa theo 2 con đường đó là q trình lên men và q trình hơ hấp So sánh lên men và hơ hấp: o Giống nhau: Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 58 Đều là q trình dị hóa các hợp chất hữu cơ để cung cấp năng lượng, ngun liệu cho tế bào vi sinh vật o Tạo sản phẩm trung gian: acid pyruvic Có sự tham gia của hệ enzyme oxy hóa khử Q trình xảy ra là chuỗi của các phả ứng oxy hóa khử Khác nhau: Bảng . So sánh hơ hấp và lên men Hơ hấp Lên men Vị trí xảy ra Màng tế bào vi sinh vật Tế bào chất của vi sinh vật Tham gia của O2 Cần O2 Khơng cần O2 Mức độ oxi hố Hồn tồn Khơng hồn tồn Chất cho nhận e Năng lượng Chất cho hợp chất hữu Chất cho nhận electron cơ và chất nhận là hợp chất đều là hợp chất hữu cơ vơ cơ Nhiều Ít Sản phẩm CO2 + H2O Các acid hữu cơ, ethanol, glycerol So sánh giữa hơ hấp yếm khí và hơ hấp hiếu khí: o Giống nhau: o Đều sinh năng lượng Đều tạo sản phẩm trung gian acid pyruvic Xảy ra trong q trình dị hóa Khác nhau: Hiếu khí phản ứng oxy hóa xảy ra hồn tồn, cịn yếm khí xảy ra khơng hồn tồn Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 59 Hiếu khí tạo sản phẩm cuối CO2 + H2O, cịn yếm khí sản phẩm cuối H2 Tiến hành thí nghiệm II Làm mơi trường OF (M9) Tiến hành làm mơi trường với thành phần các chất như trong hướng dẫn của sách thí nghiệm Thu được 1l mẫu Chia đều cho 6 tổ: 150ml/tổ Ống nghiệm: 10 ống/ tổ. Cho vào mỗi ống 10ml mẫu Ống dầu paraffin: ½ ống Hấp tiệt trùng Để nguội Sau đó tiến hành cho vi sinh vật vào: o Mỗi loại VSV (0.2ml) làm thành 2 mơi trường (hiếu khí và yếm khí): 2x4 VSV = 8 ống nghiệm o Hai ống nghiệm cịn lại (ống kiểm chứng) thực hiện tương tự như 8 ống trên nhưng khơng cho vi sinh vật vào o Giữ mẫu trong tủ ấm 23 ngày. Sau đó quan sát Làm mơi trường yếm khí Sau khi cho mơi trường M9 và VSV vào ống nghiệm => Đuổi khí (nghiêng trên ngọn lửa đèn cồn) => Gắn nút bong => Nhỏ đèn cầy kín miệng ống nghiệm => Bao nylong một lần nữa Làm mơi trường tinh bột (M8) o Tiến hành làm mơi trường với thành phần các chất như trong hướng dẫn của sách thí nghiệm o Hấp tiệt trùng o Để nguội => đặc o Hé mở hộp petri o Lấy 1 ít giống A.oryza o Gieo cấy điểm bằng cách lật ngược hộp petri chấm vào giữa hộp Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 60 Bao gói, ni tủ ấm 2 – 3 ngày Ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc, sau đó nhỏ dung dịch luygol lên trên mặt petri. III Kết quả mở rộng Sau 2 3 ngày ni mẫu trong tủ ấm, kết quả: Thí nghiệm khả năng dị hố các loại đường Nấm men Cả 2 ống hiếu khí và yếm khí đều đổi màu từ xanh sang vàng do xảy ra q trình dị hố carbonhydrat. Trong mơi trường hiếu khí: sản phẩm tạo ra là CO2 + H2O. Trong mơi trường yếm khí: sản phẩm tạo ra là axit Hình . Mẫu nấm men hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải) so với mẫu chuẩn Bacillus Subtilis Cả 2 mẫu hiếu khí và yếm khí đều chuyển màu, từ xanh sang vàng Mẫu hơ hấp hiếu khí vàng nhiều hơn Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 61 Hình . Mẫu hơ hấp hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải) Lacto bacillus Cả 2 mẫu hiếu khí và yếm khí đều chuyển màu, từ xanh sang vàng xanh Theo lý thuyết mẫu yếm khí vàng nhiều hơn do q trình oxi hố xảy ra mạnh hơn nhưng do q trình đuổi khí khơng hồn tồn nên màu sắc mẫu yếm khí thực tế khác lý thuyết Hình . Mẫu Lacto bacillus hơ hấp hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải) Nấm mốc A.Oryzae Mẫu hơ hấp hiếu khí đổi màu từ xanh sang vàng đậm Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 62 Mẫu hơ hấp yếm khí cũng đổi màu sang vàng. Điều này sai với lý thuyết do nấm mốc thường hơ hấp hiếu khí hồn tồn, mơi trường sẽ khơng đổi màu. Lý do sai số: q trình đuổi khí thực hiện chưa nghiêm ngặc hoặc do canh trường vi sinh vật tạp nhiễm VSV khác ngồi nấm mốc Hình . Mẫu A.oryzae hơ hấp hiếu khí (bện trái) và yếm khí (bên phải) Thí nghiệm khả năng thuỷ phân Carbohydrat D = 4cm d = 3.5cm Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 63 Hình . Mẫu trước và sau khi nhỏ luygol Phần nào tinh bột thủy phân mơi trường sẽ trong suốt. Khơng thủy phân mơi trường sẽ có màu xanh Ứng dụng khả năng dị hố các loại đường của VSV vào trong sản xuất: + Nấm men: ứng dụng hơ hấp yếm khí vào q trình sản xuất thực phẩm như làm cơm rượu, muối chua,… + A. Oryzae: ứng dụng sự thuỷ phân cả nó vào việc sản xuất nước tương, hệ enzyme của nó thuỷ phân bã đậu nành tạo mơi trường lên men axit xitric tốt nhất BÀI 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 64 CÁC LOẠI ĐƯỜNG I Ngun lý Khơng phải bất cứ vi sinh vật nào cũng có khả năng lên men, tuỳ từng loại đường Sản phẩm của q trình đó: axit hữu cơ, khí, Sự thay đổi Ph: làm đổi màu mẫu thí nghiệm Sử dụng ống Durham quan sát bọt khí tạo thành Một số vi khuẩn tạo váng trên bề mặt/ tạo tủa (sinh khối) phía dưới ống nghiệm II Tiến hành thí nghiệm Làm môi trường M10 4 erlen chứa 4 loại đường khác nhau với nồng độ 5%: 5g đường mỗi loại (glucose, maltose, lactose, saccharose) pha với 100ml nước cho m ỗi erlen. 1 erlen pha môi trường lên men: peptone – 10g, cao nấm men – 2,5g, Bromthymol Blue – 2ml, hịa tan với nước cất. Sau đó dùng máy đo pH và NaOH để đưa pH của dung dịch về pH = 7±0.2. Thêm nước cất đưa về thể tích 900ml Hút 9ml mơi trường phân phối vào 13 ống nghiệm. Cho ống Durham vào (lưu ý cho ống Durham thả thẳng đứng vào để tránh có bọt khí) Đậy nắp ống nghiệm và bao gói cẩn thận Đem tất cả 4 erlen dung dịch đường và 13 ống nghiệm hấp tiệt trùng Cấy vi sinh vật vào môi trường: Lần lượt cho 1ml của 4 loại đường vào môi trường, mỗi loại cho vào 3 ống nghiệm. 1 ống nghiệm sẽ được cho một loại đường bất kỳ vào để làm ống chuẩn Tiếp tục cho 0,2ml của 3 loại vi sinh vật: nấm men, L.acidophillus, Acetobacterxylium lần lượt vào ống nghiệm loại đường Bao gói cẩn thận, ni tủ ấm ở nhiệt độ 28300C trong vịng 2448 giờ, sau đó quan sát và ghi kết quả Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 65 III Kết quả Nấm men L.acidophillus Aceto bacterxylium Sacarose Lactose Maltose Glucose Đổi màu: xanh lá => vàng sậm Có bọt khí trong ống Durham Màu vàng ánh xanh (xanh nhiều hơn vàng) Không đổi màu: dd vẫn giữ màu xanh Không đổi màu: dd vẫn giữ màu xanh lá Màu vàng ánh xanh (vàng nhiều hơn xanh, nhiều hơn ống với glucose) Vàng ánh xanh Đổi màu sang vàng Đổi màu: xanh lá => vàng sậm Có bọt khí trong ống Durham Màu vàng ánh xanh (vàng nhiều hơn xanh) Vàng ánh xanh Vàng ánh xanh Vàng ánh xanh Hình ảnh Hình . Nấm men trong mơi trường Sacaroselactosemaltoseglucose (trái). Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 66 Hình . L.acidophillus trong mơi trường theo thứ tự SLML Hình . Acetobacterxylium trong trong mơi trường theo thứ tự SLML IV Mở rộng Việc tìm hiểu xem loại VSV nào có khả năng lên men loại đường nào và loại nào là tốt nhất nhằm mục đích chọn được chủng vi sinh vật tối ưu tuỳ theo mục đích sản phẩm. Ví dụ: + Nấm men có khả năng lên men mạnh Glucose, Sacarose. Ứng dụng lên men ngun liệu giàu những loại đường này: các dịch quả => tạo rượu + Acetobacterxylium có khả năng lên men hầu hết các loại đường nên phạm vi ứng dụng rộng Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 67 ... sát. Phân loại: kính hiển? ?vi? ?quang? ?học, kính hiển? ?vi? ?huỳnh quang, kính hiển? ?vi? ?điện tử Cấu tạo của kính hiển? ?vi? ?quang? ?học( gồm 2 bộ phận: cơ? ?học? ?và quang? ?học) : Bảng . Cấu tạo kính hiển? ?vi? ?quang? ?học Bộ phận cơ? ?học. .. Cơ sở: phân tích thống kê số liệu BÀI 4: QUAN SÁT? ?VI? ?SINH? ?VẬT NĨI CHUNG TRÊN KÍNH HIỂN? ?VI? ?QUANG HỌC I Giới thiệu sơ lược kính hiển? ?vi Kính hiển? ?vi? ?là một hệ thống quang? ?học? ?dùng để phóng đại ảnh của? ?vật? ?cần quan sát. Phân loại: kính hiển? ?vi? ?quang? ?học, kính hiển? ?vi? ?huỳnh quang, kính hiển? ?vi? ?điện tử... BÀI 1: MƠI TRƯỜNG NI CẤY? ?VI? ?SINH? ?VẬT I Mục đích? ?thí? ?nghiệm Tạo mơi trường thuần khiết để ni cấy? ?vi? ?sinh? ?vật Biết cách chuẩn bị dụng cụ cần cho q trình ni cấy Biết cách bao gói đĩa petri, pipet, ống? ?nghiệm? ?và vơ khuẩn chúng để