Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm lê văn việt mẫn, lại mai hương

LỜI NỒI ĐẨU 5Bài l l Định lƯỢng vi sinh vật bằng phương pháp Bài 14 Xác định sự sinh trưởng của vi sinh vật thông qua Chương 3 KHẢO SÁT HÌNH THÁI VÀ MỘT số TÍNH CHẤT SINH LÝ CỦA VI SINH

LÊ VĂN VIỆT MẪN (Chủ biên)

LẠI MAI HƯƠNG

G T 0 3 S V (V )

LỜI NỒI ĐẨU 5

Bài l l Định lƯỢng vi sinh vật bằng phương pháp

Bài 14 Xác định sự sinh trưởng của vi sinh vật thông qua

Chương 3 KHẢO SÁT HÌNH THÁI VÀ MỘT số TÍNH CHẤT SINH LÝ CỦA VI SINH VẬT

Chương 4 XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU VI SINH CỦA THỰC PHẨM

Bài 31 Phát hiện Listeria bằng phương pháp phản ứng dây chuyền

Bài 39 Xác định mức độ nhiễm vi sinh vật của không khí

Phụ lục 1 NHỮNG MÔI TRƯỜNG sử DỤNG TRONG CÁC BÀI THÍ NGHIỆM 126

Phụ lục 2 NHỮNG THUỐC NHUỘM, THUỐC THỬ VÀ DUNG DỊCH ĐỆM sử

Vi sin h vật học thực p h ẩ m là m ột môn học cơ sở của ngành Công nghệ thực phẩm M ôn học này cung cấp cho sinh viên những kiến thức cơ bản về vi sinh đại cương và vi sin h ứng d ụ n g trong lĩn h vực sản xuất thực p h ẩ m ở quy mô công nghiệp.

T H Í N G H IỆ M V I S I N H V Ậ T H Ọ C T H ự C P H Ẩ M được biền soạn đ ể g iả n g dạy m ôn học T h í n g h iệ m vi sin h vật học thực p h ẩ m cho sin h viên ng à n h Công nghệ thực p h ẩ m , Trường Đ ại học B ách klio a -Đ ạ i học Quốc g ia T P Hồ C hí M inh

N ội d u n g q u yển sách được chia th à n h 5 p h ầ n chính:

P h ầ n 1: M ộ t số kỹ th u ậ t cơ bản của vi sin h vật h ọ c-b a o g ồ m kỹ th u ậ t chuẩn

bị m ôi trường, p h â n lập, gieo cấy, nuôi cấy, g iữ g iố n g vi sin h vậ t (6 bài)

P h ẩ n 2: Giới th iệu m ộ t số phương p h á p đ ịn h lượng vi sin h vật (8 bài).

P h ầ n 3: K hảo sá t h ìn h th á i và m ộ t số tín h ch ấ t sin h lý của n h ó m vi sin h vật thường gặp tro n g thự c p h ẩ m (9 bài).

P h ầ n 4: Giới th iệ u p hư ơ ng p h á p k iể m tra các chỉ tiêu vi sin h trong thực

p h ẩ m -b a o g ồ m các chỉ tiêu liên quan đ ế n n h ó m vi sin h vật hoại sin h lẫn n h ó m vi sin h vật gây b ệ n h (14 bài).

P h ầ n 5: Vệ sin h công n g h iệp -G iớ i th iệu các p h ư ơ ng p h á p k iể m tra vi sin h nguồn nước, m ô i trường k h ô n g k h í trong p h â n xưởng sả n x u ấ t và tìn h trạ n g vệ sin h của các th iế t bị sản x u ấ t trong quy trìn h công nghệ (3 bài).

T rong qu á trìn h biên soạn, ch ú n g tôi có giới th iệ u m ộ t sổ p hư ơ ng p h á p mới trong p h â n tích vi sin h thự c p h ẩ m n h ư phương p h á p đ ịn h lượng vì sin h vật thông qua h à m lượng A d en o sin e TriP hosphate A T P , p h ư ơ ng p h á p xác đ ịn h vi sin h vật bằng kỹ th u ậ t p h ả n ứng d â y chuyền sử d ụ n g p o lym era se (Polym erase Chain Reaction - PCR) hoặc kỹ th u ậ t m iễn dịch (Im m unological technique) Q uyển sách

n à y củng là tà i liệ u th a m khảo cho n h ữ n g người d a n g công tác trong lĩn h vực sản

x u ấ t thực p h ẩ m n ó i chung.

Giáo trìn h được p h â n công biên soạn n h ư sau:

T S Lê Văn V iệt M ẫn: biền soạn chương 2, 4 và 5

T S Lại M ai Hương: biên soạn chương 1 và 3.

C h ú n g tôi m o n g n h ậ n được ý kiến đóng góp của bạn dọc về nội d u n g quyển sách d ề n h ữ n g lầ n tái bản sau được hoàn ch ỉn h liơn.

T lu i từ góp ỷ xin gửi về:

Bộ môn Công nghệ thực phẩm , Trường Đại học Bách kh o a -Đ ạ i học Quốc g ia TP

H ồ Chí M inh, 26 8 L ý T h ư ờ n g K iệt, Q uận 10, T P Hồ C hí M inh.

Đ iện th o ạ i: (08) 864 62 51.

T S L ê V ă n V iệ t M ẩ n

Chương 1

MỘT SỐ KỸ THUẬT cơ BẢN CỦA VI SINH VẬT HỌC

B à i 1 T IỆ T TRÙNG DỤNG c ụ V À MÔI TRƯỜNG LÀM VIỆC

1 T iệ t t r ù n g b ề m ặ t v à m ô i trư ờ n g là m v i ệ c

Khi làm việc với vi sinh vật, đề trán h bị lây nhiễm những vi sin h v ậ t không mong muốn ở môi trường xung quanh, cần phải đảm bảo sao cho môi trường và bề m ặt làm việc được vô khuẩn Sự vô trùng của nơi làm việc không những phụ thuộc vào phương pháp tiệ t trùng m à còn phụ thuộc rấ t nhiều vào điều kiện và sự thông gió nơi làm việc Nơi làm việc không được có sự thông khí ngay cả khi không khí đó đã được lọc

Cách tiến h à n h :

- Cửa sổ và cửa ra vào phải được đóng c h ặ t trước th ờ i điểm làm việc

- Để tiệ t trù n g không khí trong phòng dùng đèn u v , lắp tr ê n tr ầ n n h à , có thế

được b ậ t tro n g thời gian 15 phút K hông khí được chiếu ƯV sẽ sin h ra ozone, bởi vậy n g ay sau thời gian b ậ t đèn u v , k h ô n g khí sẽ có mùi đặc trưng

tố t hơ n với p ro p an o l 70% Khi lau cồn, lưu ý k h ô n g được b ậ t đ è n cồn vì

có th ể x ả y r a h ỏ a hoạn

2 T iệ t t r ù n g d ụ n g c ụ là m v iệ c

a- Đ ụ n g cụ b ằ n g th ủ y tin h h o ặ c k im lo ạ i

C h u ẩ n bị trước k h i tiệt trùng:

- Trước k h i t i ệ t trù n g , dụng cụ th ủ y tin h cần được làm sạch v à sây khô

- Sau đó, gói kín trong giấy, trong giấy bạc hay để trong hộp đậy kín để đảm bảo sau khi tiệ t trùng, dụng cụ không còn bị nhiễm lại vi sinh v ật từ môi trường ngoài

- Ô ng n g h iệm th ủ y tin h cần được đậy b ằ n g n ú t bông k h ô n g th ấ m nước, sau đó gói k ín p h ầ n đầu ống nghiệm có n ú t b ô n g vào giấy rồ i mới đem t iệ t trù n g

- Hộp p e tri c ần được gói kín tro n g giấy

- P ip e t th ủ y tin h cần được gắn m ột n ú t bông nhỏ ở p h ầ n cuối của pipet, sau

đó bọc k ín tro n g giấy

- Que trang, đũa thủy tin h nếu cần tiệt trù n g cũng cần phải được gói kín vào giấy

N h ừ n g dụng cụ b ằ n g th ủ y tin h có th ể được tiệ t trù n g b ằ n g h a i phương pháp:

tr iệ t trù n g b ằ n g n h iệ t khô hoặc tiệ t trù n g b ằ n g n h iệ t ẩm

Phương p h á p tiệ t trù n g hằng n h iệ t khô:

- Sấy tro n g tủ sấ y ở n h iệ t độ 170-180°c tro n g thờ i g ian 2,5 giờ đối với v ậ t cần tiệ t trù n g k h ô n g có n ắ p bông

Phương p h á p tiệt trùng bằng nhiệt ẩm: thường được thực hiện trong nồi autoclave

b- D ụ n g cụ b ằ n g p l a s t i c c h ịu n h iệ t

O ng n g h iệm có n ắ p n h ự a chịu n h iệ t, n ắ p b ằ n g teflon, b ằ n g cao su h ay đầu

m icro p ip ette được t iệ t trù n g b ằ n g n h iệ t ẩm tro n g nồi autoclave ở áp su ấ t 0 ,lM P a tương ứng với n h iệ t độ 121°c tro n g th ờ i gian 20-30 phút

c- M ôi tr ư ờ n g n u ô i c ấ y v i s in h v ậ t

- Môi trư ờ n g nuôi cấy vi sin h v ậ t thường được tiệ t trù n g tro n g autoclave ở

trù n g và th ư ờ n g kép d ài từ 20-30 p h ú t

- Đối với nh ữ n g th à n h p h ần của môi trường dinh dưỡng n h ạy cảm với n h iệt độ cao không th ể sử dụng phương pháp tiệ t trù n g bằng n h iệ t trong nồi autoclave

T rong nhữ ng trường hợp đó cần sử dụng m àn g lọc vi kh u ẩn đế tiệ t trùng

Có thế' th a m k h ả o m ộ t số phương p h áp t iệ t trù n g kh ác n h au và ứng dụng của

4- Ống nghiệm hay bình thủy tinh có chứa môi trường nuôi cấy 5- Dụng cụ lọc tiệt trùng

6- Môi trường rẳn, môi trường lòng, paraffin

Nhiệt khô tới

1 40-1 60 °c

1- Dụng cụ thủy tinh không chứa môi trường nuôi cấy (có thể có nảp bông) 2- Pipet có nút bông được gói trong giấy hay đựng trong hộp nhôm

3- Hộp petri, que trang, phểu thủy tinh,

4- Hóa chất hay chất dinh dưỡng dạng bột (tùy theo khả năng chịu nhiệt) 5- Dầu có nhiệt hóa hơi lớn hơn nhiệt độ tiệt trùng

4- Bột hóa chất hay gia vị kém bền nhiệt 5- Ống ly tâm bằng nhựa, bao bì nhựa Tia uv, tia X, tia

MỒT SỐ KỸ THUẬ T cơ BẦN CỦA VI SlNH VẬ T HOC

B à i 2 CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CAY VI SIN H VẬT

1 N g u y ê n lý

Môi trư ờ n g nuôi cấy cung cấp đầy dủ nhu cầu d in h dưỡng cần th iế t cho sự

p h á t tr iể n của vi sin h v ật

P hân loại m ô i trường nuôi cấy:

1- Theo cấu trúc, môi trường nuôi cấy vi sin h v ậ t có th ể được chia ra làm ba

loại: m ôi trư ờ n g lỏng, môi trường rắn và môi trư ờ n g b á n rắ n :

- M ôi trường lỏng: thư ờ ng sử dụng để n h â n giống, lên m en h ay n g h iên cứu

m ột số đặc tín h của vi sinh vật Môi trư ờ n g lỏ n g k h ô n g chứa c h ấ t làm đặcmôi trư ờ n g n h ư a g ar, gelatin

- M ôi trường rắn (m ôi trường đặc): thường dược tạ o th à n h b ằ n g cách cho m ột

h àm lượng n hỏ a g a r h ay gelatin vào môi trư ờ n g lỏng để làm đặc môi trường Môi trư ờ n g r ắ n thường được sử dụng đế p h â n lập vi sin h v ậ t, để quan s á t h ìn h th á i k h u ẩ n lạc hoặc để n g h iên cứu m ột số đặc tín h khác

- M ôi trường bán rắn: có hàm lượng các c h ất tạ o độ đặc ít hơn so với môi

trư ờng rắ n , do đó có cấu trúc dạng dẻo Môi trư ờ n g b án r ắ n được sử dụng

tro n g m ộ t số trư ờ n g hợp, ví dụ để xác đ ịn h k h ả n ă n g chuyển động cua m ột

sô loài vi k h u ẩn

2- Theo th à n h p h ầ n , môi trường nuôi cấy còn có th ế được ch ia th à n h môi

trư ờng tổ n g hợp và môi trường tự n h iên :

- Môi trường tổ n g hợp: có th àn h phần h ó a học xác đ ịn h được m ột cách chính

xác Môi trư ờ n g tổ n g hợp thườn? dược ch u ẩn bi từ n h ữ n g hơp c h ấ t hóa học tin h k h iế t có công thức hóa học xác định

- M ôi trường tự n h iên : thường bao gồm n h ữ n g hợp c h ấ t chưa được xác đ ịn h rõ

th à n h p h ầ n , k h ô n g có công thức hóa học rõ ràn g ; ví dụ n h ư pepton, cao

th ịt Môi trư ờ n g tổ n g hợp có độ lặp lạ i cao tro n g khi môi trư ờ n g tự n h iên

có độ lặp lại tù y thuộc vào nhà sản x u ất

- M ôi trường hò a tan chuẩn bị sẩn: đế tiệ n lợi cho người sử dụng, ngày nay

nh iều n h à sả n x u ất đã cung cấp nhiều môi trư ờ n g p h a trộ n sẵ n d ạn g bột

N hữ ng m ôi trư ờ n g d ạn g này có th ể được sử dụng r ấ t đơn g iản b ằn g cách hòa ta n vào nước m ột hàm lượng n h ấ t định là đã có đủ t ấ t cả các th à n h

b ằn g nước Có th ể sử dụng nước c ất hoặc nước m áy tùy thuộc vào yêu cầu cua mỗi trư ờng nuôi cấy.

- K iểm tr a pH b ằ n g m áy đo pH hoặc b ằ n g g iấy quỳ tím N ếu pH k h ô n g đúng với yêu cầu, có th ể ch ỉn h pH b ằ n g d ung dịch N aO H h a y HC1

- Sau k h i điều ch ỉn h pH về giá trị th íc h hợp, p h â n phôi môi trư ờ n g nuôi cấy vào ốn g n g h iệm hay b ìn h nuôi cấy

- Đ óng n ắ p ống n g h iệm b ằ n g n ú t b ô n g k h ô n g th ấ m nước N ếu sử d ụ n g ống

n g h iệm có n ắ p có th ề v ặ n kín, k h ô n g v ặ n c h ặ t h o àn to à n n ắ p ố n g ngh iệm

để khi tiệ t trù n g hơi có th ể th o á t ra

- Sau k h i p h â n phối vào ống nghiệm h a y b ìn h nuôi cấy, môi trư ờ n g d in h dưỡng cần p h ả i được tiệ t trù n g ngay vì vi sin h v ậ t có th ể p h á t tr iể n r ấ t n h a n h trong môi trư ờng chưa tiệ t trù n g và làm th a n h đổi th à n h p h ầ n môi trường

- Sau khi tiệ t trùng, làm nguội tới n h iệ t độ phòng, sau đó bảo quản tro n g tủ lạnh

6- C h u ẩ n b ị m ô i tr ư ờ n g r ắ n và b á n r ắ n

- Đôi với m ôi trư ờ n g có chứa c h ấ t làm đặc n h ư a g ar, n ấ u ch ảy a g a r tro n g 1/2

th ể tíc h nước dùng để p h a m ôi trư ờ n g

- C ân v à h ò a ta n các th à n h p h ầ n k h á c của m ôi trư ờ n g tro n g 1/2 lượng nước còn lại

- Khi a g a r đ ã ta n h o àn to à n , trộ n lẫ n các th à n h p h ầ n d in h dưỡng k h á c với dung dịch có chứa a g ar

- L àm đ ầy lên th ể tích cần th iế t b ằ n g nước, sau đó p h â n phối ngay vào ống

n g h iệm hoặc b ìn h nuôi cấy khi dung dịch còn nóng N ếu đế nguội, a g a r sẽ đặc lạ i và sẽ k h ô n g th ế r ó t vào ống n g h iệm được nữa

- Đ óng n ắ p ống n g h iệm và tiệ t trù n g n h ư đối với môi trư ờ n g lỏng

- Sau k h i t iệ t trù n g , đối với th ạ c h n g h iên g , cần đ ặ t ốn g th ạ c h n g h iê n g có chứa m ôi trư ờ n g còn n ó n g ở vị tr í n ằ m n g h iê n g cho tới k h i nguội

- Bảo q u ản m ôi trư ờ n g đã đông đặc tro n g tủ lạ n h ở vị tr í lậ t ngược

B à i 3 KỶ TH UẬT GIEO CAY VI SIN H VẬT

1 N g u y ê n lý

Để có th ể nuôi cấy vi sin h v ậ t, cần p h ả i thư ờ ng xuyên cấy vi sin h v ậ t từ m ôi trư ờ ng này san g môi trường khác và phải đảm bảo tro n g khi cấy chuyền k h ô n g làm nhiễm vi sin h v ậ t đang sử dụng với những vi sin h v ậ t không m ong m uốn từ môi trường xung quanh

Vi sin h v ậ t th ư ờ n g được cấy chuyền b ằ n g que cấy vòng h a y que cây n h ọ n

T rong n h ữ n g trư ờ n g hợp đặc b iệ t, có th ế d ù n g n h ữ n g dụng cụ k h ác để cấy chuyền

vi sin h v ậ t n h ư p ip et, que đầu có quấn bông, que tr a n g hav ông tiêm

2 P h ư ơ n g p h á p c ấ y c h u y ề n

- Mỗi l ầ n cây chuyền, chỉ nên dùng m ộ t loại vi sin h v ậ t để t r á n h n h iễm chéo các loại vi sin h v ậ t với n h au Ghi n h ã n từ n g ố ng n g h iệm sẽ cấy chuyền với đ ầy đủ các th ông tin về vi sin h v ậ t tro n g ố ng n g h iệ m , bao gồm:

tê n vi s in h v ậ t, n g ày cấy chuyền, m ôi trư ờ n g cây chuyền

- C ầm que cấy tro n g tay phải (tay th u ận ), ống n g h iệm gốc và ống n g h iệm sẽ cấy chuyền tro n g tay trái

- T iệt trù n g que cấy 'bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn tới khi que cấy nóng đỏ

- Mở n ắ p ống n g h iệm gốc trước b ằn g cách dùng n g ó n ta y ú t k ẹp c h ặ t n ú t bông vào lòng b à n tay, từ từ xoay và kéo n ú t b ô n g ra khỏi ống n g h iệm , hơ

n ú t b ô n g và m iện g ống nghiệm gốc trê n ngọn lửa đèn cồn Chú ý, k h ô n g làm ch áy n ú t bông cũng như không làm rơi n ú t bông xuống b à n cấy h a y để

n ú t b ô n g chạm vào b ấ t cứ v ậ t gì xung quanh! L uôn giữ m iện g ống ngh iệm đang m ở ở vị trí n ằm nghiêng và gần ngọn lửa đ èn cồn

- Mở n ắ p ông n g h iệm sẽ cấy chuyền b ằ n g cách k ẹ p c h ặ t n ú t ông n g h iệm giữa

ngón ú t và ngón áp út và làm tương tự n hư trư ờ n g h ợ p ống n g h iệm gốc.

- Cho que cấy đã vô khuẩn và làm nguội vào ống n g h iệm gốc, lấy m ộ t vòng

que cấy m ôi trư ờng (lỏng hoặc đặc) có chứa vi sin h v ậ t và chuyển nó san g môi trư ờ n g tro n g ống nghiệm thứ hai

- Nếu câ'y chuyền vi khuẩn hoặc n ấm m en, người ta th ư ờ n g di que cấy có chứa

canh trư ờ n g vi sin h v ậ t lên bề m ặ t th ạc h a g a r ở ống n g h iệm th ứ 2 theo

h ìn h chữ chi hoặc vạch song song

- N ếu vi sin h v ậ t cần cấy chuyền là n ấ m mốc th ì chí cần chạm nhẹ que cấy

lên bề m ặ t th ạ c h ở giữa ống nghiệm

- R út que cấy ra, ho' đỏ trê n ngọn lửa đ èn cồn đế vô k h u ẩ n sau đó đ ặ t que cấy lên giá đỡ ỏn g nghiệm

- Hơ lầ n lượt m iện g ống nghiệm và n ú t bông qua ngọn lửa đ è n cồn sau đó đậy

n ắ p ố n g n g h iệm lại Lưu ý, n ú t bông của ống n g h iệm nào th ì đậy đ ú n g ống

n g h iệm đó

- Que tr a n g và đũa th ủ y tinh được dùng đế' d à n đều vi sin h v ậ t trê n bề m ặt

th ạ c h tro n g hộp p e tri Que trang và đũa thủy tin h có th ể đưực tiệ t trù n g bằng cách n h ú n g vào cồn 90-95% sau đó hơ trên ngọn lửa đèn cồn hay bọc kín vào giấy sau đó tiệ t trù n g bằng n h iệt khô trong tủ sấy (170°c tro n g 2,5 giờ) hay

n h iệ t ẩm trong nồi autoclave

- Khi cấy chuvền, 0,l?nZ dung dịch có chứa vi sinh v ật được nhỏ vào giữa môi trường đặc trong hộp petri, sau đó được dàn đều bằng que tra n g ra toàn bộ bề mặt

- Đ ể cấy chuyền m ộ t lượng ch ất lỏng lớn hơn có th ể dùng p ip ie t đã dược vô

k h u ẩ n Đầu to của pipet cần phải được n h ét bông để trá n h làm nhiễm b ẩn dung dịch được cấy chuyền

MỘT SỐ KỸ THUÂ T cơ BẢN CỦA VI SINH VÁ T HỌC

B à i 4 KỶ TH UẬT NUÔI CAY VI S IN H V Ậ T

1 Nuôi cấy trong m ôi trường lỏng

Vi sin h v ậ t h iếu khí có th ể p h á t tr iể n tố t tro n g m ộ t lớp m ỏng m ôi trường lỏng tro n g điều k iệ n nuôi cấy tĩn h T rong trường hợp này, b ìn h tam giác có th ể được làm đầy tới 1/10 th ể tích

Đối với lớp c h ấ t lỏng dầy hơn, vi sin h v ậ t hiếu khí sẽ c ần p h ả i được cung cấp

th êm k h ô n g k h í b ằ n g cách lắc h ay sục khí B ình tam giác có th ể được làm đ ầy tới 30% th ể tích k h i được lắc ở tốc độ 150 vòng/phút Lưu ý k h i lắc k h ô n g được để môi trư ờng lỏng làm ướt n ú t bông vì điều đó sẽ làm cản trở sự lưu th ô n g k h ô n g k h í hay tạo điều k iện th u ậ n lợi cho vi sin h v ậ t từ ngoài n h iễm vào m ôi trư ờ n g d in h dưỡng tro n g bình

2 Nuôi cấy trong m ôi trường dặc

Vi sin h v ậ t th ư ờ n g được nuôi cấy tro n g môi trư ờng đặc tro n g hộp p e tri hay tro n g ống th ạ c h nghiêng Môi trường nuôi cấy thường được làm đặc b ằn g 1-2% agar, 14% gelatine h ay silica gel Tuy nh iên ch ất làm đặc hay được sử dụng n h ấ t là agar Agar nóng chảy ở 100°c và đông đặc ở 40-43°C tùy thuộc vào nồng độ Agar có th ể được hòa ta n tro n g nồi autoclave bằng cách n ân g n h iệt độ lên 121°c sau đó lập tức tắ t nguồn nhiệt Phương pháp th ứ hai có th ể nấu chảy agar b ằn g cách đun cách thủy, tuy

nh iên cách n ày sẽ tốn nhiều thời gian hơn

Để làm được m ộ t ống th ạ c h n g h iên g tro n g ống n g h iệm k ích thước 1 6 0 x l6 /n m ,

cần tới 6m l m ôi trường agar Đối với hộp petri có đường k ín h 90-100m m , cần tới lOĩĩil môi trường agar cho những quá trìn h nuôi cấy bình thường h ay 15m l cho những quá

trìn h nuôi cấy dài hơn

3 Nuôi cây vi sin h vật vi h iếu khí

Vi sin h v ậ t vi hiếu khí là nhóm vi sin h v ậ t p h á t tr iể n tố t n h ẩ t tro n g môi

quyển Để nuôi cấy nhóm vi sin h v ậ t n à y tro n g phòng th í n g h iệ m h ay sử dụng

4 Nuôi cấy vi sin h v ậ t kỵ khí

T rong p h ò n g th í n g h iệm , vi sin h v ậ t kỵ khí có th ế được nuôi cấy b ằ n g cách loại trừ h o àn to à n 0 2 ra k h ỏ i môi trư ờ n g xung quanh, b ằ n g cách sử dụng môi trư ờng có tín h k h ử h a y k ế t hợp cả h ai phương pháp

tự do ví dụ n h ư thioglycollate (H SC H 2COONa) C h ất chỉ th ị m àu thư ờ ng được cho vào môi trư ờ n g để có th ể n h ậ n b iế t sự có m ặ t của 0 2 Ví dụ re s a z u rin có m àu hồng khi môi trư ờ n g nuôi cấy có chứa 0 2 và k h ô n g m àu khi k h ô n g có 0 2

MỒT SỐ KỸ THU Ả ĩ cơ BẢN CỦA VI SINH VẢ ĩ HOC

N hừ ng m ôi trư ờ n g b ìn h thường, không có tín h k hứ có th ế được sử dụng đế

nuôi cấy này b ằ n g túi G as-P ak và ch ất xúc tác palladium T rong túi G as-P ak có chứa sodium b icarb o n ate và sodium borohydride Khi cho nước vào tro n g túi n ày sẽ giải phóng ra khí H 2 và C 0 2 H 2 sẽ tác dụng với 0-2 tro n g b ìn h nhờ xúc tác của palladium

M ethylene blue được sử dụng như ch ất chỉ th ị màu M ethylene blue có m àu xanh khi

có oxy và không m àu khi bị khử 0 2

ơ nhữ ng p h ò n g th í nghiộm hiện đại ngày nay th ư ờ n g có tr a n g bị tủ nuôi cấy

kỵ khí K hông k h í tro n g n h ữ n g tủ này được h ú t h ế t ra ngoài b ằ n g bơm ch ân k h ô n g

và sau đó được th a y b ằ n g C 0 2 hay N 2

B à i 5 CÁC KỶ THUẬT PHÂN LẬP VI SIN H VẬT

T rong tự n h iê n , p h ầ n lớn vi sinh v ậ t tồn tạ i lẫ n với n h au tro n g m ột tậ p hợp bao gồm n h iều sin h v ậ t h ay vi sinh v ậ t khác nhau Đề có th ế n g h iên cứu tín h c h ấ t hoặc ứng dụng của vi sin h v ậ t thường phải p h â n lập ch ú n g ra n h ữ n g vi sin h v ậ t riên g rẽ

H iện nay, có ba phương pháp hay được sử dụng đế p h â n lập vi sin h v ậ t là phương p h á p đổ đĩa, phương pháp dàn đều và phương p h á p cấy ria:

I- P h ư ơ n g p h á p d ồ d ĩ a

N g u y ên lý: m ộ t lượng nhỏ vi sinh v ậ t đầ pha lo ãn g được trộ n đều với môi

trư ờ ng a g ar n ó n g ch ay và dươc đổ vào hôo p e tri đ ă vô k h u ẩ n Sau th ờ i gian nuôi cấv ở n h iệ t độ th íc h hợp, vi sinh v ậ t sè mọc th à n h n h ữ n g k h u ẩ n lạc riê n g rẽ Mỗi khuẩn lạc sẽ chỉ bao gồm m ộ t loài vi sinh v ậ t th u ầ n chủng

Cách tiến h à n h :

- N ấu ch ảy b a ống ngh iệm có chứa 19m ỉ môi trư ờ n g d in h dưỡng đặc

- Đ ặt ba ống nghiệm có môi trường đã nóng chảy vào bể điều n h iệ t ở 45-50°C

- C huẩn bị s ẵ n b a h ộ p p etri đã vô khuẩn, ghi độ p h a lo ãn g lên mỗi hộp

- C họn dung dịch chứa hỗn hợp vi sinh v ậ t cần p h â n lập

- H ú t 1 m l d ung dịch chứa hỗn hợp vi sin h v ậ t cho vào ống n g h iệm th ứ n h ấ t,

lắc kỹ tr ê n vo rtex , ta có độ pha loãng 1/20

- H ú t 1 m ỉ dung dịch ở độ pha loãng 1/20 cho sa n g ống n g h iệm th ứ 2, lắc kỹ

tr ê n vortex, ta có độ pha loãng 1/400

- H ú t 1 m ỉ d ung dịch ở độ pha loãng 1/400 cho sa n g ôn g n g h iệm th ứ 2, lắc kỹ

tr ê n vo rtex , ta có độ pha loãng 1/8000

- Đố ba ốn g n g h iệm vào ba hộp petri vô k h u ẩ n đ ã ghi n h ữ n g độ p h a loãng tương ứng Đ ể nguội và nuôi cấy ở vị tr í lậ t ngược ở n h iệ t độ th íc h hợp cho loài vi sin h v ậ t m uôn p h ân lập

- Sau th ờ i g ian nuôi cấy, tách riên g từng k h u ẩ n lạc riê n g rẽ

2- P h ư ơ n g p h á p d à n đ ề u

N g u yên lý: m ộ t lượng nh ỏ vi sin h v ậ t đ ã được p h a lo ãn g trước được d àn đều

lên tr ê n bề m ặ t hộp p e tri có chứa môi trư ờ ng d in h dưỡng th ích hợp

Cách tiế n h à n h :

- Môi trường ag ar nóng chảy được đố vào hộp p etri vô kh u ẩn và để cho đặc lại

- 0,1/n/ dung dịch có chứa hỗn hợp vi sin h v ậ t cần p h â n lậ p ở các độ pha

lo ãn g k h á c n h au được p ip et vào các hộp p e tri đã chứa môi trư ờ n g đặc và được d à n đều ra k h ắ p bề m ặ t hộp b ằ n g que tr a n g vô k h u ẩ n

- Sau đó tá c h rời các k h u ẩ n lạc mọc lên tr ê n bề m ặ t m ôi trư ờ n g đặc

3- P h ư ơ n g p h á p c â y r ia

N g u yên lý: que cấy được sử dụng đế cấy ria n h iều lần hỗ n hợp vi sin h v ật cần

phân lập tr ê n k h ắ p bề m ặ t môi trường đặc tro n g hộp p e tri Sau mỗi lần cấy ria, vi sin h v ậ t sẽ hi tác h d ầ n ra khỏi h ỗ n hợp và p h á t tr iể n th à n h m ột k h u ẩ n lạc riê n g rẽ

- Sau đó tá c h rờ i các k h u ẩ n lạc mọc lên tr ê n bề m ặ t m ôi trư ờ n g đặc

H ìn h 1.1 P hương p h á p cấy ria

B à i 6 CÁC PHƯƠNG PHÁP GIỮ G Iố N G VI SIN H VẬT

Các ch ủ n g vi sin h v ậ t th u ần k h iế t sau khi p h â n lậ p được cần p h ả i được bảo quản ở điều k iệ n tố i ưu sao cho sau thời gian bảo quản ch ú n g v ẫ n ở tr ạ n g th á i h o ạ t động và giữ được h o ạ t tín h k h ô n g bị th ay đổi

1 Các phương p h áp cấ y chuyền

Cấy c h u yề n đ ịn h kỳ: vi sin h v ậ t có th ể được cấy chuyền từ m ôi trư ờng nuôi

cấy cũ sa n g m ôi trư ờ n g mới đế đảm bảo nhu cầu d in h dưỡng cho vi sin h v ậ t Thời gian giữa h a i lầ n cấy chuyền dao động từ vài tu ầ n đ ến v à i th á n g tù y từ n g loại vi

sinh v ật N ếu vi sin h v ậ t sau khi cấy chuyền được bảo q u ản ở n h iệ t độ th ấ p th ì có

th ể kéo d à i th ờ i g ian giữa h ai lần cấy chuyền

Bảo q u ả n dưới dầu: paraffin phủ tr ê n lớp th ạ c h n g h iê n g sẽ giúp n g ăn cản sự

bay hơi nước của môi trư ờ ng nuôi cấy vi sin h v ậ t và làm ch ậm tốc độ p h á t tr iể n của vi sin h v ậ t n h ờ h ạ n ch ế 0 2

P hương p h á p thực hiện:

- C ấy ch u y ền vi sin h v ậ t sang ống n g h iệm và đế cho vi sin h v ậ t có th ờ i gian

p h á t t r iể n tố t ở n h iệ t độ tối ưu

- T iệ t tr ù n g p araffin hai lần ở 121°c, 15 p h ú t

- Đổ p a ra ffin đã t iệ t trù n g lên lớp th ạ c h n g h iê n g có chứa vi sin h v ậ t sao cho

lớp p a ra ffin cao hơn lớp thạch n g h iên g 1 cm

- Có th ể b ảo quản ở n h iệ t độ th â p hay n h iệ t độ p h ò n g

- Thời g ian giữa hai lầ n cấy chuyền có th ể lên đ ế n v ài n ă m tù y thuộc vào

từ n g loài vi sin h v ật

Bảo q u ả n trong nước:

- C ắ t m ộ t k h ô i a g a r 6m m từ rìa k h u ẩ n lạc

- Đ ặ t k h ô i a g a r đó vào tro n g ống n g h iệm có chứa nước c ấ t vô k h u ẩ n , đậy c h ặ t

2 Các phương pháp sấ y khô hoặc đông cô

Sấy kh ô là m g iảm sự trao đổi c h ấ t của vi sin h v ậ t T ế bào h a y bào tử vi sin h

v ậ t có th ể được sấ y khô b ằn g cách thổi k h ô n g k h í, b ằ n g các c h ấ t h ú t ẩm n hư silica gel hay đ ấ t h a y b ằ n g phương p h áp đông cô T hường bào tử có h à m lượng nước th ấ p hơn so với t ế b ào d in h dưỡng và chịu được điều k iệ n khô tố t hơn

Báo q u ả n trong silica g e l:

- Silica gel được đổ vào 1/3 ống n g h iệm và tiệ t trù n g ở 180°c, 3 giờ

- Cho ống n g h iệm tr ê n vào tủ đông ở -20°c

- C h u ẩn bị huyền phù bào tử vi sin h v ậ t tro n g 5% dung dịch sữ a gầy

- ĐỐ hu y ền phù bào tử vào silica gel lạ n h v à lắc đều

- Bảo q u ản ống n g h iệm ở n h iệ t độ thư ờ ng với n ắ p k h ô n g v ặ n c h ặ t cho tớ i khi silica gel khô

- Vặn c h ặ t n ắ p ống ngh iệm và bảo q u ản ở 4°c

Đ ông cô:

- C h u ẩn bị h ỗ n hợp vi sin h v ậ t tro n g 10% sữa gầy h ay tre h a lo s e đ ã vô k h u ẩn

- Cho 0,2-0,5m l h ỗ n hợp có chứa vi sin h v ậ t vào am poule đã t iệ t trù n g

- Đ ặ t hờ n ắ p cao su lên m iện g am poule

- Đ ặ t am poule vào m áy đông cô ở n h iệ t độ -35°c

- Khi n h iệ t độ tro n g am poule h ạ xuống -20°c, b ậ t bơm ch ân k h ô n g

- Sau 3 giờ, tă n g n h iệ t độ của m áy lên 10°c với 0,08°c/m in

- T ắ t m áy đông cô sau 24 giờ, n ú t cao su sẽ bị h ú t vào cổ am poule

- L ấy am poule r a k h ỏ i m áy và có th ể h à n k ín m iện g am poule b ằ n g ngọn lửa

Bảo q uản ở n h iệ t độ lạ n h đ ô n g :

H ạ th ấ p n h iệ t độ m ôi trư ờ n g nuôi cấy vi sin h v ậ t sẽ làm g iảm quá tr ìn h trao đổi c h ấ t cho tới k h i nó dừng h ẳ n khi to à n bộ nước tro n g t ế bào vi s in h v ậ t bị đóng băng Dưới -70°c, h ầ u n h ư k h ô n g còn có sự trao đổi c h ấ t n ào của vi sin h v ậ t Tuy

n h iên , sự th a y đổi cấu trú c tin h th ể đá v ẫ n có th ể xảy ra ở n h iệ t độ -135°c Bởi vậy, bảo quản vi sin h v ậ t ở n h iệ t độ của n itơ lỏng (-196°C) là phương p h á p bảo quản an to à n n h ấ t h iệ n n ay đ an g được sử dụng

- C h u ẩn bị h ỗ n hợp vi sin h v ậ t tro n g 10% glycerol vô k h u ẩ n

- Cho 0,5m l h ỗ n hợp tr ê n vào ống n g h iệm b ằ n g n h ự a đã vô k h u ẩ n

- L àm lạ n h ông n g h iệm xuống -50°c với v ậ n tốc làm lạ n h th íc h hợp cho từ ng loài vi sin h v ậ t

- Khi n h iệ t độ hỗn hợp đã h ạ th ấp xuống -50°c, đ ặ t ống nghiệm vào nitơ lỏng

N goài n itơ lỏng, vi sin h v ậ t có th ể được bảo quản ở n h iệ t độ cao hơ n n hư -2 0 ° c , - 4 0 ° c hoặc - 7 0 ° c , tuy n h iê n n h iệ t độ càn g cao th ì th ờ i g ian b ảo q u ản càng

n g ắn và vi sin h v ậ t càn g dễ bị m ấ t h o ạ t tín h

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

MỞ ĐẨU

Việc đ ịn h lượng vi sin h v ậ t trong thực p h ẩm là r ấ t cần th iế t Điều đó cho

p h ép ch ú n g ta đ á n h giá c h ấ t lượng vệ sin h an to àn của s ả n p h ẩm Các chỉ tiêu vi sin h của thực p h ẩm thư ờ ng liên quan đến h àm lượng của m ộ t sô" loài vi sin h v ậ t hoại sin h hoặc vi s in h v ậ t gây bệnh trong thực phẩm N goài ra , dựa vào các chỉ tiê u vi sin h của thực p h ẩm , chúng ta có th ể đ á n h giá k h á i q u á t về tìn h tr ạ n g vệ sin h tro n g quy tr ìn h s ả n x u ất của các cơ sở chế biến

T ro n g công n g h ệ lên m en thực phẩm và công n g h ệ vi sin h nói chung, khi thự c h iệ n các quá tr ìn h nuôi cấy vi sinh v ậ t ở quy mô p h ò n g th í n g h iệm cũng như quy mô công n g h iệp , việc theo dõi sự sinh trư ử ng của giống vi sin h v ậ t tro n g canh trư ờ n g cũng râ"t quan trọ n g Nó giúp cho các n h à công nghệ hiểu rõ hơn về động học của quá tr ìn h lên m en, từ đó đề xuất các giải p h á p kỹ th u ậ t để điều k h iển quá

tr ìn h lên m en tạo ra các sả n phẩm như ý muôn

H iệ n n a y có r ấ t n h iều phương pháp vừa để định lượng vi sin h v ậ t tro n g m ẫu thực p h ẩ m n h ằ m m ục đích kiểm tra chỉ tiêu vi sin h s ả n p h ẩ m , vừa để định lượng

vi sin h v ậ t tro n g các can h trư ờng lên men n h ằm mục đích th eo dõi sự sín h trưởng của vi sin h v ậ t tro n g quá trìn h nuôi cấy Tuy n h iê n , có m ộ t số phương p h áp chỉ được sử d ụ n g để th eo dõi sự sin h trưởng của vi sin h v ậ t tro n g các quá tr ìn h lên

B ả n g 2.1 Các phương pháp định lượng vi sinh vật hoặc đảnh giá

sự sinh trưởng của chúng

Nhóm phương pháp Tên phương pháp Phạm vi áp dụng

- Định lượng vi sinh vật trong thực phẩm

- Khảo sát sự sinh trưởng của vi sinh vật trong canh trường lên men

Phương pháp X ó c định

sinh khối

- Phương pháp đo độ đục

- Phương pháp xác định hàm lượng chất khồ của sinh khối

- Khảo sát sự sinh trưởng của vi sinh vật trong canh trường lên men

Phương pháp xác định

hàm lượng các chất nội

bào

- Hàm lượng A T P nội bào - Định lượng vi sinh vật trong thực phẩm

- Khảo sát sự sinh trưởng của vi sinh vật trong canh trường lên men

- Hàm lượng NAD, NADH

Nếu vi sin h v ậ t d ạn g đơn bào, đứng riên g lẻ và có kích thước lớn (vài

m icrom eter) th ì ta có th ể sử dụng các buồng đếm và k ín h h iển vi để đ ịn h lượng số tế bào trong mẫu Phương pháp này thường được sử dụng để đếm m ột số loài nấm m en

và vi khuẩn N ấm sợi và xạ khuẩn có h ìn h sợi; riên g n ấm sợi có bào tử với kích thưíớc

r ấ t nhỏ Do đó, ta không th ể sử dụng buồng đếm để định lượng nấm sợi và xạ khuẩn.Phư ơng p h á p đếm t ế bào b ằ n g buồng đếm v à k ín h h iể n vi th ư ờ n g được sử dụng để th eo dõi sự sin h trư ở n g của vi sin h v ậ t tro n g các quá tr ìn h lên m en th ự c

h iện tr ê n m ôi trư ờ n g lỏng Phương p h á p n à y k h ô n g được áp d ụ n g đ ể k iểm tr a h à m lượng vi sin h v ậ t tro n g các m ẫu thực p h ẩm

c ấ u tạ o b u ồ n g đ ế m : có n h iều loại buồng đếm k h á c n h au Tuy n h iê n , nguyên tắc cấu tạ o của ch ú n g lại giống nhau B uồng đếm là m ột p h iế n k ín h dày, với bề

m ặ t h ìn h chữ n h ậ t (H.2.1) T rê n bề m ặ t buồng đếm , có đục bố n r ã n h song song với

th à n h h a i k h o an g nhỏ Bi và B2 nhờ m ột r ã n h đục song song với chiều dài của bề

m ặ t buồng đếm T rê n m ỗi k h o an g n hỏ, người ta có kẻ m ộ t lưới đ ếm gồm nhiều ô lớn h ìn h vuông hoặc h ìn h chữ n h ậ t M ột số ô lớn được chia tiế p th à n h các ỏ nhỏ hơn Buồng đếm có k èm th eo lá k ín h để đậy Lá k ín h có bề m ặ t h ìn h vuông và r ấ t phẳng C hiều cao của buồng đếm và d iện tíc h m ộ t ô lớn th ư ờ n g được ghi ở m ột góc trê n bề m ặ t buồng đếm

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VÀT 19

T h ô n g thường, các buồng đếm có chiều cao h dao đ ộng từ 0,01m ra đến 0,1- 0,2m m N h ữ n g buồng đếm có chiều cao th ấ p (h = 0,01 m m ) n h ư Petroff-H auser thường được sử dụng đế đếm vi k h u ẩn N h ữ n g buồng đếm có chiều cao lớn hơn (h = 0,1-0,2m m ) n h ư Thom a, M alassez, G oraev đưọ'c dùng để đếm n ấ m m en H ìn h 2.2

va 2.3 mô tả lưới đếm của buồng đêm T h o m a và M alassez

T iếp th eo , ta sẽ xem x é t kích thước của m ột sô buồng đếm th ô n g dụng Buồng đếm T hom a có t ấ t cả 16 ô vuông lớn kích thước n h ư n h au , m òi ô vuông lớn được chia th à n h 16 ô vuông nhỏ b ằ n g n h au Mỗi ô vuông nhỏ có cạn h d à i (l/20)m m Buồng đêm M alassez có t ấ t cả 25 ô h ìn h chữ n h ậ t, m ỗi ô h ìn h chữ n h ậ t được chia

th ả n h 20 ô vuông C hiều dài m ỗi cạnh ô vuông nhỏ là (1/20)m m

H ìn h 2.1: Cấu tạo bu ồ n g đ ế m tế bào ui sin h vật

C hiều cao buồng đếm : h = 0,2771771

2 C á c h th ự c h iệ n

T rong b à i th í n g h iệm n ày , ch ú n g ta sẽ đếm n ấ m m en tro n g c a n h trư ờ n g lỏ m g ,

sử dụng buồng đếm T hom a hoặc M alassez

Lắc t h ậ t đều can h trư ờ n g b a n đầu: nếu can h trư ờ n g được đựng tro n g e rle n tth ì dùng cá từ để trộ n m ẫu, n ếu can h trư ờ n g được đựng tro n g ốn g n g h iệm th ì sử diụing

th iế t bị trộ n V ortex để các vi sin h v ậ t p h â n b ố t h ậ t đều tro n g c an h trư ờ n g ILúấy

m ẫu và tiế n h à n h p h a lo ãn g m ẫu b ằ n g nước vô k h u ẩ n N ếu cần xác đ ịn h tỷ lệ tế bào n ấ m m en sống và c h ết, sử d ụ n g dung dịch x a n h m e th y le n để p h a lo ãn g lắần cuối với độ p h a lo ãn g h ai lần

D ùng lá k ín h đ ậy lên lưới đếm , sử dụng các ngón ta y đè p h ầ n lá k ín h ép c.hiặt

đếm đúng n h ư đ ã th iế t kế D ùng p ip e t P a ste u r lấy m ẫu đã p h a lo ãn g rồ i cho liên

m ép giữa lá k ín h và bề m ặ t k h o an g B, m ẫu sẽ tự k h u ếch tá n vào k h o ả n g tr ố m g giữa bề m ặ t k h o an g và lá k ín h l à i i th a o tác, cần chú ý t r á n h tạo n ê n các b ọ t kíhí tro n g lưới đếm và tr á n h làm rơi m ẫu xuống các r ã n h t r ê n buồng đếm

Sau 3-5 p h ú t, đ ặ t buồng đếm lê n k ín h h iể n vi ở độ p h ó n g đ ại *400 lần T itến

h à n h đếm số t ế b ào tro n g các ô t r ê n lưới đếm Đối với b u ồ n g đếm T hom a, ta <ỉế:m

tổ n g số t ế bào tro n g 10 ô vuông lớn (được ký h iệu dấu * t r ê n h ìn h 2.2) Đối V'ới buồng đếm M alasseze, ta đ ếm tổ n g số t ế bào tro n g 5 ô h ìn h chữ n h ậ t theo đưởing chéo của lưới đếm (được k ý h iệu dấu * tr ê n h ìn h 2.3) T heo quy ước, các t ế bào ruằ.m

tr ê n c ạn h b ê n p h ả i v à b ê n dưới của ô đếm th ì được xem là thuộc về ô đếm đíó Ngược lại, các t ế bào n ằ m tr ê n c ạ n h b ê n tr á i v à c ạ n h t r ê n của ô đ ếm th ì k h ô n g được xem là thuộc ô đếm T ổng số t ế bào đếm được tro n g 10 ô vuông lớn t r ẽ n buồng đếm T hom a hoặc tro n g 5 ô h ìn h chữ n h ậ t t r ê n buồng đếm M alassez n ẽ n

n ằm tro n g k h o ả n g từ 100 đ ến 250 t ế bào

PHƯƠNG PHÁP ĐINH LƯỢNG VI SINH VẬT 21

3 C á c h t ín h k ế t q u ả

Số t ế bào có tro n g 1 m l m ẫu ban đầu được tính th eo công thức:

N = A 1000.F

h.s

tro n g đó: A - sô t ế bào tru n g b ìn h tro n g m ột ô đếm

h - chiều cao của buồng đếm {mm)

1000 - hệ số chuyển đổi từ niỉĩi3 sang cm 3

F - h ệ số p h a loãng của m ẫu trước khi đếm

tro n g lm L m ẫu b an đầu là:

1 G iớ i t h iệ u c h u n g

Đây là phương p h á p đếm t ế bào trê n các v ết bôi đã được cố đ ịnh và nhuộm

m àu Phương p h á p n à y thư ờ ng được dùng để xác đ ịn h n ồ n g độ vi k h u ẩ n tro n g các quá trìn h lên m en sử dụng môi trư ờ ng lỏng Tương tự n h ư phương p h á p sử dụng buồng đếm , phương p h á p B reed chỉ có thể đếm được các t ế bào vi sin h v ậ t d ạn g riê n g lẻ

- T iến h à n h p h a loãng m ẫu chứa vi sinh v ật b ằ n g nước vô k h u ẩ n (nếu cần).

- Lắc t h ậ t đều m ẫu và dùng m icropipet lấy ch ín h xác 0 ,0 l m l m ẫu cho lên m ột

p h iến k ín h có kẻ ô với diện tíc h là lcm 2 Nếu k h ô n g có p h iế n k ín h kẻ sẵ n

ô, ta có th ể đ ặ t p h iến k ín h lên trê n m ột tờ giấy tr ắ n g kẻ ô

N = A 1000.F

= 25.105.A.F

tro n g đó: A - số t ế bào tro n g 1 ô vuông lớn

F - h ệ số p h a loãng của 'm ẫu trước khi đếm

B à i 8 PHƯƠNG PH ÁP B R E E D

- T h êm vào m ẫu t r ê n p h iế n k ín h m ộ t giọt dung dịch a g a r 0,03% vô trùng (n h iệ t độ dung dịch a g a r x ấp xỉ 50°C) D ùng que cấy vòn g vô trù n g trộ n th ậ t

n h a n h m ẫu và dung dịch a g a r tr ê n p h iến k ín h đ ể p h â n bố đều h ỗ n hợp trên

ô kẻ có d iệ n tíc h le m 2 n ói tr ê n , v ế t bôi được là m khô tro n g k h ô n g khí

- N hỏ tiế p lê n v ế t bôi v ài g iọ t cồn 96% và chờ tro n g th ờ i g ian 20-30 phút

- Cho v à i g iọ t th u ố c n h u ộ m lê n v ế t bôi (có t h ể sử d ụ n g dung dịch xanh

m eth y len ) Sau đó, rử a c ẩ n th ậ n tiê u b ả n tro n g ch ậu th ủ y tin h đựng nước

T h ay đổi nước rử a cho đ ến k h i n h ú n g tiê u b ả n vào nước rử a k h ô n g th ấ y nước rử a bị đổi m àu nữa

- S ấy khô tiê u b ả n tro n g k h ô n g khí

- Q uan s á t tiê u b ả n dưới k ín h h iể n vi (sử dụn g v ậ t k ín h dầu nếu cần),

- T rư ờ ng hợp sử d ụ n g lưới th ị kín h : g ắn vào th ị k ín h m ộ t lưới đếm có vẽ các

ô vuông có d iệ n tích b ằ n g nhau T iến h à n h đếm tổ n g số vi k h u ẩ n í t n h ấ t là tro n g 10 ô vuông của lưới đếm b ằ n g cách dịch chuyển d ần tiêu b ả n th eo đường chéo

- T rư ờ ng hợp k h ô n g cỏ lưới th ị kín h : tiế n h à n h đếm h ế t tổ n g sô" t ế bào vi

sin h v ậ t tro n g to à n bộ d iện tích của th ị trư ờ n g k ín h h iể n vi

Độ lệch chuẩn S x được tín h n h ư sau:

Với xác su ấ t là 95%, k h o ả n g tin cậy là:

tro n g đó: a = 0,05

- chỉ số S tu d e n t với b ậc tự do (n - 1)

PHƯƠNG PHÁP ĐINH LƯỢNG VI SINH VÁT

SỐ t ế bào có tro n g 1 m l m ẫu b an đầu là:

X - số t ế bào đếm được tro n g th ị trư ờ ng k ín h h iể n vi đã quan s á t

Sơ - d iện tíc h của th ị trư ờ n g k ín h h iển vi (ụ m 2)

108 - d iện tích v ế t bôi ( lc m 2 = 108p/?i2)

K - độ p h a lo ãn g m ẫu ban đầu

0,01 - th ế tíc h m ẫu đã sử dụng (m l)

Theo L ange v à cộng sự (1993), phương pháp B reed cho độ sai số tru n g bình là

8% Việc lây m ầu đặc trư n g và lắc đều m ẫu là m ột yêu tô quan trọ n g ả n h hưởng

quyết đ ịn h đ ế n độ sai sô' của k ế t quả thu được

X Á C ĐỊN H LƯỢNG CHAT KHÔ

1 G iớ i t h i ệ u c h u n g

T rong phương p h á p này, người ta sẽ th u n h ậ n sin h k hối (b io m a ss) từ m ẫu

chứa vi sin h v ậ t b ằ n g phương p h á p vi lọc hoặc ly tâm Đế làm trô i đi các c h ấ t hóa học còn b ám lại tr ê n bề m ặ t th à n h tế bào, tiế n h à n h rử a sin h k hối b ằ n g dung dịch nước muối sin h lý Sau cùng, sin h khối sẽ được đem sây đ ến khôi lượng không đổi

K ết quả sẽ được tín h to á n và biểu diễn dưới d ạn g số g c h ấ t khô sin h khôi có tro n g

1 lít m ẫu k h ả o sá t

Phương p h áp n à y được sử dụng đế theo dõi sự sinh trư ở ng của vi sinh v ật trong các quá trìn h lên m en ở cả quy mô phòng th í nghiệm lẫn quy mô sả n xuất Để định lượng vi sin h v ậ t tro n g thực phẩm , người ta không sử dụng phương p h á p nảy

T rong b ài th í n g h iệm này, ch ú n g ta sẽ địn h lượng n ấ m m en tro n g quá trìn h lên m en rượu

5- phễu rời 6- kẹp để gắn chặt phễu rời (5) voi mernbrane (4) và nắp đậy (3)

H ình 2.4 Hệ thống lọc chân không

2 C á c h th ự c h i ệ n

1- S ử d ụ n g phư ơn g p h á p vi lọc đ ể thu n h ậ n sin h khối

Đối với vi k h u ẩ n , người ta thư ờ ng sử dụn g m em b ran e có đường k ín h m ao

q uản 0,2ụm để tá c h t ế bào Còn đối với n ấ m m en và n ế m sợi, sử dụn g m em b ran e với đưdng k ín h m ao q u ản 0,45ụm Chọn m em b ran e được làm từ n h ữ n g v ậ t liệu ưa nước n h ư a c e ta te cellulose

Các bước thực h iện :

- T iến h à n h sấ y khô (nếu cần) và xác đ ịn h k h ố i lượng m em b ran e D ùng k ẹp

đ ặ t m em b ran e vào đún g vị tr í tro n g hệ th ố n g lọc c h â n k h ô n g

- Lắc t h ậ t đều m ẫu chứa vi sin h v ậ t D ùng p ip et vô k h u ẩ n , lấ y ch ín h xác m ộ t

th ể tích m ẫu cho vào p hễu (5) của hệ th ố n g lọc c h â n k h ô n g T h ể tíc h m ẫu cần lấy phụ thuộc vào n ồ n g độ t ế bào vi sin h v ậ t có tro n g m ẫu, th ư ờ n g dao động tro n g

k h o ản g 10-50m/

- Cho m áy bơm c h â n k h ó n g h o ạ t động B ìn h (1) sẽ chứa dịch lọc bao gồm các

c h ấ t h ò a ta n và các c h ấ t k h ô n g ta n có k ích thước nhỏ hơn đường k ín h mao q uản của m em b ran e Các t ế bào vi sin h v ậ t sẽ n ằ m lạ i tr ê n bề m ặ t m em b ran e

- Khi p h ầ n dịch lỏ n g tro n g phễu (5) đ ã di chuyển xuống h ế t vào b ìn h (1), cho

tiế p vào p hễu lO m l dung dịch nước muối sin h lý và tiế p tục lọc Sau cùng, cho th ê m 10m l nước vô k h u ẩ n vào p h ễu và chờ cho đ ế n k h i quá tr ìn h lọc k ế t thúc.

- T h áo k ẹ p (6), tá c h rời phễu (5) rồ i dù n g m ộ t chiếc k ẹ p nhỏ để lấy

m em b ran e có chứa vi sin h v ậ t tr ê n bề m ặ t r a khỏi p h ầ n n ắ p đ ậy (3)

- Đ ặ t m e m b ra n e vào m ộ t đĩa th ủ y tin h sạch rồi cho vào tủ sấy ở n h iệ t độ 105'c T iến h à n h sấy khô m em b ran e đến khôi lượng k h ô n g đ ổ i.’Xác đ ịn h lại khôi lượng của m em b ran e sau k h i sấy

2- Sử d ụ n g ph ư ơn g p h á p ly tă m đ ể th u nh ận sin h khối

- Lắc đều m ẫu chứa vi sin h v ậ t, d ù n g p ip et lấy c h ín h xác m ột lượng m ẫu cho

vào ố ng ly tâ m T h ể tíc h m ẫu cần lấ y phụ thuộc vào n ồ n g độ t ế bào vi sin h v ậ t có tro n g mẫu

- T iến h à n h ly tâ m m ẫu tro n g th ờ i g ian 15 p h ú t, sử d ụ n g tốc độ 2000xg đế tách n ấ m m en và 12000xg đế tác h vi k h u ẩ n

- Khi quá tr ìn h ly tâ m k ế t th ú c, bỏ p h ầ n dịch lỏng Cho vào ốn g ly tâm m ột

p h ầ n th ế tích dung dịch nước m uối sin h lý D ùng đũa th ủ y tin h đế huyền phù hóa

p h ầ n sin h k h ố i tro n g ống ly tâ m v à sử d ụng nước m uối sin h lý đế rử a đũa th ủ y tin h P h ầ n nước rử a cũng được cho luôn vào ống ly tâ m T iếp tục ly tâ m với tốc độ

đã chọn tro n g th ờ i g ian 15 phút

- L ặp lại th ao tá c tr ê n với nước vô k h u ẩ n

- Sau cùng, sử dụng cồn để h u y ền phù h ó a p h ầ n sin h khối tro n g ống ly tâm

và chuyến h ỗ n hợp n à y vào m ột đ ĩa th ủ y tin h sạch có k h ô i lượng đã b iết Đ ặ t đĩa

đ ịn h lại khối lượng đĩa th ủ y tin h sau k h i sấy

rrii - k h ố i lượng m em b ran e (hoặc đĩa th ủ y tin h ) b an đầu (g)

7712 - k h ố i lượng m em b ran e (hoặc đĩa th ủ y tin h ) có chứa vi sin h v ậ t sau

khi được sấy đ ến khối lượng k h ô n g đổi (g)

V - th ể tích m ẫu đã sử d ụ n g (ml)

1000 - h ệ số quy đổi k ế t quả cho 1 lít m ẫu p h â n tích

Theo L eclerc H và cộng sự (1994), phương p h á p n à y có độ sai số tru n g b ìn h

là 10% Sai số chủ yếu là ở quá tr ìn h rử a t ế bào tro n g dung dịch nước muối sin h lý

v à tro n g nước c ấ t vô k h u ẩn

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

B à i 1 0 ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT BANG p h ư ơ n g p h á p

ĐO MẬT ĐỘ QUANG

1 G iớ i t h i ệ u c h u n g

Phương p h á p đo m ậ t độ quang dựa tr ê n các đ ịn h lu ậ t về qu an g học Khi ta chiếu m ột chùm tia s á n g có cường độ đã b iế t qua m ẫu chứa vi sin h v ậ t, chùm tia

sá n g rời m ẫu sẽ có cường độ th a y đổi so với b an đầu

Theo đ ịn h lu ậ t B eer L am b ert, ta có:

L g L = k c l

I

tro n g đó: I 0 - cường độ tia sá n g trước khi qua m ẫu

I - cường độ tia sá n g sau khi qua m ẫu

K - h ệ sô’ h ấ p th u

L - chiều d à y của cuvet chứa m ẫu

Giá tr ị L g (IJ I) được gọi là độ h ấ p th u (absorbance) của m ẫu k h ảo sát Để đ ịn h lượng vi sin h v ậ t, người ta thư ờ ng đo độ h ấ p thu ở bước sóng 600 hoặc 620nm

Khi nuôi cấy m ột loài vi sin h v ậ t trê n m ột môi trường d in h dưỡng xác định, g iá

trị K có th ế được xem là kh ô n g th ay đối đ án g kế tro n g suốt quá trìn h nuôi cấy N ếu

ta cố định giá tr ị L (chiều dày của cuvet) th ì nồng độ t ế bào vi sin h v ậ t tro n g m ẫu sẽ

tỷ lệ th u ận với độ h ấ p th u của mẫu Thông thường, các n h à n g h iê n cứu chọn cuvet có

chiều dày từ ln im đếm lem B ằng cách lập đồ th ị đường ch u ẩn biểu diễn mối quian

hệ giữa độ h ấ p thu và nồng độ tế bào, hoặc mối quan hệ giữa độ hấp thu và h à m lượng c h ấ t khô của sin h khối, ta sẽ tín h được k ế t quả cho các m ẫu khảo sát

C ần lưu ý rằ n g môi quan hệ tu y ến tín h giữa độ h ấ p th u và n ồ n g độ t ế b à o tro n g m ẫu chỉ đ ú n g tro n g m ộ t giới h ạ n n h ấ t định N ếu giá tr ị độ h ấ p thu quá lớ n (vượt quá 0,8) th ì m ôi quan hệ trê n kh ô n g còn tu y ến tín h nữa N hư vậy, đối với

nh ữ n g m ẫu chứa vi sin h v ậ t có nồng độ quá cao, ta cần p h a lo ãn g m ẫu trước khi đo

so m àu, ta p h ả i xây dựng đồ th ị đường chuẩn cho mỗi loài vi sinh v ậ t với m ôi trư ờ ng nuôi câ’y xác định K hi th a y đổi th iế t bị so m àu, loài vi sin h v ậ t hoặc môi trư ờng nuôi câ’y, ta cần p h ả i x ây dựng lại đường chuẩn mới

T iến h à n h nuôi cấy vi sin h v ậ t trê n môi trư ờ n g đã chọn Sau n h ữ n g k h o ản g

th ờ i g ian xác đ ịn h , lắc đều rồi lấy mẫu canh trư ờ ng và ch ia m ẫu th à n h hai phần:

Phần ĩ: được đem xác đ ịn h độ h ấ p thu của m ẫu tr ê n m áy quang phổ so m àu

C họn bước só n g là 600/7/7?, hoặc 620/?/??, chiều dày của cuvet th ủ y tin h là 2/71/7? Lấy 5/7?/ m ẫu đem lọc qua m em b ran e với đường k ín h m ao q u ản là 0,45p/?? Sử dụng

p h ầ n dịch lọc để h iệu ch ỉn h giá trị độ hấp th u của m áy quang phổ so m àu về 0

h ấ p th u lớn hơn 0,8 th ì cần p h a loăng mẫu, sử dụng m ôi trư ờ n g vô trù n g (trường hợp m ẫu có m àu) hoặc nước c ấ t (trường hợp m ẫu k h ô n g m àu hoặc có m àu r ấ t n h ạ t)

đế p h a loãng

P hần 2: được đem xác đ ịn h nồng độ tế bào hoặc h à m lượng c h ấ t khô của tế

bào Để xác đ ịn h n ồ n g độ t ế bào, ta sử dụng phương p h á p đ ếm trự c tiế p dưới k ín h

h iể n vi Để xác đ ịn h lượng c h ấ t khô của tế bào, ta sử d ụng phương p h á p vi lọc hoặc

ly tâ m k ế t hợp với phương p h á p Sấy đến trọ n g lượng k h ô n g đổi (xem b ài 9)

Từ các số liệu thu được, tiế n h àn h xây dựng đồ thị:

c = f[A) hoặc X = gCA) tro n g đó: A - độ h ấ p th u của m ẫu chứa vi sinh v ậ t

X - lượng c h ấ t khô của tê bào trong m ẫu (gll)

Định lượng vi sinh v ậ t tron g mẫu khảo sát

- Lắc đều can h trư ờ n g vi sinh v ậ t, dùng p ip et P a ste u r để lấy m ẩu T iến h à n h

p h a loãng m ẫu (nếu cần)

- Lọc m ột p h ầ n m ẫu qua m em brane với đường k ín h m ao quản là 0,45p/7? Sử dụng phần dịch lọc để hiệu chỉnh giá trị độ h ấp thu của m áy quang phố so m àu về 0

- Cho vài m l m ẫu vào cuvet có chiều dày 2 m m và đo n g ay độ h ấ p thu của

m ẫu Nếu để lâu, h iệ n tượng k ế t lắn g vi sin h v ậ t có th ể xảy ra và làm ả n h hưởng

đ ế n giá trị độ h ấ p th u của m ẫu

3 T ín h k ế t q u ả

hoặc X = g-(A), ta sẽ suy ra được nồng độ tế bào hoặc h à m lượng c h ấ t khô t ế bào có

tro n g m ẫu đ a n g k h ảo sát

T rong trư ờ n g hợp k h ảo s á t động học quá tr ìn h sin h trư ở n g của vi sin h v ậ t, ta

có th ể sử d ụ n g giá trị độ h ấ p thu để vẽ đường cong sin h trư ở n g của vi sin h v ậ t theo

th ờ i gian

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

B à i 1 1 Đ ỊN H LƯỢNG VI SIN H VẬT BANG p h ư ơ n g p h á p

X G iớ i t h i ệ u c h u n g

B ản c h ấ t của phương p h á p n ày là cấy m ột th ể tích xác đ ịn h m ẫu hu y ền phù

vi sin h v ậ t lên m ôi trư ờ n g th ạ c h tro n g hộp p e tri Môi trư ờ n g được chọn có th à n h

p h ầ n cơ c h ấ t đặc trư n g và th íc h hợp cho loài vi sin h v ậ t c ần đ ịn h lượng p h á t triể n Sau m ột k h o ả n g th ờ i g ian nuôi cấy, tr ê n bề m ặ t th ạ c h sẽ x u ấ t h iệ n các k h u ẩ n lạc

và ta có th ể quan s á t được b ằ n g m ắ t thường N ếu loài vi sin h v ậ t là đơn bào, dạng riê n g lẽ th ì ta có th ể xem m ỗi k h u ẩ n lạc là k ế t quả của sự p h á t tr iể n từ m ộ t t ế bào Dựa vào sô k h u ẩ n lạc đếm được, th ể tích m ẫu đã cấy v à hệ số p h a loãng, ta có

th ể suy ra số k h u ẩ n lạc có tro n g 1 m ỉ m ẫu khảo s á t ban đầu.

C ần lưu ý là k h i các tê bào vi sin h v ậ t tồ n tạ i d ạ n g đôi, d ạ n g tứ, d ạ n g chuỗi hoặc d ạ n g k h ố i th ì m ỗi k h u ẩ n lạc sẽ có nguồn gốc từ n h iều t ế bào N goài ra, nếu nồng độ vi sin h v ậ t tro n g m ẫu cấy quá đậm đặc và kỹ th u ậ t gieo cấy k h ô n g tố t

cũng có th ể làm x u ấ t h iệ n các k h u ẩ n lạc có nguồn gốc từ n h ữ n g t ế bào k h á c n h au

Do đó, k ế t quả đ ịn h lượng b ằ n g phương p h áp này luôn được biểu d iễn dưới d ạ n g số

k h u ẩ n lạc có tro n g 1 m l m ẫu hoặc số k h u ẩ n lạc có tro n g 1 g m ẫu.

Ưu đ iểm của phương p h á p đ ịn h lượng vi sin h v ậ t th ô n g qua việc nuôi cấy

tr ê n m ôi trư ờ n g th ạ c h là t a chỉ đ ịn h lượng n h ữ n g t ế bào số n g có tro n g m ẫu k h ả o

s á t b a n đầu Đ ây là phương p h á p đ ịn h lượng vi sin h v ậ t ph ổ b iế n và được ứ n g

d ụng rộ n g r ã i h ơ n các phương p h á p k h ác Phương p h á p n à y th ư ờ n g được sử d ụ n g

đế th eo dõi sự s in h trư ở n g của vi sin h v ậ t tro n g các quá tr ìn h lê n m en cũ n g n h ư

để k iểm t r a các chỉ tiê u vi sin h của thự c phẩm Nhược đ iểm của phương p h á p n à y

l à 't h ờ i ^ ia n d à i và tố n k é m chi phí h ó a c h ấ t, n h â n công n h iề u h ơ n so với các phương p h á p k h ác

Để đ ịn h lượng vi k h u ẩ n , ví dụ n h ư tổ n g số vi k h u ẩ n h iếu k h í, người t a th ư ờ n g

sử dụng m ôi trường th ạ ch tryptone glucose (M l) Đế đ ịn h lượng tổ n g sô n â m m en , môi trư ờ n g phổ b iến n h ấ t là m ôi trường thạch n ấ m m en n ấ m sợi (Y east rnold agar

- M2) Để đ ịn h lượng n ấ m sợi, người ta thường sử dụng m ô i trư ờng th ạ ch d extro se

Sahou ra u d (M3).

2 C á c h th ự c h i ệ n

T ro n g b à i th í n g h iệm này, chúng ta sẽ đ ịn h lượng loài n ấ m m en b ia

Saccliarom yces cereưisiae b ằ n g phương p h áp nuôi cấy m ẫu tr ê n m ô i trư ờ n g th ạ ch nước n h a (M4).

C h u ẩ n b ị m ẫ u v à m ô i tr ư ờ n g th ạ c h

T iến h à n h p h a lo ãn g m ẫu (nếu cần) với các độ p ha lo ãn g k h á c nhau 10'1, 10‘2, 1CT3 n h ư sơ đồ h ìn h 2.5

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

C h u ẩ n bị m ôi trư ờ ng th ạ c h nước n h a để gieo cấy N ồng độ c h ấ t khô của dịch

n h a là 8°Pt H àm lượng th ạ c h cần bổ sung vào dịch n h a là 15g/L.

P h ư ơ n g p h á p cấy g ạ t (S p rea d pla te)

C h u ẩ n bị m ôi trư ờ n g th ạ c h nước n h a tro n g e rle n và h ấ p tiệ t trù n g Sau khi làm nguội môi trư ờ n g th ạ c h về n h iệ t độ 50°c, đố m ôi trư ờ n g th ạ c h vào hộp p e tri

vô k h u ẩ n (mỗi h ộp k h o ản g 20-30/?//) Các hộp được xếp tr ê n m ặ t p h ẳ n g n ằ m ng an g cho đ ến k h i th ạ c h nguội T iếp theo, người ta bao gói và lậ t úp các hộp p e tri lại rồi đem bảo q u ả n tro n g tủ ở n h iệ t độ phòng tro n g th ờ i g ian 2-3 n g ày để k iểm t r a độ

vô trù n g của môi trường

Ư ng với m ỗi độ pha loãng, lắc đều m ẫu và d ung p ip et vo trù n g lấy cn ín h xac

m ột lượng th ế tích m ẫu cho lê n bề m ặt th ạc h hộp p e tri T hế tích m ẫu lấy thường dao động từ 0,1-0,5;??/ Nếu th ể tích m ẫu quá nhỏ th ì sai số của phương p h áp sẽ gia

tă n g Tuy n h iê n , n ếu th ế tích m ẫu quá lớn, sau khi cấy bề m ặ t th ạ c h sẽ lâu khô và khó p h â n bố đều các t ế bào vi sin h v ậ t trê n bề m ặ t th ạ c h

Sau đó, d ù n g que cấy g ạ t vô trù n g để d àn đều m ẫu tr ê n bề m ặ t th ạ c h Đ ể vô trù n g que cấy g ạ t, ta n h ú n g que cấy vào dung dịch cồn 70° T iếp th eo , ta vẩy rá o và đưa que cấy g ạ t lê n ngọn lửa đèn cồn để làm ch áy đi p h ầ n cồn còn đọng lại tr ê n que N gay sau đó, ta có th ế sử dụng que cấy g ạ t để d à n đều m ẫu tr ê n bề m ặ t th ạc h

T iế p th eo , chờ cho bề m ặ t th ạc h khô, tiế n h à n h bao hộ p p e tri, lậ t úp hộ p và

đ ặ t chúng vào tủ ấm Nuôi cấy ở 30°c tro n g th ờ i g ian từ 2 n g à y đ ến 3 ngày

Đối với m ỗi độ p h a loãng, cần tiế n h à n h gieo cấy í t n h ấ t là tro n g 2 hộp p e tri

Sử dựng 1 p ip e t vô trù n g và 1 que cấy g ạ t cho m ỗi độ p h a loãng

P h ư ơ n g p h á p đ ổ h ộ p (P our p la te)

C h u ẩ n bị m ôi trư ờ ng th ạ c h trong các ống n g h iệm và h ấ p t iệ t trù n g Mỗi ống

n g h iệm chứa 25m ỉ môi trư ờ n g th ạch Trước k h i đem sử dụng, đ ặ t các ống n g h iệm

Sử dụng các hộp p e tri đã được vô k h u ẩ n trước, ứ n g với m ỗi độ pha loãng, dùng p ip et vô trù n g lấy c h ín h xác m ột th ể tích m ẫu cho vào hộp p e tri Thế’ tích

m ẫu có th ế dao động từ 0,1-1,Om/

Lắc đều p h ầ n môi trư ờ n g th ạch tro n g ống n g h iệm và đổ tiế p vào hộp petri Xoay hộp để m ẫu huyền phù vi sin h v ậ t và môi trường th ạ c h được tr ộ n đều với nhau.Chờ cho th ạ c h đông lạ i rồ i tiế n h à n h bao gói các hộp p e tri, l ậ t úp hộp rồi đ ặ t vào tủ ấm

L ư u ỷ : nếu m ẫu h u y ền phù vi sin h v ậ t b an đầu có n ồ n g độ t ế bào quá th ấ p ,

ta lấy m ộ t th ế tích m ẫu (10-200mZ) lọc qua m e m b ra n e vô k h u ẩ n , sử dụng

m em b ran e có đường k ín h lỗ m ao quản 0,2pm đôi với vi k h u ẩ n v à 0,45pm đôi với

n ấm m en v à n ấm sợi Sau đó, đ ặ t m em b ran e vào hộp p e tri v à đố 25m l môi trư ờ n g

th ạ c h (được h ó a lông ỏ' 45-50°C) lên m em b ran e Xoay h ộ p đ ể môi trư ờ n g th ạ c h phủ dều k h ắ p bề m ặ t m em b ran e v à bề m ặ t đ áy hộp p e tri Chò' th ạ c h đông, bao gói hộp

p e tri và lậ t úp lạ i rồ i đ ặ t vào tủ ấm

N uôi cấy tro n g tủ ấm

N h iệ t độ nuôi cấy là 3 0°c, th ờ i g ian nuôi là 48 giờ

- Nếu k h u ẩn lạc có đường k ín h quá nhỏ, ta có th ể sử dụng k ín h lúp để quan sát

- K h u ẩn lạc của m ộ t số giống vi k h u ẩ n (ví dụ n h ư g iố n g P roteus) có h iệ n

tượng mọc lan tr ê n k h ắ p bề m ặ t môi trư ờ n g th ạ c h tro n g h ộ p p e tri N ếu k h u ẩ n lạc mọc lan k h ô n g chiếm hơ n 50% d iện tích bề m ặ t hộp p e tri th ì v ẫ n được xem là m ộ t

k h u ẩ n lạc N ếu k h u ẩ n lạc ch iếm hơn 50% diện tích bề m ặ t hộp p e tri th ì g h i chú vào k ế t quả N hữ ng hộp n à y k h ô n g được sử dụng để tín h k ế t quả

Cách tín h k ế t qu ả

C họn t ấ t cả các hộp p e tri có từ 25 đ ến 250 k h u ẩ n lạc để tín h k ế t quả Số

k h u ẩn lạc đếm được tr ê n các hộp p e tri có độ p h a loãng k h á c n h a u c ầ n p h ải tu â n thủ theo m ộ t quy lu ậ t hợp lý: độ p h a loãng càn g cao th ì số k h u ẩ n lạc đ ếm được tr ê n hộp

P e tri p h ải càng ít N ếu k ế t quả k h ô n g hợp lý, cần thực h iệ n lạ i các th í nghiệm

T rư ờ ng hợ p 1: chỉ có 1 hộp p e tri có số k h u ẩ n lạc dao động tro n g k h o ả n g 25-

250 T ấ t cả các hộp p e tri còn lại có số k h u ẩ n lạc n ằ m n g o ài k h o ả n g trê n K hi đó,

ta chọn h ệ số p h a lo ãn g tư ơng ứng với h ộ p p e tri có số k h u ẩ n lạc n ằ m tro n g k h o ả n g 25-250 để tín h k ế t quả

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

C ông thức tín h :

2 d tro n g đó: N - số k h u ấ n lạc có trong 1 m l m ẫu huyền phù b a n đầu

d - h ệ sô" p h a loãng mẫu

C hú ỷ: cần làm trò n k ế t quả tính được, chĩ giữ lại 2 chữ sô có n ghĩa Biểu thị

k ế t quả dưới d ạ n g th ậ p p h â n giữa 1,0 và 9,9 n h â n với 10” (n là số mũ th ích hợp

N h ư vậy, ta chọn độ p h a loãng 10'1 để tín h k ế t quả Số k h u ẩ n lạc có tro n g

lm L m ẫu ban đầu là:

N = — = 300 = 3.102 k h u ẩ n lac/ m ỉ

2 1 0 '1

Trư ờ ng h ợ p 2: chỉ có 1 độ pha loãng với 2 hộp p e tri có sô" k h u ẩ n lạc dao động

từ 25 đ ế n 250 T ấ t cả các hộp p etri ở các độ p h a loãng k h á c đều có số k h u ẩn lạc

n ằm ngoài k h o ả n g trê n K hi đó, ta sẽ chọn độ pha lo ãn g nói tr ê n để tín h k ế t quả

Số k h u ẩ n lạc có tro n g 1 rnl m ẫu b an đầu là:

N = = 135.104 « 1,4.106 k h u ẩ n lạc/ m l

2.1CT4

T rư ờ ng hợ p 3: ở h a i độ p h a lo ãn g liê n tiế p , các hộp p e tri có số k h u ẩn lạc dao

động từ 25 đ ế n 250 Khi đó, ta p h ả i tín h k ế t quả cho từ n g độ p h a loãng

3.1 N ế u k ế t quả th u được ở hai độ p h a lo ãng liên tiếp c h ên h lệch nhau 2 lần hoặc nhỏ h ơ n , á p dụng công thức dưới đ ây để tín h k ế t quả cuối cùng:

- ở độ p h a loãng 10'2, số kh u ẩn lạc đếm được trê n h ai hộp p étri là 151 và 215

Suy ra số k h u ẩ n lạc có tro n g 1 m ỉ m ẫu b a n đầu là:

- ở độ p h a loãng 10'2, số kh u ẩn lạc đếm được trê n hai hộp p étri là 180 và 250

Suy ra số k h u ẩ n lạc có tro n g 1 m l m ẫu b a n đầu là:

T rư ờ ng hợp 4: t ấ t cả các hộp p etri đều có sò k h u ẩ n lạc n h ẻ hơn 25 Khi đó, ta

sẽ chọn hệ số pha loãng th ấ p n h ấ t để tín h k ết quả

Ví dụ : k ế t quả thí nghiệm nh ư sau:

Trường hợp 5: t ấ t cả các hộp petri đều có số k h u ẩ n lạc lớn hơn 250 Khi đó,

ta sẽ chọn hệ sô p h a loãng cao n h ấ t để tín h k ế t quả

Ví dụ : k ế t quả th í n ghiệm n h ư sau:

Hệ số pha loãng số khuẩn lạc đếm được

Trường hợp 6: k h ô n g có k h u ẩ n lạc nào mọc tr ê n t ấ t cả các hộp p etri K hi đó,

ta sẽ ghi k ế t quả là có ít hơn ( l x — ) khuẩn lac, tro n g đó d là hệ số p h a loãng th ấ p

B à i 1 2 Đ ỊN H LƯỢNG VI SIN H VẬ T BANG p h ư ơ n g p h á p

PH A LOÃNG TỚI H ẠN

1 G iớ i t h i ệ u c h u n g

Phương p h á p p h a lo ãn g tới h ạ n còn được gọi là phương p h á p sử dụng chỉ số

xác su â t cao n h ấ t (M ost probable n u m b er m ethod).

T rong phương p h á p này, người ta sử dụng h ệ số p h a lo ãn g liên tiế p cấp th ập

p h â n đề’ p h a loãng m ẫu huyền phù vi sin h v ậ t b an đầu (Ví dụ: hệ số p ha loãng

m ột lượng m ẫu n h ư n h a u vào 3, 5 hoặc 10 ống n g h iệm đã chứa sẵ n m ôi trư ờ ng vô trù n g th ích hợp cho sự p h á t tr iể n của loài vi sin h v ậ t cần đ ịn h lượng Đem ủ t ấ t cả các ống n g h iệm sau k h i cấy tro n g tủ ấm ở n h iệ t độ th íc h hợp Sau m ộ t k h o ản g thờ i gian xác địn h , tiế n h à n h đếm số ống n g h iệm có vi sin h v ậ t p h á t tr iể n tương ứng với m ỗi hệ số p h a loãng

Để n h ậ n b iế t có sự p h á t tr iể n của loài vi sin h v ậ t cần đ ịn h lượng tro n g ống ngh iệm h ay khô n g , người ta thư ờ ng dựa vào độ đục của can h trư ờ ng, sự sin h khí

các hệ số p h a lo ãn g k h ác nhau, sử dụng b ả n g M PN , ta sẽ suy ra được k ế t quả

T rong b ả n g M PN , k ế t quả được biểu d iễn dưới d ạ n g chỉ số xác su ấ t cao n h ấ t với mức giới h ạ n tr ê n và mức giới h ạ n dưới, độ tin cậy 95%

T heo lý th u y ế t, nếu tă n g số ống n g h iệm sử dụng cho m ỗi h ệ số p h a lo ãn g th ì

độ ch ín h xác của k ế t quả th u được sẽ càng tă n g Cụ th ể , phương p h á p sử dụng 10 ống n g h iệm cho m ỗi hệ số p h a loãng sẽ cho k ế t quả ch ín h xác hơn phương p h á p chỉ sử dụng 5 hoặc 3 ống n ghiệm Tuy n h iê n , v ấ n đề n à y sẽ làm gia tă n g chi phí hóa c h ấ t k h i k iểm n g h iệm

Ưu điểm của phương p h áp p h a loãng tớ i h ạ n là cho p h ép ch ú n g ta đ ịn h lượng

Dưới đây là m ộ t sô giả th u y ế t khi ch ú n g ta sử dụng phương p h á p p h a lo ãn g tới h ạn :

- T ế bào vi sin h v ậ t tồ n t ạ i d ạ n g riê n g lẻ, k h ô n g tồ n tạ i ở d ạ n g chùm hoặc

- Sodium lauryl su lp h ate được sử dụng để ức ch ế sự p h á t tr iể n của nhóm vi

k h u ẩ n G ram (+) và các vi k h u ẩn sin h bào tử

- Đế p h á t h iệ n k h ả n ă n g sin h k h í từ lactose của nhóm Coliform , người ta cho ống d u rh am vào b ên tro n g các ống nghiệm

- Đ iểm k h ác b iệ t giữa E coli và các vi k h u ẩ n thuộc nhóm Coliform là k hoảng 93-97% các ch ủ n g thuộc E coli có k h ả n ă n g sin h tổ n g hợp P-D-

glucuronidase E nzym e n à y sẽ xúc tác p h ả n ứng p h â n giải M UG tạo n ên sản

p h ẩm p h á t h u ỳ n h quang Để n h ậ n b iế t điều này , ta sẽ quan s á t các ống

n g h iệm chứa c an h trường dưới á n h đèn u v

M ôi trường d ịch th ể B rillia n t green bile (M6): môi trư ờ n g cộ chứa peptone (nguồn nitơ), lactose (nguồn carbohydrate), m ậ t bò và b rillia n t green

- M ậ t bò và b r illia n t g reen có tác dụng ức ch ế vi k h u ẩ n G ram (+)

- Đế p h á t h iệ n sự sin h khí của Coliform từ lactose, người ta sử dụng ống durham

- Để p h á t h iện sự sin h acid, người ta sử dụng c h ấ t chỉ th ị m àu Khi pH canh trường giảm xuống 4,0 th ì m àu xanh sáng của canh trường sẽ chuyển sang

- T iến h à n h p h a lo ãn g m ẫu với hệ số p h a loãng là 10°, 10'1, 10'2, 10'3

- Ú ng với m ỗi hệ số p h a loãng, lắc đều và cấy m ẫu vào ba ống nghiệm chứa môi trư ờ n g dịch th ể lauryl su lp h ate try p to se với MUG

- Đ ặt các ống n g h iệm vào tủ ấm và nuôi ỏ' 35°c

- Sau 48 giờ, đọc k ế t quả N hững ống n ghiệm dương tín h có canh trường bị

v ẩn đục hoặc x u ấ t h iệ n h iệ n tượng sin h khí

K iể m tr a C o lifo r m

- Các ống n g h iệ m chứa canh trư ờ ng lauryl su lp h ate try p to se cho k ê t quả dương tín h chưa chắc đ ã có chứa vi k h u ẩ n n hóm Coliform Để k h ẳ n g đ ịn h Coliform,

ta cần cấy chuyền và kiểm tr a sự sin h trư ở n g của vi k h u ẩ n tr ê n môi trường dịch

th ể b rillia n t g reen bile

- Ú n g với mỗi ống n g h iệm dương tín h chứa c a n h trư ờ n g dịch th ể lauryl

sulphate try p to se, tiế p tục cấy chuyền m ẫu vào m ộ t ông n g h iệm chứa m ôi trư ờ n g

Q uan sá t k ế t quả:

- N ếu ông n g h iệm chứa canh trư ờ n g dịch th ế b r illia n t g ree n bile có sin h khí

và chuyền sa n g m àu v à n g th ì k ế t quả là dương tín h Ta có th ể k h ẳ n g định

là có C oliíòrm tro n g canh trường

- Nếu cấy chuyền tr ê n m ôi trường dịch th ể b r illia n t g ree n bile cho k ế t quả âm

tín h th ì xem n h ư ống n g h iệm chứa canh trư ờ n g lau ry l su lp h ate k h ô n g có

chứa Coliíbrm

- Dựa vào k ế t quả số ống n g h iệm dương tín h , ứ ng với các hệ số p h a loãng, tr a

b ả n g M PN ta sẽ suy ra k ế t quả cuối cùng

K iể m tr a E c o li

trư ờ n g p h á t h u ỳ n h quang là dương tín h - có chứa vi k h u ẩ n E coli.

- Dựa vào k ế t quả số ống n g h iệm dương tín h với các h ệ số p h a loãng đã chọn,

tr a b ả n g M PN ta sẽ suy ra k ế t quả cuối cùng

Đ ọ c k ế t q u ả

B ảng 2.2 giới th iệ u b ả n g M PN tương đương với lượng m ẫu cấy là 0,1; 0,01 và

a) C họn ba hệ số p h a loãng liên tiếp đ ể tín h k ế t quả

dương tín h C họn tiế p h a i hệ số p h a lo ãn g cao hơn để tín h k ế t quả

dãy số 3-1-1 để t r a b ả n g M PN

PHƯƠNG PHÁP ĐINH LƯỢNG VI SINH l/ẬT

dương tín h N ếu tro n g th í n g h iệ m chỉ có m ột hệ số p h a lo ãn g cao hơn th ì ta sẽ

chọn ba h ệ số p h a loãng cao n h ấ t để tín h k ế t quả

ngh iệm đều cho k ế t quả dương tín h T a chỉ có 1 hệ số p h a lo ãn g cao hơn, tương ứng

và lữ '3 Từ đó, t a có dãy số 3-3-1 đ ể tr a b ả n g M PN.

dương tín h , t a chọn b a hệ số p h a loãng th ấ p n h â t có ống n g h iệm dương tín h đế

đương với dăy số 0-1-0 đ ể t r a b ả n g MPN

b) S a u k h i chọn xo n g d ã y số tương ứng với ba hệ số p h a loãng liên tiếp, sử

d ụ n g bảng M P N (b ản g 2.2) đ ể su y ra k ế t quả K ết quả được b iểu d iễn dưới d ạn g chỉ

số MPN/mZ m ẫu b an đầu

là chỉ số M PN t r a được tro n g b ản g 2.2

được tro n g b ả n g 2.2 cho 10 ta sẽ được k ế t quả cuổì cùng

B ả n g 2 2 B ả n g M P N (tương đương với lượng m ẫ u cấy là 0,1; 0,01 và 0,001g)

SỐ ống dương tính Khoảng tin cậy SỐ ống dương tính Khoảng tỉn cậy 0,1 0,01 0,001 MPN/g Thấp Cao 0,1 0,01 0,001 MPN/g Thấp Cao

-B à i 1 3 Đ ỊN H LƯỢNG VI S IN H V Ậ T -BANG PHƯƠNG PH Á P

X Á C Đ ỊN H H ÀM LƯỢNG A T P NỘI BÀO

có tro n g m ẫu

Để xác đ ịn h h à m lượng ATP nội bào, trước tiê n ta cần p h á vỡ th à n h t ế bào

để tríc h ly ATP H iệ n nay, người ta th ư ờ n g sử dụng n h ữ n g enzym e đặc hiệu để xúc tác p h ả n ứ ng p h â n hủy các đại p h â n tử th a m gia cấu tạ o n ê n th à n h t ế bào T iếp

theo, ta sẽ dựa vào p h ả n ứng p h á t q u an g sin h học {biolum inescence) giữa A TP v à

luciferin, sử dụng xúc tác là luciferase đ ể đ ịn h lượng ATP P h ả n ứng n à y được p h á t

h iệ n lầ n đầu tiê n bởi Mac Elroy T heo Leclerc H (1994), cơ c h ế p h ả n ứng p h á t quang sin h học ATP tro n g điều k iện in v itro gồm b a giai đoạn n h ư sau:

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT 39

- H o ạ t hóa: p h â n tử ATP và luciferin sẽ cùng tạ o phức với p h â n tử enzym e, sau đó ATP sẽ chuyển th ả n h AMP và giải phóng ra p y ro p h o sp h ate

H" + ATP

^ CO,

Luciferin

Luciferase (E) Mg" Í A M P - \ ^ C O , ) * P P '

T heo S tan ley (1989), phương p h áp này cho p h ép chúng ta đ ịn h lượng ATP với

bào !ml.

2 H ó a c h ấ t v à t h i ế t b ị

- Dung dịch luciferin (bảo quản ở -18°C)

- Dung dịch bioíax A l: được sử dụng để thực h iệ n quá tr ìn h tự p h â n t ế bào, giải p h óng ATP

- Dung dịch biofax A2: là dung dịch đệm

- Dung dịch A TP chuẩn: nồng độ 10Amol/l

- T h iế t bị đo cường độ á n h sán g

- T h iế t bị k h u ấy trộ n dung dịch trong ồng n g h iệm (V o rtex).

- ư n g với m ỗi độ p h a loãng, lấy 50p/ m ẫu cho vào ống n g h iệm đã chứa 2,5m l

dung dịch biofax A2 K huấy trộ n tr ê n m áy vortex tro n g th ờ i g ian 30 giây

- L ấy 200p/ h ỗ n hợ p tr ê n cho vào m ột ố ng n g h iệm k h ác T h êm vào lOp/ dung dịch luciferin và k h u ấ y trộ n tr ê n m áy v o rtex tro n g th ờ i g ian 30 giây

- Đọc k ế t quả cường độ á n h sá n g của m ẫu đo K ết quả đo được biểu d iễn dưới

d ạ n g đơn vị á n h sá n g tương đôi cR ela tive lig h unit) T iế n h à n h đọc ba lần,

m ỗi lầ n cách n h au 10 giây L ấy giá tr ị cao n h ấ t tro n g b a g iá tr ị đo được để tín h k ế t quả

- Thực h iệ n m ộ t m ẫu đốì chứng - th a y dung dịch ATP b ằ n g nước cất Cường

độ á n h sá n g của các m ẫu ATP ch u ẩn RLƯATP sẽ được tín h th eo công thức:

R L U atp = R L U atp — R L Ư H 20

tro n g đó:

- Từ các k ế t quả th u được, ta dựng đồ th ị đường ch u ẩn biểu d iễn m ối quan hệ

Xác đ ịn h h àm lượng ATP tổn g tro n g m ầu huyền p h ù vi sin h v ậ t

- Lắc đều m ẫu huyền phù vi sin h v ậ t v à dùng m icro p ip et lấy 50ụ/ m ẫu cho vào m ột ốn g n g h iệm đã chứa sẵ n 4 0 0p/ dung dịch biofax A I (dung dịch xúc tác quá trìn h tự p h ân ) K huấy trộ n h ỗn hợp t r ê n m áy v o rtex tro n g th ờ i g ian 30 giây

khuấy trộ n tiế p tr ê n m áy V ortex tro n g th ờ i g ian 30 giây

- L ấy 200]xl h ỗ n hợp tr ê n cho vào m ộ t ốn g n g h iệm k h ác T h êm tiế p vào lOp/

dung đich luciferin rồ i k h u ấy trộ n tr ê n m áy v o rtex tro n g th ờ i gian 30 giây

- Đọc k ế t quả cường độ á n h sá n g của m ẫu đo T iế n h à n h đọc ba lẩ n , mỗi lần cách nhau 10 giây L ấy giá tr ị cao n h ấ t tro n g b a giá tr ị đo được để tín h k ế t quả

- Thực h iệ n m ộ t m ẫu đôi chứng với nước c ấ t

- Cường độ á n h sá n g của m ẫu k h ảo s á t RLUtông sẽ là:

tro n g đó:

RLUtổng* - giá trị đo được của m ẫu khảo s á t trê n th iế t bị đo cường độ á n h sáng

X ác đ ịn h h àm lượng ATP ngoại b ào tron g m ẫu huyền p h ù vi sin h v ậ t

- L ắc đều m ẫu hu y ền phù vi sin h v ậ t và d ù n g m icro p ip et lấy 5 0 p / m ẫu cho

vào m ộ t ông n g h iệm đã chứa sẵ n 2,5m l dung dịch biofax A2 (dung dịch

đệm ) K huấy trộ n h ỗ n hợp tr ê n m áy v o rtex tro n g th ờ i gian 30 g iây